一种基于Sanger测序的结核分枝杆菌MLST分型检测用引物组及其应用的制作方法

专利2022-07-08 111

本发明属于微生物基因分型技术领域，具体涉及一种基于sanger测序的结核分枝杆菌mlst分型检测用引物组及其应用。

背景技术：

结核病是由结核分枝杆菌(m.tuberculosis)引起的一种传染病，具有发病人数多，传染性强的特点。目前国家已经出台多项政策积极开展对结核病的控制，其中包括对某些结核病治疗药物的免费发放等。但因为耐药结核病的存在，尤其是耐多药结核菌株的存在，致使疾病的控制与药物的治疗变得更为复杂。

从基因水平上对结核分枝杆菌进行分析和了解，通过分子流行病学手段对结核分枝杆菌进行分型，有助于对结核分枝杆菌进行溯源研究，对于不同地域的结核分枝杆菌耐药性进行总结和评价，指导用药。

目前用于分子分型研究的主要方法是限制性片段长度多态性(rflp)、多位点可变数目重复单元分析(vntr)、细菌多位点序列分型(mlst)等，其中mlst是针对7～11个保守的持家基因进行分析，可以从保守基因上代表基因组的变异，尤其是对结核分枝杆菌这种基因组上变异位点较少的菌株。然而目前还没有有效的针对结核分枝杆菌的mlst分型检测用引物组。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于sanger测序的结核分枝杆菌mlst分型检测用引物组及其应用，能够有效区分结核分枝杆菌mlst不同基因型。

本发明提供了一种基于sanger测序的结核分枝杆菌mlst分型检测用引物组，包括gyra基因扩增引物、rpob基因扩增引物、pks5基因扩增引物、rv2295基因扩增引物、mbtf基因扩增引物、leub基因扩增引物和embb基因扩增引物；

所述gyra基因扩增引物包括核苷酸序列如seqidno：1所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno：2所示的反向引物；

所述rpob基因扩增引物包括核苷酸序列如seqidno：3所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno：4所示的反向引物；

所述pks5基因扩增引物包括核苷酸序列如seqidno：5所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno：6所示的反向引物；

所述rv2295基因扩增引物包括核苷酸序列如seqidno：7所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno：8所示的反向引物；

所述mbtf基因扩增引物包括核苷酸序列如seqidno：9所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno：10所示的反向引物；

所述leub基因扩增引物包括核苷酸序列如seqidno：11所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno：12所示的反向引物；

所述embb基因扩增引物包括核苷酸序列如seqidno：13所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno：14所示的反向引物。

本发明提供了所述引物组在制备结核分枝杆菌mlst分型或溯源的试剂或试剂盒中的应用。

优选的，所述结核分枝杆菌mlst分型或溯源的方法，包括以下步骤：

1)提取待分型的菌体dna；

2)以菌体的dna为模板，用所述引物组中7对引物分别进行pcr扩增，得到7种pcr扩增产物；

3)将所述7种pcr扩增产物分别纯化后进行sanger测序，得到7个基因片段的测序结果；

4)将所述7个基因片段的测序结果与分型库进行比较，确定结核分枝杆菌mlst基因型。

优选的，所述pcr扩增的反应体系体积为20μl：5×pcr缓冲液4μl、10mmol/ldntp2μl、10μmol/l引物对0.4μl、1.25u/μlgxl聚合酶0.2μl、模板dna0.5μl、水13.5μl。

优选的，所述pcr扩增的反应条件为：95℃5min；95℃30sec，58℃40sec，72℃1min，35个循环；72℃10min。

本发明提供了一种基于sanger测序的结核分枝杆菌mlst分型检测用试剂盒，包括所述引物组。

优选的，还包括以下试剂：pcr扩增用缓冲液、dntp和gxl聚合酶。

本发明提供的基于sanger测序的结核分枝杆菌mlst分型检测用引物组，包括gyra基因扩增引物、rpob基因扩增引物、pks5基因扩增引物、rv2295基因扩增引物、mbtf基因扩增引物、leub基因扩增引物和embb基因扩增引物。实验表明，本发明以gyra基因片段、rpob基因片段、pks5基因片段、rv2295基因片段、mbtf基因片段、leub基因片段和embb基因片段串联构建mlst基因的系统发育树(nj)，能够把25个不同来源的结核分枝杆菌样本全部区分开；同时采用所述引物组对未知基因型的结核分枝杆菌进行pcr扩增，得到的各基因片段通过与建好的分型库进行比对，结果表明，所有检测样本均能够得到唯一的基因型和总的菌株st型。说明本发明提供的所述引物组能够准确实现结核分枝杆菌mlst分型的目的。因此，所述引物组能够用于结核分枝杆菌mlst分型与溯源中。

附图说明

图1为25个样本全基因组构建的系统发育树；

图2为用最终选择的7个基因mlst构建系统发育树；

图3为待检测样本的各基因pcr扩增电泳图。

具体实施方式

本发明提供了一种基于sanger测序的结核分枝杆菌mlst分型检测用引物组，包括gyra基因扩增引物、rpob基因扩增引物、pks5基因扩增引物、rv2295基因扩增引物、mbtf基因扩增引物、leub基因扩增引物和embb基因扩增引物；所述gyra基因扩增引物包括核苷酸序列如seqidno：1所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno：2所示的反向引物；所述rpob基因扩增引物包括核苷酸序列如seqidno：3所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno：4所示的反向引物；所述pks5基因扩增引物包括核苷酸序列如seqidno：5所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno：6所示的反向引物；所述rv2295基因扩增引物包括核苷酸序列如seqidno：7所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno：8所示的反向引物；所述mbtf基因扩增引物包括核苷酸序列如seqidno：9所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno：10所示的反向引物；所述leub基因扩增引物包括核苷酸序列如seqidno：11所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno：12所示的反向引物；所述embb基因扩增引物包括核苷酸序列如seqidno：13所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno：14所示的反向引物。本发明对所述引物组的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的引物组的制备方法即可，例如人工合成。在本发明实施例中，所述引物组委托金唯智生物科技有限公司合成得到。

本发明提供了所述引物组在制备结核分枝杆菌mlst分型或溯源的试剂或试剂盒中的应用。

在本发明中，所述试剂包括所述引物组中14条引物序列，所述14条引物序列优选独立分装。本发明对所述引物的形式不做具体限定，采用本领域所熟知的商品试剂的引物形式即可，例如以粉末形式存在更利于保存和运输。所述试剂盒包括含所述引物组形成的试剂外，还包括其他用于检测的试剂，例如pcr扩增用缓冲液、dntp和gxl聚合酶等。本发明对所述试剂的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的试剂种类即可。

在本发明中，所述结核分枝杆菌mlst分型或溯源的方法，优选包括以下步骤：1)提取待分型的菌体dna；

2)以菌体的dna为模板，用所述引物组中7对引物分别pcr扩增，得到7种pcr扩增产物；

3)将所述7种pcr扩增产物分别纯化后进行sanger测序，得到7个基因片段的测序结果；

4)将所述7个基因片段的测序结果与分型库进行比较，确定结核分枝杆菌mlst基因型。

本发明提取待分型的菌体dna。本发明对提取待分型的结核分枝杆菌菌株的dna的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的提取细菌的dna方法即可，例如ctab法或采用商品化细菌dna提取试剂盒均可。

得到菌体的dna后，本发明以菌体的dna为模板，用所述引物组中7对引物分别pcr扩增，得到7种pcr扩增产物。

在本发明中，所述pcr扩增的反应体系体积优选为20μl：5×pcr缓冲液4μl、10mmol/ldntp2μl、10μmol/l引物对0.4μl、1.25u/μlgxl聚合酶0.2μl、模板dna0.5μl、水13.5μl。所述pcr扩增的反应条件优选为：95℃5min；95℃30sec，58℃40sec，72℃1min，35个循环；72℃10min。

得到7种pcr扩增产物后，本发明将所述7种pcr扩增产物分别纯化后进行sanger测序，得到7个基因片段的测序结果。

在本发明中，所述pcr产物纯化采用dna纯化试剂盒即可，具体操作方法按照说明书进行，在此不做赘述。本发明对所述dna纯化试剂盒的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的dna纯化试剂盒即可。纯化后还优选包括回收。本发明对回收不做具体限定，采用本领域所熟知的回收方案即可，例如采用商品dna回收试剂盒即可。本发明对所述sanger测序的方法不做具体限定，采用本领域所熟知的sanger测序即可。在本发明实施例中，所述sanger测序委托金维智生物科技有限公司进行。测序结果与构建的分型库进行比对，得到样本的mlst基因型。所述分型库的网址为(https://org.modao.cc/app/1e054fdb5b9e2ae41066584112a19cc56a44f707？simulator_type＝device&sticky)。比对结果表明，所有样本都可以得到唯一的基因型及总的菌株st型。

本发明提供了一种基于sanger测序的结核分枝杆菌mlst分型检测用试剂盒，包括所述引物组。所述试剂盒优选还包括以下试剂：pcr扩增用缓冲液、dntp和gxl聚合酶。本发明对所述试剂盒的使用方法没有特殊限制作用，具体方法可参见上述内容即可，在此不做赘述。

下面结合实施例对本发明提供的基于sanger测序结核分枝杆菌mlst分型检测用引物组及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

靶标基因的确定

1.结核分枝杆菌溯源株信息获取

从ncbi的sra数据库，下载已经发表的结核分枝杆菌的原始数据。每个地区选择一套illumina数据，排除覆盖度低和匹配比例少的原始数据，最后一共选择了25株结核分枝杆菌的原始数据用于分析，样品菌株共来自于4个洲，16个国家，样品菌株的具体地点和sra号见表1。

表1.原始数据基本信息记录

2.snp位点比对

把下载的fastq文件上传到服务器，每个国家的结核分枝杆菌数据与h37rv的genome文件(nc_000962.fna)通过软件bowtie2进行比对，再通过samtools、bcftools等抽提出所有的snp位点。然后按照每个snp位点必须有10条以上的序列支持，并且snp的比率为100％的标准，筛选得到每个样本最终的snps结果。平均每个样本得到1189个snp位点。

3结核分枝杆菌系统发育树构建

将每个样本的snp串联并使用mega5软件构建系统发育树，得到25个样品的全基因组的系统发育树(nj)，具体见图1。

从结果来看，所有样本分成两枝，其中以来自中国的样本为主的东亚分枝中，还包含了爱沙尼亚，白俄罗斯、哈萨克斯坦和挪威等欧洲样本；而以非洲样本为主的另外一枝中，则包含一株中国、一株泰国，以及来自于美洲的美国、阿根廷等国家的样本。

通过对全基因组snp的比较分析，即统计每个基因中发生snp的数目，按snp数量从高到低排列，确定了30个具有snp位点较高的基因片段，仔细对比每个基因发现，虽然有些基因发生snp的频率很高，但25个样品在这些基因中发生的snp变化是一致的，所以使用高频snp的基因并不能很好得区分不同地区的样本。因此，重新对snp位点做了筛选，最后确定选择在同一个位点，有多种不同snp形式的位点，表2中列举了9个核心位点，分布于7个基因中。将这7个基因进行串联，使用mega5软件得到25个样品的mlst基因的系统发育树(nj)，具体见图2。可以看出，这7个基因能够把25个样本都区分开。

最终的mlst基因和位点见表2。

表2选择核心位点的snp分布

实施例2

1.检测材料

结核分枝杆菌jh-1菌株、jh-20菌株、jh-50菌株，其中jh-1菌株、jh-20菌株、jh-50菌株来源于口岸检出菌，分离自口岸实验室，分离时间分别是2017年，2018年和2017年；

结核分枝杆菌阳性参比质粒为pos-mt，是以结核分枝杆菌h37rv菌株7个基因序列连接到puc质粒上而成。

2.基于二代测序的试剂盒

引物：表4记载的引物组、阳性质粒，pcrmix，水。

3.分型基因

表3结核分枝杆菌分型管家基因

4.sanger测序分型引物

结核分枝杆菌mlst分型管家基因的扩增(测序)引物序列见表4。

表4sanger测序的7个管家基因的扩增(测序)引物

4.验证方法

4.1核酸提取

取收集的菌体，悬于400μlte溶液中灭活后，加入5mg/ml溶菌酶，37℃孵育2h，然后加入2mg/ml蛋白酶k及1％sds，50℃过夜，加入14μl冷5m醋酸钾溶液，慢慢混匀后置于冰上10min，离心，上清以等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混合，反复抽提，然后加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1，v/v)混匀，离心取上清，加3mnacl溶液和2倍体积无水乙醇或异丙醇沉淀酸，离心。沉淀以70％乙醇和无水乙醇洗涤，室温干燥，溶于te中，加1mg/mlrnasea，37℃孵育30min。

4.2基于sanger测序的分型方法

4.2.1pcr扩增

反应体系体积为20μl：5×pcr缓冲液4μl、dntp(10mmol/l)2μl、引物对(10μmol/l)0.4μl、gxl聚合酶(1.25u/μl)0.2μl、模板dna0.5μl、水13.5μl。

反应条件为：95℃5min；95℃30sec，58℃40sec，72℃1min，35个循环；72℃10min。

4.2.2产物纯化

将pcr产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，染色后紫外光下成像观察，条带单一且明亮的样品进行pcr产物纯化。pcr产物按照1:0.8加入已震荡混匀的ampurebeads，吹打混匀后室温静置5min，然后放入磁力架内约5min后溶液澄清，吸去上清后加入200ul80％乙醇，静置1min后吸出乙醇，重复一次乙醇漂洗的步骤，在乙醇漂洗的过程中不要从磁力架上取下管子，第二次需要完全去除残留的乙醇并且静置5min待残留乙醇完全挥发后再取下磁力架加入12μl水，吹打混匀静置5min后放回磁力架上，静置2min溶液澄清后吸取10μl上清，即回收的dna。

4.2.3测序及结果分析

回收的dna送测序公司进行测序，结果参照委托单位提供的分型库(网址https://org.modao.cc/app/1e054fdb5b9e2ae41066584112a19cc56a44f707？simulator_type＝device&sticky))进行比较，确定分型。

5.重复性及稳定性验证

上述同样实验重复三次，都可以实现检测。

试剂盒冻融三次，每次放置在室温24h后用于检测，可以顺利完成检测。

6.验证结果

pcr扩增电泳结果见图3。jh-1菌株中gyra基因扩增片段为seqidno：15，rpob基因扩增片段为seqidno：16，pks5基因扩增片段为seqidno：17，rv2295基因扩增片段为seqidno：18，mbtf基因扩增片段为seqidno：19，leub基因扩增片段为seqidno：20，embb基因扩增片段为seqidno：21。pos-mt菌株中gyra基因扩增片段为seqidno：22，rpob基因扩增片段为seqidno：23，pks5基因扩增片段为seqidno：24，rv2295基因扩增片段为seqidno：25，mbtf基因扩增片段为seqidno：26，leub基因扩增片段为seqidno：27，embb基因扩增片段为seqidno：28。jh-20-1菌株中gyra基因扩增片段为seqidno：29，rpob基因扩增片段为seqidno：30，pks5基因扩增片段为seqidno：31，rv2295基因扩增片段为seqidno：32，mbtf基因扩增片段为seqidno：33，leub基因扩增片段为seqidno：34，embb基因扩增片段为seqidno：35。jh-50-1菌株中gyra基因扩增片段为seqidno：36，rpob基因扩增片段为seqidno：37，pks5基因扩增片段为seqidno：38，rv2295基因扩增片段为seqidno：39，mbtf基因扩增片段为seqidno：40，leub基因扩增片段为seqidno：41，embb基因扩增片段为seqidno：42。

为了验证本发明扩增的片段与其他检测手段的检测结果一致性，将4个菌株的各基因片段与二代测序结果(二代测序mlst分型用引物组见表5)比对，并剪切成与二代序列的长度和位置一致的片段，将裁减后的片段上传到分型库后,比对结果如下表6。所有样本都可以得到唯一的基因型及总的菌株st型。溯源结果表明，分离株jh-1来自中国，jh-20来自南非，jh-50来自缅甸。

表5二代测序的7个管家基因的扩增(测序)引物

表6测序后比对结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>上海国际旅行卫生保健中心(上海海关口岸门诊部)

<120>一种基于sanger测序的结核分枝杆菌mlst分型检测用引物组及其应用

<160>56

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<210>2

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<210>3

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>17

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<210>18

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>19

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