本发明涉及一种与玉米耐盐碱相关的分子标记及其应用，特别涉及一种基于转录因子基因zmnac89开发的与玉米耐盐碱相关的分子标记及其在玉米种质资源耐盐碱性筛选中的应用。本发明属于作物育种
技术领域：
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背景技术：
：盐碱胁迫是影响玉米生长发育的重要非生物逆境因子之一，严重影响产量。挖掘耐盐碱相关基因和优异种质资源，对于培育耐盐碱玉米品种至关重要。目前已发现的耐盐碱相关基因主要包括脯氨酸合成相关基因、甜菜碱合成相关基因、糖醇合成相关基因、保护酶相关基因、lea基因以及转录因子等类型。其中转录因子基因处于信号响应的上游，受到广泛重视。nac是参与植物响应盐胁迫调控的重要的转录因子之一，相关报道主要集中在拟南芥和水稻等模式植物中，其作用方式包括两种类型，一是正向调控，即提高植物的耐盐碱性，如拟南芥中的atnac019基因、水稻中的osnac063、osnac01基因等；另一种是负调控，即降低植物的耐盐碱性，如毛白杨中的penac045基因、中间锦鸡儿中的cinac071基因、苹果中的mdnac029基因等。下游作用的靶基因包括zfhd1-tfs、ap2-tfs与aba生物合成基因等功能基因。在玉米中盐碱胁迫相关的nac转录因子相关报道不多。本发明发明人所在课题组前期克隆了受盐碱胁迫诱导表达的nac转录因子基因zmnac89并进行了专利申请，申请号为201910913751.5，该基因全长2280bp，转录起始于5534bp，终止于3255bp，具有典型的加尾信号。包含两个内含子，三个外显子。将该基因的全长cdna构建过表达载体转到拟南芥和玉米中，部分转基因后代株系在萌发期和苗期提高了对nacl和na2co3的耐受能力。为进一步证实zmnac89基因的功能，有必要在不同的玉米自交系中分析其编码区及启动子的序列变异，与自交系的耐盐碱性进行关联分析，挖掘关联位点进而开发分子标记用于标记辅助选择，为分子育种提供材料和技术支持。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种基于转录因子基因zmnac89开发的与玉米耐盐碱相关的分子标记及其应用。为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：本发明的一种基于转录因子基因zmnac89开发的与玉米耐盐碱性相关的dcaps分子标记，命名为dndcaps767，所述的分子标记是使用dcaps引物对，以玉米基因组为模板通过pcr扩增后得到，其中含有snp位点，敏感材料为c，不能被tsei限制性内切酶切开；耐盐碱材料为g，能被tsei酶切为两个片段，所述的dcaps引物对的序列如下所示：上游引物：5’cgaacgaatcagatgaaagcgg3’；下游引物：5’gacaagcccatccacgacg3’。进一步的，本发明还提出了一种基于snp位点开发与玉米耐盐碱相关的dcaps分子标记的方法，以含有zmnac89基因编码区snp位点的核苷酸序列为基础序列，设计dcaps引物对，以玉米总dna为模板进行pcr扩增，使snp位点有效的转化为dcaps标记；所述的dcaps引物对的序列如下所示：上游引物：5’cgaacgaatcagatgaaagcgg3’；下游引物：5’gacaagcccatccacgacg3’。获得所述的基于转录因子基因zmnac89开发的与玉米耐盐碱相关的dcaps分子标记的引物对也在本发明的保护范围之内，所述的引物对序列如下所示：上游引物：5’cgaacgaatcagatgaaagcgg3’；下游引物：5’gacaagcccatccacgacg3’。更进一步的，本发明还提出了所述的基于转录因子基因zmnac89开发的与玉米耐盐碱相关的dcaps分子标记在玉米耐盐碱性分子标记辅助育种中的用途。以及所述的引物对在玉米耐盐碱性分子标记辅助育种中的用途。相较于现有技术，本发明的有益效果是：本发明通过在不同的玉米自交系中分析受盐碱胁迫诱导表达的nac转录因子基因zmnac89编码区及启动子的序列变异，与自交系的耐盐碱性进行关联分析，挖掘关联位点进而开发出了分子标记dndcaps767用于标记辅助选择，在盐碱敏感的自交系的鉴别中检测效率平均是88.4％，本发明的提出为筛选耐盐碱玉米材料提供了新的技术手段。附图说明图1为标记dndcaps253的基因型检测；其中：1-3为酶切前pcr片段；4-6为酶切后的片段；图2为标记dndcaps767的基因型检测；其中：1-3为酶切前pcr片段；4-6为酶切后的片段。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随具体实施例的描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1.玉米转录因子基因zmnac89的序列变异分析依据maizegdb数据库(https://www.maizegdb.org/)提供玉米b73基因组中的zmnac89基因序列，分段设计引物，从140份玉米自交系中扩增该基因序列和启动子序列。zmnac89基因引物为89-1f/r与89-2f/r，启动子引物89-p-f/r，其引物序列如表1。表1zmnac89基因序列及启动子序列克隆引物测序结果采用dnaman软件拼接成一条完整序列，并进行多序列的比对，使用dnaspv6.0软件对zmnac89基因序列进行分析，基于snp位点的不同并将其划分成不同单体型，同时利用tajima'sd、fuandli'sd*与fuandli'sf*等三种方法进行中性测验初步确定优异单体型。1.zmnac89基因单体型分析在参试玉米自交系的zmnac89基因编码区共检测到16个snp位点，按照核苷酸的突变类型以及发生数目对多态性位点进行分型(表2)，snps可以分为6种类型包括碱基c/g突变、g/a突变、g/t突变、t/c突变、a/g突变和c/t突。利用dnaspv6.0软件分析共检测到20种单体型，多态性为0.74，主要的单体型有hap1、hap2以及hap20，占供试材料的82.14％，其余单体型的份数较少，属于稀有变异。hap1单体型的自交系有40份，主要以旱21、沈3336、获唐黄等耐盐碱敏感的材料为主；hap2单体型包含21份自交系，以关17、31、鲁原133等中等耐盐碱的材料为主；hap20单体型包含54份自交系，以沈118、丹3130等耐盐碱的材料为主。表2zmnac89基因snp及单体型2.zmnac89基因编码区snp变异分析利用dnaman软件对zmnac89基因编码区的进行翻译整理，发现16个snp位点中共有6个snp位点为同义突变，不影响氨基酸序列；10个snp位点为非同义突变，可能改变蛋白质的结构和生理功能进而影响抗性表现(表3)。表3zmnac89基因编码区snp突变对应的氨基酸变化编号snp位点氨基酸变化碱基突变snp124124r/gggc/gggsnp142142a/tgag/gaasnp145145t/acca/ccgsnp181181v/mgtg/atgsnp191191g/dtgg/tgasnp218218v/agtt/gctsnp253253c/rgct/gccsnp500500s/tagt/actsnp712712h/ycat/tatsnp767767g/atgg/tgc实施例2zmnac89基因遗传变异与耐盐碱性的关联分析利用tassel5.0软件筛选出分型率maf>0.05的变异位点，根据前期对自然群体耐盐碱性鉴定的表型数据为基础，进行标记与表型之间的关联分析，利用tassel5.0软件中的一般线性模型glm对参试玉米自交系的zmnac89基因编码区序列16个多态性位点与耐盐碱性表型指标进行关联分析。结果表明，在0.05水平下，共有5个非同义突变snp位点与耐碱性表型指标相关(见表4和表5)。在碱性分析中，snp124、snp145、snp253与snp375等4个snp位点同时与株高(sl)显著相关，均为非同义突变；snp253对株高性状的表型贡献率最大，为14％；snp767与根表面积(rsa)显著相关，贡献率为4.1％，为非同义突变。在耐盐性分析中，snp253与株高(sl)显著相关，对该性状的表型贡献率为4.5％，snp767与地上部干重(sdw)显著相关，贡献率为5.3％，均为非同义突变。snp253(t/c)同时与两种胁迫处理中的株高(sl)显著相关，snp767(g/c)同时与碱胁迫指标中的根表面积(rs)和盐胁迫指标中的地上部干重(sdw)显著相关，说明同一个位点可能与多个性状存在关联，而同一个性状也有可能受多个位点调控。表4zmnac89基因编码区的序列变异与玉米耐碱性关联分析结果表5zmnac89基因编码区的序列变异与玉米耐盐性关联分析结果实施例3dcaps功能标记的开发依据zmnac89基因编码区关联分析的结果，snp253(t/c)和snp767(g/c)位点进行dcaps标记开发。由于引物是根据参考序列的反向互补链设计的，故snp253由t/c转变为a/g突变。利用在线网站dcapsfinder分析最佳酶切位点和选择限制性内切酶，开发功能标记，dcaps标记引物及相应的内切酶。dcaps标记引物及相应的内切酶如表6所示。snp253(t/c)转化的标记命名为dndcaps253，pcr扩增片段全长558bp，第180个碱基为突变位点，盐碱敏感材料为t，不能被sacii限制性内切酶切开；耐盐碱材料则为c，能被sacii切为179bp和379bp的两个片段(见表6和图1)。snp767(g/c)转化的标记命名为dndcaps767，pcr扩增片段全长为373bp，第139个碱基为突变位点，敏感材料为c，不能被tsei限制性内切酶切开；耐盐碱材料为g，能被tsei酶切为138bp和235bp的两个片段(见表6和图2)。表6dcaps标记引物及相应的内切酶实施例4dcaps功能标记的应用根据试验室前期利用nacl和na2co3对140份玉米自交系苗期胁迫处理鉴定的不同耐盐碱表型，并以140份不同耐盐碱性的玉米自交系的基因组总dna为模板，利用dcaps标记分析其基因型。通过结合140份材料的基因型与鉴定的耐盐碱表型，对开发的dcaps标记进行选择效率的分析。140份玉米自交系及系谱来源如表9。依据zmnac89基因编码区与耐盐碱性显著关联的2个snp位点开发的dcaps分子标记dndcaps253和标记dndcaps767，在140份玉米自交系中验证，结合耐盐碱表型鉴定结果，检验其分子符合率。结果见表7与8，耐nacl胁迫鉴定中，标记dndcaps253在57份敏感和高感的自交系中，基因型检测和表型的符合率平均是89.5％，在83份中耐及以上耐性的自交系中，基因型检测和表型的符合率平均是34.9％；耐na2co3胁迫鉴定中，该标记在33份敏感和高感的自交系中，基因型检测和表型的符合率平均是81.8％，在107份中耐及以上耐性的自交系中，基因型检测和表型的符合率平均是27.1％。总体来看，标记dndcaps253可用于在盐碱敏感的自交系的鉴别，检测效率平均是85.65％。耐nacl胁迫鉴定中，标记dndcaps767在57份敏感和高感的自交系中，基因型检测和表型的符合率平均是64.9％，在83份中耐及以上耐性的自交系中，基因型检测和表型的符合率平均是96.4％；耐na2co3胁迫鉴定中，该标记在33份敏感和高感的自交系中，基因型检测和表型的符合率平均是57.6％，在107份中耐及以上耐性的自交系中，基因型检测和表型的符合率平均是80.4％。总体来看，标记dndcaps767可用于耐盐碱自交系的鉴别，检测效率平均是88.4％。表7标记dndcaps253的选择效率分析表8标记dndcaps767的选择效率分析表9140份玉米自交系及系谱来源当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种基于转录因子基因zmnac89开发的与玉米耐盐碱性相关的dcaps分子标记，命名为dndcaps767，其特征在于所述的分子标记是使用dcaps引物对，以玉米基因组为模板通过pcr扩增后得到，其中含有snp位点，敏感材料为c，不能被tsei限制性内切酶切开；耐盐碱材料为g，能被tsei酶切为两个片段，所述的dcaps引物对的序列如下所示：
上游引物：5’cgaacgaatcagatgaaagcgg3’；
下游引物：5’gacaagcccatccacgacg3’。
2.一种基于snp位点开发与玉米耐盐碱相关的dcaps分子标记的方法，其特征在于以含有zmnac89基因编码区snp位点的核苷酸序列为基础序列，设计dcaps引物对，以玉米总dna为模板进行pcr扩增，使snp位点有效的转化为dcaps标记；所述的dcaps引物对的序列如下所示：
上游引物：5’cgaacgaatcagatgaaagcgg3’；
下游引物：5’gacaagcccatccacgacg3’。
3.一种引物对，其特征在于其为获得权利要求1所述的基于转录因子基因zmnac89开发的与玉米耐盐碱相关的dcaps分子标记的引物对；所述的引物对序列如下所示：
上游引物：5’cgaacgaatcagatgaaagcgg3’；
下游引物：5’gacaagcccatccacgacg3’。
4.权利要求1所述的基于转录因子基因zmnac89开发的与玉米耐盐碱相关的dcaps分子标记在玉米耐盐碱性分子标记辅助育种中的用途。
5.权利要求3所述的引物对在玉米耐盐碱性分子标记辅助育种中的用途。
技术总结本发明公开了一种与玉米耐盐碱性相关的dCAPS分子标记及其应用。本发明通过在不同的玉米自交系中分析受盐碱胁迫诱导表达的NAC转录因子基因ZmNAC89编码区及启动子的序列变异，与自交系的耐盐碱性进行关联分析，挖掘关联位点进而开发出了分子标记DNdCAPS767，其中含有SNP位点，敏感材料为C，不能被TseI限制性内切酶切开；耐盐碱材料为G，能被TseI酶切为两个片段。进一步的，本发明还提出了所述的分子标记在玉米耐盐碱性分子标记辅助育种中的用途，该分子标记在盐碱敏感的自交系的鉴别中检测效率平均是88.4％，本发明的提出为筛选耐盐碱玉米材料提供了新的技术手段。
技术研发人员：付畅;邸宏;张林;刘丹;刘杉;李春翔;周羽;王振华;曾兴;封陈晨
受保护的技术使用者：东北农业大学
技术研发日：2020.12.17
技术公布日：2021.03.12
