本发明属于生物检测
技术领域：
，涉及一种多种呼吸道病原菌的实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒。
背景技术：
：呼吸道感染是世界范围的常见病，也是全球范围内引起人群发病和死亡的最主要原因之一。主要是由呼吸道病毒及一些细菌，支原体，衣原体等引起。通常会引起婴幼儿，老人及免疫受损病人严重的上下呼吸道感染，导致哮喘，细支气管炎，肺炎等，而且极易引起流行或爆发，具有很高的发病率和死亡率。其临床表现相似，这给及时、准确地诊断呼吸道传染病，控制疫情带来很大的挑战。呼吸道感染分为上呼吸道感染与下呼吸道感染，其中有20％～30％的上呼吸道感染为细菌引起，可单纯发生或继发于病毒感染后发生，多见口腔定植菌溶血性链球。其次，为流感嗜血杆菌、肺炎链球菌和葡萄球菌等，偶见革兰氏阴性杆菌。急性下呼吸道感染：急性气管支气管炎、细支气管炎、肺炎，其中肺炎是5岁以下儿童死亡的最主要原因。世界卫生组织2013年发布最新的统计结果，世界十大死因中下呼吸道感染(5.9％)位列第三位(前两位为冠心病和中风)，位列第四位的慢性阻塞性肺病(5.4％)死亡也多和感染相关。肺炎作为全球传染性疾病最主要的死因之一，更是儿童死亡的第一病因。目前，我国呼吸道病原体的传统检测方法主要包括以下几种:(1)病原体检查：即直接做影像及活组织检查，或病原体分离培养，之后在显微镜、电镜下观察，做出诊断。优点是成本低。但存在如下缺点:1)耗时长，一般需3-5天或更长；2)诊断效率低，每次只能每个菌单独培养；3)假阴性结果高，由于抗生素的滥用，细菌在检测过程中生长受到抑制导致。(2)免疫学检查：应用最广泛的是酶联免疫技术(elisa)。一般先用一抗与抗原发生特异性结合，然后用通用的酶标记的二抗与一抗发生特异性结合，再将酶显色，之后观察结果。有通量高、敏感、快速等优点。但存在如下缺点:1)易出现假阳性2)灵敏度低3)无法检测多变异的病毒。(3)分子生物学——pcr检测方法：目前经常应用的有实时荧光定量pcr、免疫pcr、反转录pcr等，都是针对病原体的特异性靶基因进行检测。其中，荧光定量pcr检测方法最为成熟。荧光定量pcr技术的优点:灵敏性高，并可精确定。但目前尚不能解决同时快速检测出多种肺炎病原菌问题。技术实现要素：本发明的一个目的是提供一种多种呼吸道病原菌的实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒，其能够同时对九种呼吸道病原菌进行快速检测和筛查，且具有较高的灵敏度。本发明的第一个方面提供一种非疾病的诊断和治疗目的多种呼吸道病原菌的实时荧光定量pcr检测方法，包括将待测样本加入到含有pcr引物探针的pcr反应体系中进行实时荧光定量pcr反应的步骤，所述pcr引物探针包括分别针对肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、溶血性葡萄球菌及嗜肺军团菌的正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针；其中：针对所述肺炎克雷伯菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.1～3所示；针对所述铜绿假单胞菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.4～6所示；针对所述鲍曼不动杆菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.7～9所示；针对所述金黄色葡萄球菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.10～12所示；针对所述肺炎链球菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.13～15所示；针对所述流感嗜血杆菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.16～18所示；针对所述大肠杆菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.19～21所示；针对所述溶血性葡萄球菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.22～24所示；针对所述嗜肺军团菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.25～27所示。优选地，所述pcr引物探针还包括针对人dna内参的正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针，所述人dna内参的正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.28～30所示。采用人dna完整性的对照内参，确保在检测过程中对样品质量的判断，避免假阴性。优选地，各所述正向pcr扩增引物分别连接有荧光基团，不同病原菌对应的荧光基团不同。优选地，所述检测方法具体包括如下步骤：采集样本并提取核酸；及以提取的核酸为模板进行pcr反应并采集荧光；其中，pcr反应体系中含有核酸提取物、酶及所述pcr引物探针。更优选地，pcr反应的条件为：95℃1分钟；94℃5秒钟，60℃30秒钟并采集荧光，循环40次。本发明的第二个方面提供一种多种呼吸道病原菌的实时荧光定量pcr检测试剂盒，包括pcr引物探针，所述pcr引物探针包括分别针对肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、溶血性葡萄球菌及嗜肺军团菌的正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针；其中：针对所述肺炎克雷伯菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.1～3所示；针对所述铜绿假单胞菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.4～6所示；针对所述鲍曼不动杆菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.7～9所示；针对所述金黄色葡萄球菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.10～12所示；针对所述肺炎链球菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.13～15所示；针对所述流感嗜血杆菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.16～18所示；针对所述大肠杆菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.19～21所示；针对所述溶血性葡萄球菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.22～24所示；针对所述嗜肺军团菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.25～27所示。优选地，所述pcr引物探针还包括针对人dna内参的正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针，所述人dna内参的正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.28～30所示。采用人dna完整性的对照内参，确保在检测过程中对样品质量的判断，避免假阴性。优选地，各所述正向pcr扩增引物分别连接有荧光基团，不同病原菌对应的荧光基团不同。本发明的第三个方面提供一种多种呼吸道病原菌的实时荧光定量pcr检测试剂盒，包括pcr引物，所述pcr引物包括分别针对肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、溶血性葡萄球菌及嗜肺军团菌的正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物；其中：针对所述肺炎克雷伯菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物的序列分别如seqidno.1～2所示；针对所述铜绿假单胞菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物的序列分别如seqidno.4～5所示；针对所述鲍曼不动杆菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物的序列分别如seqidno.7～8所示；针对所述金黄色葡萄球菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物分别如seqidno.10～11所示；针对所述肺炎链球菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物的序列分别如seqidno.13～14所示；针对所述流感嗜血杆菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物的序列分别如seqidno.16～17所示；针对所述大肠杆菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物的序列分别如seqidno.19～20所示；针对所述溶血性葡萄球菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物的序列分别如seqidno.22～23所示；针对所述嗜肺军团菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物的序列分别如seqidno.25～26所示。本发明的第四个方面提供一种多种呼吸道病原菌的实时荧光定量pcr检测试剂盒，包括pcr探针，所述pcr引物探针包括分别针对肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、溶血性葡萄球菌及嗜肺军团菌的检测探针；其中：针对所述肺炎克雷伯菌的检测探针的序列如seqidno.3所示；针对所述铜绿假单胞菌的检测探针的序列如seqidno.6所示；针对所述鲍曼不动杆菌的检测探针的序列如seqidno.9所示；针对所述金黄色葡萄球菌的检测探针的序列如seqidno.12所示；针对所述肺炎链球菌的检测探针的序列如seqidno.15所示；针对所述流感嗜血杆菌的检测探针的序列如seqidno.18所示；针对所述大肠杆菌的检测探针的序列如seqidno.21所示；针对所述溶血性葡萄球菌的检测探针的序列如seqidno.24所示；针对所述嗜肺军团菌的检测探针的序列如seqidno.27所示。本发明采用以上方案，相比现有技术具有如下优点：本发明的检测方法及试剂盒，同时针对九种呼吸道病原体(铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、嗜肺军团菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆、溶血性葡萄球菌)进行检测，具有较高的灵敏度，检测敏感性高，特异性好，缩短了检测时间，提高了检测效率将为疾控中心、医院及其它医疗机构提供一种灵敏、准确、快速且低成本的多重基因检测方案。附图说明为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为管1的荧光定量pcr曲线图。图2为管2的荧光定量pcr曲线图。图3为管3的荧光定量pcr曲线图。具体实施方式下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域的技术人员理解。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。如本说明书和权利要求书中所示，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其他的步骤或元素。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的组合。本实施例提供一种多种呼吸道病原菌的实时荧光定量pcr检测试剂盒，用于同时检测肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、溶血性葡萄球菌及嗜肺军团菌九种呼吸道病原菌。该试剂盒包括pcr引物及pcr探针。pcr引物包括分别针对肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、溶血性葡萄球菌及嗜肺军团菌的正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物。pcr探针包括分别针对肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、溶血性葡萄球菌及嗜肺军团菌的检测探针。针对所述肺炎克雷伯菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.1～3所示；针对所述铜绿假单胞菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.4～6所示；针对所述鲍曼不动杆菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.7～9所示；针对所述金黄色葡萄球菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.10～12所示；针对所述肺炎链球菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.13～15所示；针对所述流感嗜血杆菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.16～18所示；针对所述大肠杆菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.19～21所示；针对所述溶血性葡萄球菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.22～24所示；针对所述嗜肺军团菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.25～27所示。pcr引物探针还包括针对人dna内参的正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针，所述人dna内参的正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.28～30所示。上述的针对九种病原菌及人dna内参的正、反向pcr扩增引物及检测探针的序列具体参见表1。表1上述的各正向扩增引物上连接有荧光标记基因。除此之外，该试剂盒还包括depc水、酶混合反应液和阳性对照品。本实施例还提供一种多种呼吸道病原菌的非疾病的诊断和治疗目的的实时荧光定量pcr检测方法，能够同时检测肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、溶血性葡萄球菌及嗜肺军团菌九种呼吸道病原菌。本实施例的检测方法的步骤具体实施如下。(1)采集样本并提取核酸：采集呼吸道感染患者的鼻咽拭子或痰液的分离培养物，从分离培养物中提取核酸。(2)以患者核酸为模板进行pcr反应：取核酸提取产物5μl,酶混液10μl，包含如表1所示的各引物和探针的pcr引物溶液5μl，混匀后加入到八连管上进行pcr反应，反应条件：95℃1分钟；94℃5秒钟，循环40次；60℃30秒钟并采集荧光，直至收取pcr产物。采用如表2所示的扩增程序。表2反应温度反应时间循环数95℃1min94℃5s4060℃30s检测实例将九种病原菌分三管检测，每管三种病原菌及人内参dna四重引物探针合管检测。每种病原菌灵敏度为10拷贝/μl。管1：肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌，按照1000拷贝/μl、100拷贝/μl、10拷贝/μl的浓度梯度分别对每种菌进行上述pcr检测，荧光检测结果具体如图1所示。管2：金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌，按照1000拷贝/μl、100拷贝/μl、10拷贝/μl的浓度梯度分别对每种菌进行上述pcr检测，荧光检测结果具体如图2所示。管3：大肠杆菌、溶血性葡萄球菌、嗜肺军团菌，按照1000拷贝/μl、100拷贝/μl、10拷贝/μl的浓度梯度分别对每种菌进行上述pcr检测，荧光检测结果具体如图3所示。由图1至图3可知，本实施例的检测方法及试剂盒的扩增效率好，使用拷贝数样本可达到10copy/ul，具有较高的灵敏度。上述检测方法及试剂盒引入了针对铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、嗜肺军团菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆、溶血性葡萄球菌，所设计的特异性扩增引物，可以同时针对九种呼吸道病原体进行检测，总时长不超过80分钟，既节约了生产成本和检测成本，又提高了检测效率及缩短了时间；人dna完整性的对照内参，确保在检验过程中对样品质量的判断，避免假阴性。上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，是一种优选的实施例，其目的在于熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限定本发明的保护范围。凡根据本发明的原理所作的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。序列表<110>江苏汇先医药技术有限公司<120>多种呼吸道病原菌的实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒<160>30<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cgttgaggtcaacaatgctgc21<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tgcacgaaacagtcttcattcag23<210>3<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ctgcagaaacactgtacgtcgtgttgc27<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ggtcgaaaggtggttgttatcc22<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5acccctccagcgtgctct18<210>6<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6cgttcggcgaaacaatccaggccat25<210>7<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7aagtatttaagtgggacgggcaa23<210>8<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8cggaatagcggaagctttcatag23<210>9<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9aaggctattcccagaatgggaaaaggacatga32<210>10<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10aactgagtatgatacatcgagccaag26<210>11<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11aaatgtctttttcaatgtttcaggtg26<210>12<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12acgatggatgggcgtattaaaccttgaagg30<210>13<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13tgcataggtctcagcattccaa22<210>14<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14tcatgcaggtaggacctgttga22<210>15<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15ccccaacgtcccaggcaccatt22<210>16<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16aacgtggtacaccagaatacaaca24<210>17<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17tcaccgtaagatactgtgcctaatt25<210>18<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18taggccaacgtcgtgcagatgca23<210>19<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19ggtgctcgccgcttaacg18<210>20<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20atcccatcgccaatcagca19<210>21<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>21accgccgctctgcgtgattctctta25<210>22<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>22tggtcgcttagtcggaacaatag23<210>23<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>23tcaagtgatgctttcgcaattgg23<210>24<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>24acattagcgatcgtcggtggcggta25<210>25<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>25caggatggacagaggctttacaat24<210>26<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>26aatgggtccgccaacgct18<210>27<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>27ttccttcaggtctcgcatatggtcca26<210>28<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>28ccatcacgccacagtttcc19<210>29<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>29actttggtatcgtggaaggactca24<210>30<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>30tgccatcactgccacccagaaga23当前第1页1 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技术特征：1.一种非疾病的诊断和治疗目的多种呼吸道病原菌的实时荧光定量pcr检测方法，包括将待测样本加入到含有pcr引物探针的pcr反应体系中进行实时荧光定量pcr反应的步骤，其特征在于，所述pcr引物探针包括分别针对肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、溶血性葡萄球菌及嗜肺军团菌的正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针；其中：针对所述肺炎克雷伯菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.1～3所示；针对所述铜绿假单胞菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.4～6所示；针对所述鲍曼不动杆菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.7～9所示；针对所述金黄色葡萄球菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.10～12所示；针对所述肺炎链球菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.13～15所示；针对所述流感嗜血杆菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.16～18所示；针对所述大肠杆菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.19～21所示；针对所述溶血性葡萄球菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.22～24所示；针对所述嗜肺军团菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.25～27所示。
2.根据权利要求1所述的实时荧光定量pcr检测方法，其特征在于：所述pcr引物探针还包括针对人dna内参的正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针，所述人dna内参的正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.28～30所示。
3.根据权利要求1或2所述的实时荧光定量pcr检测方法，其特征在于：各所述正向pcr扩增引物分别连接有荧光基团。
4.根据权利要求1所述的实时荧光定量pcr检测方法，其特征在于，所述检测方法具体包括如下步骤：
采集样本并提取核酸；及
以提取的核酸为模板进行pcr反应并采集荧光；
其中，pcr反应体系中含有核酸提取物、酶及所述pcr引物探针。
5.根据权利要求4所述的实时荧光定量pcr检测方法，其特征在于，pcr反应的条件为：95℃1分钟；94℃5秒钟，60℃30秒钟并采集荧光，循环40次。
6.一种多种呼吸道病原菌的实时荧光定量pcr检测试剂盒，包括pcr引物探针，其特征在于：所述pcr引物探针包括分别针对肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、溶血性葡萄球菌及嗜肺军团菌的正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针；其中：针对所述肺炎克雷伯菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.1～3所示；针对所述铜绿假单胞菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.4～6所示；针对所述鲍曼不动杆菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.7～9所示；针对所述金黄色葡萄球菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.10～12所示；针对所述肺炎链球菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.13～15所示；针对所述流感嗜血杆菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.16～18所示；针对所述大肠杆菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.19～21所示；针对所述溶血性葡萄球菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.22～24所示；针对所述嗜肺军团菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.25～27所示。
7.根据权利要求6所述的实时荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于：所述pcr引物探针还包括针对人dna内参的正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针，所述人dna内参的正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物及检测探针的序列分别如seqidno.28～30所示。
8.根据权利要求6所述的实时荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于；各所述正向pcr扩增引物分别连接有荧光基团。
9.一种多种呼吸道病原菌的实时荧光定量pcr检测试剂盒，包括pcr引物，其特征在于：所述pcr引物包括分别针对肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、溶血性葡萄球菌及嗜肺军团菌的正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物；其中：针对所述肺炎克雷伯菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物的序列分别如seqidno.1～2所示；针对所述铜绿假单胞菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物的序列分别如seqidno.4～5所示；针对所述鲍曼不动杆菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物的序列分别如seqidno.7～8所示；针对所述金黄色葡萄球菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物分别如seqidno.10～11所示；针对所述肺炎链球菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物的序列分别如seqidno.13～14所示；针对所述流感嗜血杆菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物的序列分别如seqidno.16～17所示；针对所述大肠杆菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物的序列分别如seqidno.19～20所示；针对所述溶血性葡萄球菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物的序列分别如seqidno.22～23所示；针对所述嗜肺军团菌的所述正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物的序列分别如seqidno.25～26所示。
10.一种多种呼吸道病原菌的实时荧光定量pcr检测试剂盒，包括pcr探针，其特征在于：所述pcr引物探针包括分别针对肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、溶血性葡萄球菌及嗜肺军团菌的检测探针；其中：针对所述肺炎克雷伯菌的检测探针的序列如seqidno.3所示；针对所述铜绿假单胞菌的检测探针的序列如seqidno.6所示；针对所述鲍曼不动杆菌的检测探针的序列如seqidno.9所示；针对所述金黄色葡萄球菌的检测探针的序列如seqidno.12所示；针对所述肺炎链球菌的检测探针的序列如seqidno.15所示；针对所述流感嗜血杆菌的检测探针的序列如seqidno.18所示；针对所述大肠杆菌的检测探针的序列如seqidno.21所示；针对所述溶血性葡萄球菌的检测探针的序列如seqidno.24所示；针对所述嗜肺军团菌的检测探针的序列如seqidno.27所示。
技术总结本发明公开了一种多种呼吸道病原菌的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒。该实时荧光定量PCR检测试剂盒包括PCR引物探针，PCR引物探针包括分别针对肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、溶血性葡萄球菌及嗜肺军团菌的正向PCR扩增引物、反向PCR扩增引物及检测探针；其序列分别如SEQ ID NO.1～27所示。本发明能够同时对九种呼吸道病原菌进行快速检测和筛查，且具有较高的灵敏度。
技术研发人员：颜菁;杨朝;刘佳苏
受保护的技术使用者：江苏汇先医药技术有限公司
技术研发日：2020.12.21
技术公布日：2021.03.12
