本发明涉及植物生物
技术领域：
，具体涉及盐碱栽培条件下猴樟内参基因及其专用引物和应用。技术背景猴樟(cinnamomunbodinierilevl.)为樟科樟属常绿乔木，主要分布于我国南方地区，最早作为精油加工树种和林用树种进行研究和应用。樟属植物中香樟(c.camphora)很早就被作为优良的城市园林绿化树种进行研究和应用。通过一定的驯化措施,樟树已能经受住-14℃的短暂低温，樟树过江北移成为可能。但樟属植物在我国长江中下游地区及苏北地区的正常生长发育和产业化发展依然受盐碱土壤环境的影响，苗木栽植后通常表现为生长缓慢、叶片黄化、不能完全成活或存活1－2年开始死亡的现象。我们最近的研究初步认为部分猴樟表型比普通香樟具备更强的耐盐碱胁迫能力，进一步研究猴樟耐盐碱胁迫的分子机理，能为猴樟耐碱种质筛选提供依据。基因表达分析是了解植物复杂生物学过程、代谢途径及信号转导分子机理的重要途径。实时荧光定量pcr(realtimefluorescencequantitativepcr,qrt-pcr)是目前已知基因研究的常用实验手段，具有操作简单、高通量等优点。然而，在实验过程中目的基因表达结果的准确性会受到rna提取质量、逆转录效率等诸多因素的影响，为了得到更加准确可靠实验数据，需要一个或多个内参基因来进行校正和平衡。理想化的内参基因是一种在不同环境、不同个体或同一个体不同组织表达水平基本一致的看家基因(housekeepinggene)。常用的看家基因主要包括18s核糖体rna(18srrna)、25s核糖体rna(25srrna)等核糖体rna；肌动蛋白(actin)、微管蛋白(tubulinbeta,tub)等细胞骨架结构蛋白和泛素(ubiquitin,ubq)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glycer-aldehyde-3-phosphate,gapdh)、泛素结合酶(ubiqui-tinconjugatingenzyme,ubc)、翻译延长因子(transla-tionelongationfactor,tef)、转录延伸因子(elongationfactor1alpha,ef1α)等基本代谢所必需蛋白的编码基因。通常情况下不能保证看家基因在所有状态下都稳定表达，因此，为了保证定量pcr结果的可靠性，实验者需要根据不同试验材料、不同生长发育阶段或不同试验条件等因素筛选合适的内参基因。目前未见关于猴樟分子生物学研究，没有内参基因可以参考。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种盐碱栽培条件下猴樟基因表达谱中稳定表达的基因，以其作为猴樟响应盐碱胁迫分子机理研究的内参基因。本研究以前期研究筛选出的在盐碱栽培条件下叶色表现不同的猴樟(yyhz、hjhz、hdhz；yyhz、hjhz为耐盐碱表型，hdhz为不耐盐碱表型)叶片组织为材料，以肌动蛋白actin1(act1)基因、泛素ubiquitin(ubq)基因、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)基因、β微管蛋白基因(tub)基因为候选内参基因，通过3个内参基因稳定性分析软件：genorm，normfinder以及bestkeeper分析候选内参基因的荧光定量数据，筛选出盐碱栽培条件下在不同猴樟表型叶片器官中表达最为稳定的内参基因，为猴樟的分子生物学研究提供支持。本发明还提供了用于扩增所述的盐碱栽培条件下猴樟内参基因的实时荧光定量pcr专用引物及其应用。本发明技术解决方案：一种盐碱栽培条件下猴樟内参基因，所述盐碱栽培条件下猴樟内参基因是肌动蛋白actin1(act1)基因、泛素ubiquitin(ubq)基因、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)基因、β微管蛋白基因(tub)基因；所述肌动蛋白actin1(act1)基因的核苷酸序列如基因序列表no.1所示；所述泛素ubiquitin(ubq)基因的核苷酸序列如基因序列表no.2所示；所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)基因的核苷酸序列如基因序列表no.3所示；所述β微管蛋白基因(tub)基因的核苷酸序列如基因序列表no.4所示。本
发明内容还包括用于扩增如前所述的盐碱栽培条件下猴樟内参基因的实时荧光定量pcr专用引物，所述内参基因肌动蛋白actin1(act1)基因的引物序列是：f：5’-tagtatgccagcgaacgagt-3’；r：5’-tgccatctagctccctcttg-3’；所述内参基因泛素ubiquitin(ubq)基因的引物序列是：f：5’-cgaacagttccatcgccaat-3’；r：5’-gccttgaaaccaatccgtca-3’；所述内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)基因的引物序列是：f：5’-aaggctgtagggaaagtgct-3’；r：5’-actcctccttgattgcagct-3’；所述内参基因β微管蛋白基因(tub)基因的引物序列是：f：5’-accctaacacccttctccac-3’；r：5’-tcagtaccgttgattccgatc-3’；盐碱栽培条件下猴樟内参基因的筛选方法，所述筛选方法包括以下步骤：1)基于前期盐碱栽培条件下三个表型猴樟叶片所获得的rna-seq数据库，获得unigene的rpkm值，找到表达稳定的unigene作为候选内参基因；2)针对步骤1)找到的在盐碱栽培条件下表达稳定的候选内参基因，采用premier5.0软件设计并合成猴樟候选内参基因的实时荧光定量pcr检测引物，利用琼脂糖胶和凝胶成像系统观察pcr产物的条带，检测产物特异性；选择条带大小正确，条带特异性好，没有引物二聚体的引物；3)以盐碱环境栽培实验区(土壤ph值8.17，电导率1153μs/cm，含有机质13.85g/kg、有效钾15.94μg/g、有效铁12.07μg/g、铵态氮61.75μg/g、硝态氮266.75μg/g、有效磷36.55μg/g，可溶性盐含量15.89mg/g)中的三年生猴樟幼苗为植物材料，在同一时间采取同一树体高度枝条幼嫩叶片，使用液氮速冻，标记后保存在-80℃下；分别取100mg冻存组织样品，放于装有液氮的研钵中研磨成粉状，用rnaperppureplantkit(天根，北京)试剂盒提取材料的总rna，利用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测总rna的完整性，利用艾本德biophotometerd30核酸蛋白测定仪测定od260/280的值，检测总rna的纯度和浓度，保存在-80℃下；按照primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser(takara，大连)方法去除基因组dna后，用trprimemix(randomprimer)进行反转录反应。测定反转录后cdna的od260/280值，获得的cdna产物-20℃冻存或按试验要求倍数稀释后作为模板直接进行qpcr反应。4)将步骤3)获得的实时荧光定量pcr数据通过genorm软件、bestkeeper和normfinder软件进行候选内参基因的稳定性分析，最终筛选出最稳定表达的基因。优选地，本发明所采用的步骤3)中实时荧光定量pcr反应总体系为10μl，包含5μl的2×pcrmix(roche)，正向引物/反向引物各0.1μl，cdna模板1μl，灭菌蒸馏水3.8μl；所述实时荧光定量pcr反应程序是：95℃预变性10min，接下来94℃变性10s，60℃退火20s，60℃延伸20s，共40个循环；溶解曲线程序：95℃30s，60℃30s，逐渐加热至95℃，每0.1℃·s-1，设3个生物学重复。本发明的有益效果是：本发明公开了四个在盐碱栽培条件下猴樟基因表达谱中稳定表达的内参基因，同时给出利用猴樟内参基因为基础设计的实时荧光定量pcr引物及其应用，通过综合分析认为四个内参基因可在盐碱栽培环境下的不同表型猴樟叶片中稳定表达，所设计的荧光定量pcr引物适用于猴樟响应盐碱胁迫时的基因表达分析，有利于提高盐碱胁迫下猴樟基因表达分析研究的稳定性和可靠性。具体实施方式下面结合实施例来具体阐述本发明。实施例1：盐碱栽培条件下猴樟叶片实时荧光定量pcr内参基因的选择与应用基于课题组前期盐碱栽培环境下三个表型猴樟(yyhz：圆叶猴樟；hjhz：红茎猴樟；hdhz：红点猴樟)叶片转录组分析所获得的rna-seq数据库，获得72369条unigene的rpkm值，找到4个表达稳定的unigene作为候选内参基因(见表1)。表1rna-seq中代表各unigene表达水平的rpkm值针对以上找到的4个在盐碱栽培条件下表达稳定的候选内参基因，采用premier5.0软件设计并合成4个猴樟候选内参基因的实时荧光定量pcr检测引物，利用2.0％琼脂糖胶和凝胶成像系统(北京君意jy04s-3c)观察pcr产物的条带，检测产物特异性。选择条带大小正确，条带特异性好，没有引物二聚体的引物，筛选后得到的引物序列如表2所示：表2盐碱栽培条件下表达稳定的候选内参基因引物序列进行盐碱栽培条件下候选内参基因在三个表型猴樟叶片中的表达稳定性分析：以猴樟三年生幼苗为植物材料，栽植于盐碱试验小区内，小区内土壤ph值8.17，电导率1153μs/cm，含有机质13.85g/kg、有效钾15.94μg/g、有效铁12.07μg/g、铵态氮61.75μg/g、硝态氮266.75μg/g、有效磷36.55μg/g，可溶性盐含量15.89mg/g。每个表型设三个生物学重复，同一时间采取幼苗同一树体高度枝条顶部嫩叶，采后使用液氮速冻，标记后保存在-80℃下。分别取100mg冻存组织样品，放于装有液氮的研钵中研磨成粉状，用rnaperppureplantkit(天根，北京)试剂盒提取材料的总rna，利用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测总rna的完整性，利用艾本德biophotometerd30核酸蛋白测定仪测定od260/280的值，检测总rna的纯度和浓度，保存在-80℃下；按照primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser(takara，大连)方法去除基因组dna后，用trprimemix(randomprimer)进行反转录反应。测定反转录后cdna的od260/280值，获得的cdna产物按1、2、4、8、16倍稀释后作为模板直接进行qpcr反应。内参基因表达水平分析采用表2的引物组合。实时荧光定量pcr反应总体系为10μl，包含5μl的2×pcrmix(roche)，正向引物/反向引物各0.1μl，cdna模板1μl，灭菌蒸馏水3.8μl；所述实时荧光定量pcr反应程序是：95℃预变性10min，接下来94℃变性10s，60℃退火20s，60℃延伸20s，共40个循环；溶解曲线程序：95℃30s，60℃30s，逐渐加热至95℃，每0.1℃·s-1，设3个生物学重复。在pcr完成后，获得相应的阀值循环数，即ct值，具体列于表3。一般认为内参基因的ct值在20-25之间最好，从表3中可以看出act1和ubq基因表达ct值范围适宜，而gapdh和tub基因的表达ct值略超出适宜范围。表3不同表型猴樟候选内参基因的平均ct值bestkeeper软件分析：对荧光定量pcr反应后得到的ct值采用bestkeeper软件进行分析，直接输入获得每个内参基因在不同表型中获得的ct值，获得用来衡量基因稳定性的标准偏差(sd)和变异系数(cv)，最终确定稳定性较好的内参基因。标准偏差和变异系数越小，内参基因稳定性越好，反之，稳定性越差；当sd＜1时，说明该基因表达稳定，可以作为内参基因使用。分析结果列于表4，内参基因的稳定性依次为act1＞ubq＞gapdh＞tub，表达最稳定的是act1基因，最不稳定的为tub基因。表4bestkeeper软件分析结果序号基因名称基因定义sd值cv值1act1肌动蛋白0.10.522ubq泛素0.311.283gapdh甘油醛-3-磷酸脱氢酶0.341.954tubβ微管蛋白1.094.47genorm软件分析：genorm软件根据基因表达稳定度m值来衡量内参基因的稳定性和可靠性，软件默认的取舍值为1.5，高于1.5的基因不适合作为内参使用，m值越低表示基因越稳定。同时根据m值可以获得候选内参基因稳定性折线图，对内参基因的表达稳定度进行排序。分析结果列于表5，4个内参基因的m值均小于1.5，内参基因的稳定性依次为gapdh＞act1＞ubq＞tub。表5genorm软件分析结果序号基因名称基因定义稳定值1act1肌动蛋白0.8112ubq泛素0.9613gapdh甘油醛-3-磷酸脱氢酶0.7894tubβ微管蛋白1.427normfinder软件分析：normfinder软件的工作原理是通过获得组内和组间方差值来表示候选内参基因的表达稳定性，内参基因的稳定值(s)越小，表达稳定性越高，反之越低。分析结果列于表6，内参基因的稳定性依次为gapdh＞act1＞ubg＞tub。表6normfinder软件分析结果序号基因名称基因定义稳定值1act1肌动蛋白0.2802ubq泛素0.5733gapdh甘油醛-3-磷酸脱氢酶0.2044tubβ微管蛋白0.986候选内参基因的表达稳定性综合评价：综合考虑ct值、bestkeeper、genorm和normfinder软件的分析结果，内参基因的稳定性依次为act1＞ubq＞gapdh＞tub，鉴定出act1和ubq是猴樟盐碱栽培条件下最稳定的内参基因，可以应用于盐碱胁迫下猴樟基因的表达水平研究。以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求所界定的保护范围为准。序列表<110>宿迁学院<120>盐碱栽培条件下猴樟内参基因、引物及筛选方法<130>20201020<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>534<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1aatccgagcgcgattcctttccttctcctcctctctcgttgccctagattttctgcagaa60tcactcgtctttcgctctcctcattccacctctcctcatcagatcctcaaaaagatggcc120aatgcagcgtcagggatggctgtgaatgatgaatgtaagctcaagttcttagagctgaag180gcaaagagaacttatcgtttcattgttttcaagatagatgagacgcttaagcaggtgatt240gtagataagcttggggagcccacgcaaagctatgaggatttcacagctagtatgccagcg300aacgagtgtcgatatgctatctatgattttgactttgtaactgtagagaattgccaaaaa360agcaagattttcttcattgcttggtctccggatacggcgaaggtgaggagtaagatgctt420tatgcaagctccaaggatagattcaagagggagctagatggcatccaggtagagctgcag480gcaactgatcctacagaaatgggtcttgacgttatcagaagccgtgccaattga534<210>2<211>519<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tctgcatctgtgatggcaacatccacccaaggaagcctcctccttcacaagcagctcaaa60gatctcactaaaaatcccgtggatgggttctcagctgggcttgttgatgattcgaacatc120ttcgaatggagtgtcaccatcatcggaccgcccgatacgctgtatgatgggggttatttt180aatgccatcatgaccttccctgcaaattacccaaacagtcctccgacggtgaggttcata240tcagaaatgtggcatcctaatgtttatcctgatgggcgtgtttgcatatcaattcttcat300gctcctggggaagaccctaatgggtatgagcttgctagtgagcgttggacaccggtccat360acggttgaaagtattgttttgagcataatttccatgctttcaagtcctaatgatgaatcg420cctgcaaatgttgaagctgcaaaagaatggagagaccgaagggacgagttcaaaaagaaa480gtaagtcgatgtgtcagacgttcacaagagatgctttga519<210>3<211>1131<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gccctaaaacctttggtttctcttcgttctgctattttttctcatctctggtctgatttc60ctgttctgccgttcgctttctctcgtgtttgtcaagctgtctctcttgaaggccatgggt120gggaagatcaagataggaatcaacggttttggaaggatcggacgcttggttgcaagagtc180gctctgacgagagatgatattgagcttgtagctgttaacgatcccttcattgcccctgat240tacatgacatatatgtttaagtatgatagtgtccatgggcattggaagcaccatgatatc300aaggtgaaggactctaacacccttctttttggggagaaaccagttactgtctttggtttc360aggaacccagaagagatcccctggggtgagactggtgctgagtatgtagttgagtcaact420ggagtcttcactgataaagaaaaggctgctgcacatcttaagggtggtgctaagaaagtt480gtcatttctgctcctagcaaagatgctcccatgtttgttgtgggtgtcaacgagaaggaa540tacaagcctgacattgacattgtatcaaatgctagctgcacgaccaattgtcttgctcca600ttggccaaggtgatcaatgataggttcggcattgttgagggtttgatgaccacagtccac660tctattaccgccacacagaaaactgttgatgggccatccagcaaggactggagaggtgga720agagcagctggcttcaacatcattcctagcagtactggtgctgccaaggctgtagggaaa780gtgctgcctgcattaaatgggaaacttacaggaatggctttccgtgttcccacggtggat840gtgtcagtggtggatctcaccgtgagacttgagaagggggccacttatgatgtgatcaaa900gctgcaatcaaggaggagtctgagggcaagctgaaaggaatcttgggctacacagaggac960gatgtggtttctactgactttgtgggtgacagcaggtcaagcatatttgatgccaaggca1020ggaattgcactcaatgagcactttgtcaagcttgtcgcttggtacgacaacgagtggggc1080tacagctctcgtgtcattgacctgatccttcacatggcatccgcttgttag1131<210>4<211>1428<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4cggttttccgtccaattcctccatcttcaaaagcggttttccgtcctattccacatcaat60agaagcggttttccgtccgattctggagaaatgcgagagatccttcacatacagggaggc120caatgcggcaaccagatcggagccaagttctgggaggtgatctgcgacgagcacggcatc180gaccacaccggaaaatacaacggcgattccgacctccagctcgagcggatcaatgtctac240tacaacgaggccacaggcggccgctacgtcccccgcgccgtcctcatggatctcgagcct300ggcaccatggactccctcagatcaggcccctttggccagatcttccggccggataacttc360gtcttcggccagtccggcgccggaaacaactgggcaaaagggcactacacggagggagcg420gaattgatcgattctgttcttgatgttgttcgcaaggaggcggagaattgcgattgcttg480caaggattccaagtgtgtcattcattgggtggaggcactggatctggcatgggcaccctt540ctcatctccaagatcagggaggagtaccctgatcgtatgatgctcacattctctgttttc600ccgtcgccgaaggtatctgatactgttgtggagccatacaatgccaccctttctgttcat660cagcttgttgagaatgcagatgaatgtatggttctagacaatgaggctctctatgacatc720tgcttccgcacgcttaagctcgccacccctacctttggcgatcttaatcacctaatctct780gccaccatgagtggcgtcacatgctgcctccgcttccctggtcagctcaactcagatctg840cgtaagcttgcagtgaacctgatcccattccctcgtctccacttcttcatggtgggattt900gcgccgctgacgtcgagaggctcccaacagtatcgtgctctcactgtccctgagctgact960cagcagatgtgggatgccaagaacatgatgtgcgctgcagatcctagacatggccggtac1020ctgaccgcttcagccatgttccgtgggaaaatgagcaccaaagaagtcgatgaacaaatg1080atcaatgttcagaacaagaactcttcctactttgttgaatggattcctaacaatgtcaag1140tccagcgtctgtgacatccccccaaagggtctgaagatggcatccacgtttattggaaac1200tccacctcaattcaggagatgttccggcgtgtcagcgagcagttcacagccatgttccgg1260aggaaggctttcttgcattggtatactggggagggtatggacgagatggaattcacagag1320gctgagagtaacatgaatgatttggtggcagaatatcagcagtaccaggatgcgactgca1380gatgatgaagagtatgaggaggaagaggaggaagaggagggcgcttga1428当前第1页1 2 3
技术特征：1.盐碱栽培条件下猴樟内参基因，其特征在于，所述内参基因为以肌动蛋白actin1(act1)基因、泛素ubiquitin(ubq)基因、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)基因、β微管蛋白基因(tub)中的一个或多个，所述以肌动蛋白actin1(act1)基因序列为no.1，泛素ubiquitin(ubq)基因序列为no.2，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)基因序列为no.3，β微管蛋白基因(tub)基因序列为no.4。
2.盐碱栽培条件下猴樟内参基因引物，其特征在于，内参基因肌动蛋白actin1(act1)基因的引物序列是
f：5’-tagtatgccagcgaacgagt-3’，
r：5’-tgccatctagctccctcttg-3’；
内参基因泛素ubiquitin(ubq)基因的引物序列是：
f：5’-cgaacagttccatcgccaat-3’，
r：5’-gccttgaaaccaatccgtca-3’；
内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)基因的引物序列是
f：5’-aaggctgtagggaaagtgct-3’，
r：5’-actcctccttgattgcagct-3’；
内参基因β微管蛋白基因(tub)基因的引物序列是：
f：5’-accctaacacccttctccac-3’，
r：5’-tcagtaccgttgattccgatc-3’。
3.盐碱栽培条件下猴樟内参基因的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)基于前期盐碱栽培条件下三个表型猴樟叶片所获得的rna-seq数据库，获得unigene的rpkm值，找到表达稳定的unigene作为候选内参基因内参基因；
2)针对步骤1)找到的在盐碱栽培条件下表达稳定的候选内参基因，采用premier5.0软件设计并合成猴樟候选内参基因的实时荧光定量pcr检测引物，利用琼脂糖胶和凝胶成像系统观察pcr产物的条带，检测产物特异性；选择条带大小正确，条带特异性好，没有引物二聚体的引物；
3)以盐碱环境栽培实验区中的三年生猴樟幼苗为植物材料，在同一时间采取同一树体高度枝条幼嫩叶片，使用液氮速冻，标记后保存在-80℃下；
分别取100mg冻存组织样品，放于装有液氮的研钵中研磨成粉状，用rnaperppureplantkit试剂盒提取材料的总rna，利用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测总rna的完整性，利用艾本德biophotometerd30核酸蛋白测定仪测定od260/280的值，检测总rna的纯度和浓度，保存在-80℃下；
按照primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser方法去除基因组dna后，用trprimemix进行反转录反应；
测定反转录后cdna的od260/280值，获得的cdna产物-20°c冻存或按试验要求倍数稀释后作为模板直接进行qpcr反应；
4)将步骤3)获得的实时荧光定量pcr数据通过genorm软件、bestkeeper和normfinder软件进行候选内参基因的稳定性分析，最终筛选出最稳定表达的基因。
4.根据权利要求3所述的盐碱栽培条件下猴樟内参基因的筛选方法，其特征在于，所述步骤3)中实时荧光定量pcr反应总体系为10μl，包含5μl的2×pcrmix(roche)，正向引物/反向引物各0.1μl，cdna模板1μl，灭菌蒸馏水3.8μl；
所述实时荧光定量pcr反应程序是：95℃预变性10min，接下来94℃变性10s，60℃退火20s，60℃延伸20s，共40个循环；溶解曲线程序：95℃30s，60℃30s，逐渐加热至95℃，每0.1℃•s-1，设3个生物学重复。
5.根据权利要求3所述的盐碱栽培条件下猴樟内参基因的筛选方法，其特征在于，所述步骤1）中的候选内参基因为权利要求1中的两种或两种以上。
6.根据权利要求3所述的盐碱栽培条件下猴樟内参基因的筛选方法，其特征在于，所述步骤2）所述引物为权利要求2中的两种或两种以上。
技术总结本发明公开了一种盐碱栽培条件下猴樟内参基因、引物及筛选方法，提供四个内参基因及对应的引物，以及通过引物从候选内参基因中确定最稳定的内参基因的方法，通过该基因、引物及筛选方法，可以综合分析认为四个内参基因可在盐碱栽培环境下的不同表型猴樟叶片中稳定表达，所设计的荧光定量PCR引物适用于猴樟响应盐碱胁迫时的基因表达分析，有利于提高盐碱胁迫下猴樟基因表达分析研究的稳定性和可靠性。
技术研发人员：韩浩章;李素华;张丽华;王芳;王晓立;张颖
受保护的技术使用者：宿迁学院
技术研发日：2020.11.30
技术公布日：2021.03.12
