本发明涉及植物分子标记
技术领域：
，具体涉及一组与小麦抗条锈病基因位点显著关联的snp及其在条锈病抗性的遗传及分子育种中的应用。
背景技术：
：小麦是重要的粮食作物之一。小麦条锈病是影响小麦生产的主要因素之一，在几乎所有小麦种植区造成产量损失的病害中长期占据首位。小麦条锈病主要危害叶片，严重时也可侵染茎杆、穗部、叶鞘和颖壳等部位。条锈病侵染的苗期叶片上出现褪绿斑点，之后产生的夏孢子堆成熟破裂散出黄色粉末。条锈病菌侵染小麦植株后，叶片表面产生大量夏孢子堆，表皮组织遭到破坏，植株叶面积指数减少、叶片呼吸作用增加、蒸腾作用减小、光合作用和叶绿素含量明显降低，从而导致植株新陈代谢失常，小麦植株表现为生长发育受阻，导致小麦产量大幅度降低。条锈病发生较早且为害极重时，往往导致植株不能抽穗甚至绝收，在我国几乎所有小麦种植区都有发生并造成巨大产量损失,有时损失粮食产量达数百万吨。选育抗病品种或使用化学药剂防治是抵抗小麦条锈病威胁的常用措施。但是，长期使用化学药剂防治会带来病原菌产生抗药性、环境受到污染等一系列的不良问题；选育并使用抗条锈病的小麦品种，不仅能防治环境污染问题，还能改善小麦的遗传组成，提高小麦产量，是当前防治小麦条锈病最经济、安全、有效的措施。对小麦条锈病抗病性进行遗传研究对了解条锈病抗性的遗传结构、基因作图与克隆，以及在育种中利用这些基因有效提高条锈病抗性具有非常重要的作用。分子标记技术是进行有关性状的遗传、基因作图、标记辅助育种、基因组选择育种等育种研究中最常用的技术。常用的dna分子标记有rflp（restrictionfragmentlengthpolymorphism，限制性长度片段多态性），ssr（simplesequencerepeat，简单重复序列）和snp（singlenucleotidepolymorphism，单核苷酸多态性）等。传统的rflp和ssr标记存在通量低、数量少、操作过程繁琐等局限，及大地限制了工作效率的提高，不能满足功能基因组研究的需要。而snp标记在基因组中分布极其丰富，具有二态性，且易于高通量自动化检测，是在遗传研究与育种中最有应用前途的分子标记技术。目前，常用的snp的高通量检测技术主要有测序和dna芯片技术。利用测序技术对样品材料进行dna重测序可以获得高密度的snp标记，但重测序的成本很高。而简化基因组测序genotyping-by-sequencing(gbs)则先对基因组dna进行酶切等方法处理以减小基因组的复杂性，构建复杂性低的基因组dna文库，再利用二代测序技术进行深度测序，一定程度上降低了测序的成本。小麦中利用两种限制性内切酶处理基因组dna构建dna文库并通过测序鉴定snp的技术已经成熟。但是对于相对于小麦庞大的基因组（16g）要进行深度测序成本依然很高，而且gbs数据的处理、序列比对、基因分型等过程对数据分析的要求较高，需要有专业生物信息学背景的人员才能完成，一般育种家难以掌握和利用。技术实现要素：小麦重要性状的qtl作图、基因克隆以及分子标记辅助选择育种过程中需要开发分子标记。传统的ssr标记通量低、数量少，而基于snp位点转化而成kasp(kompetitiveallelespecificpcr)标记，即竞争性等位基因特异性pcr技术，能够在广泛的基因组dna样品中，对snps和特定位点上的indels进行精准的双等位基因判断。以其高度稳定性、准确性和低成本、高通量的特点，可广泛应用于基因定位、基因的精细作图、克隆，大规模育种材料的高通量筛选，在遗传研究和分子标记辅助育种、基因组选择育种中具有重要利用价值。针对现有技术存在的不足，本发明利用小麦中较为成熟的简化基因组测序（gbs）技术，对768份小麦材料进行简化基因组测序，并与小麦参考基因组进行序列比对，获得了全基因组高密度的snp位点，通过全基因组关联分析鉴定出与条锈病抗性显著关联的snp位点，可广泛应用于kasp标记的开发、基因定位、标记辅助选择与全基因组选择，服务于小麦条锈病抗性的遗传研究和分子育种。本发明提供了一套与小麦条锈病抗性显著关联的snp，可应用于小麦条锈病抗性的标记辅助选择和全基因组选择育种，并可用于开发单个kasp标记和snp芯片，方便在遗传和育种群体中利用。可广泛应用于小麦抗条锈病基因的定位，精细作图与克隆，育种中的单个、多个抗病基音的标记辅助选择、聚合及全基因组选择。本发明所采用的技术方案是：本发明提供了一组（38个）与小麦条锈病抗病性显著关联的单核苷酸多态性位点（snp），包括snp侧翼序列、snp位点信息及碱基突变信息，这些snp位于普通小麦13条不同染色体上。本发明提供的一组与小麦条锈病抗病性显著关联的snp位点，包括38个snp位点，编号分别为snp01～snp38，它们的信息如下：表中物理位置以中国春基因组iwgscreferencegenomev1.1(iwgsc,2018)为参考序列；表中所列序列见序列表seqidno.1～seqidno.76。本发明提供的一组与小麦条锈病抗性显著关联的snp位点可以在小麦条锈病抗性鉴定中应用。本发明提供的一组与小麦条锈病抗性显著关联的snp位点可以在制备小麦条锈病抗性鉴定试剂盒中应用。本发明提供的一组与小麦条锈病抗性显著关联的snp位点可以在制备单个可检测的snp标记或基因芯片中应用。本发明提供的一组与小麦条锈病抗性显著关联的snp位点可以在制备与抗条锈病基因位点qyr2a.1共分离的kasp标记2a_19902461或2a_20010283中应用。本发明提供的一组与小麦条锈病抗性显著关联的snp位点可以在小麦条锈病抗性鉴定检测方法中应用。检测方法中的应用，我们可以根据snp位点设计kasp引物，根据包含snp位点上下游各50bp的dna短序列设计kasp引物。具体利用网站polymarker(http://www.polymarker.info/)进行引物设计，采用网站默认的参数设置。引物前加接头，fam序列为“gaaggtgaccaagttcatgct”，hex序列为“gaaggtcggagtcaacggatt”。引物设计合成后，可以利用分离群体或者自然群体进行有效性检测，验证通过gwas鉴定到的qtl是否存在，其使用方法分别如下：（1）以小麦dna为pcr扩增模板，以设计合成的kasp引物，进行pcr扩增，反应体系为6μl。上述反应体系具体包括：20-50ng/μl的dna3μl，2×kaspmastermix3μl,kaspassaymix(上下游引物混合液)0.0825μl。置于384孔pcr仪扩增。（2）pcr扩增程序为:94℃预变性15min；94℃变性20s，65-57℃复性60s（每循环降低0.8℃），10个循环；94℃变性20s，57℃复性60s，30个循环；10℃保存；（3）pcr结束后，置于omegasnp分型仪检测pcr分型结果；（4）分析鉴定，根据分型结果分析基因型。本研究与现有技术相比有以下优点：（1）本发明鉴定了一组（38个）与条锈病抗性显著关联的snp。基本涵盖了目前在中国小麦种质中的抗条锈病数量性状基因位点。（2）这些snp可进一步转化为单个可检测的snp标记（如kasp标记），用于抗条锈病基因的定位、精细作图、克隆及大规模应用于育种材料的高通量分子标记辅助选择，提高分子育种的效率。（3）这些snp也可制作成基因芯片，应用于对育种材料进行抗病性的全基因组选择，进一步提高分子育种的效率和准确性。(4)开发了与抗条锈病基因位点qyr2a.1共分离的kasp标记2a_19902461和2a_20010283）不但证明我们鉴定到的snp是非常有效的，也为qyr2a.1的标记辅助选择提供了良好的高通量检测标记。附图说明图1是条锈病抗性全基因组关联分析的曼哈顿图和qq图。具体实施方式实施例1通过简化基因组测序鉴定snp1.1测序材料选取了768份小麦品种（系）用于简化基因组测序，鉴定snp。这些材料主要是来自我国小麦主产区包括黄淮麦区、北方冬麦区、长江中下游麦区和西南麦区的小麦品种和优良品系。研究方法1.2.1小麦基因组dna提取利用幼苗叶片提供基因组dna。dna提取采用改进的ctab（cetyltrimethylammoniumbromide）法(stewartandvia,1993)。具体操作：取小麦幼嫩叶片于2ml离心管中，利用液氮冷冻并于组织粉碎器上磨成粉末；（b）加入800μlctab于2ml管中后，置于65℃水浴90min，水浴期间轻晃5-8次，使dna充分裂解；（c）加入800μl氯仿异戊醇（体积比24:1）轻晃10min；（d）12000rpm条件下离心10min后取600μl上清液置于新的2ml管中（注意对应序号）；（e）加入60μl3m醋酸钠（ph=5.2）和600μl异丙醇（提前-20℃冷冻），轻晃混匀，即可看到白色dna絮状物产生，放于-20℃冰箱1h以增加dna产量。（f）12000rpm离心10min后倒掉上清液，将沉淀用70%乙醇（提前放入-20℃冰箱冷冻）清洗2-3次，通风橱中静置风干；（g）加入200μlddh2o溶解dna。样品质量检测用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像系统查看电泳结果，保证基因组dna的完整性。基因组dnaa260/280比值应在1.8–2.0之间，a260/230比值应在1.8-2.2之间。将dna稀释到工作浓度20ng/ul。-20℃保存备用。文库构建和gbs测序参照polandetal.(2012b)进行gbsdna文库的构建。基因组dna利用两个限制性内切酶psti和mspi(newenglandbiolabs,inc.,ipswich,ma,unitedstates)进行消化。利用t4(newenglandbiolabs,inc.,ipswich,ma,unitedstates)连接酶将条码序列连接到消化好的dna片段上。将每个平板的所有产物混合并使用qiaq快速pcr纯化试剂盒(qiagen,inc.,valencia,ca,unitedstates)进行纯化。利用与条码序列互补的引物进行pcr扩增。pcr产物再次使用qiaquickpcr纯化试剂盒进行纯化，并利用qubit™双链dna高灵敏度荧光定量试剂盒(lifetechnologies,inc.,grandisland,ny,unitedstates)测定浓度。利用琼脂糖凝胶电泳(lifetechnologies,inc.,grandisland,ny,unitedstates)筛选200-300大小的dna片段，qubit2.0荧光剂和qubit™双链dna高灵敏度荧光定量试剂盒估计每个dna文库的浓度。使用ionchefinstrument(ionpihi-qchefkit)将经片段大小筛选过的dna文库利用加载到p1v3芯片上并利用ionprotonsequencer(lifetechnologies,inc.,grandisland,ny,unitedstates,softwareversion5.10.1)进行序列测定。这个iontorrent系统可以产生各种读长的序列。位点鉴定对测序产生的序列，在其3’端加上80个poly-a碱基，然后利用tassel5.0进行序列分析，这样traitanalysisbyassociation,evolutionandlinkage(tassel)pipeline5.0（tassel5.0）(bradburyetal.,2007)就可以处理短于64碱基的序列而不仅仅是丢弃这些短序列。以中国春基因组iwgscreferencegenomev1.1(iwgsc,2018)为参考序列，利用tassel5.0(bradburyetal.,2007)进行序列比对鉴定snp位点。所有的参数都采用tassel5.0的默认设置。共获得432,588个snp位点，覆盖全基因组约14gb，标记之间的平均距离为34.0kb。其中a基因组上150784个位点，平均间距32.9kb；b基因组182192个位点，平均间距28.9kb；d基因组99612个位点，平均间距40.3kb。各染色体上snp标记的数目10177到31149，标记间距变异范围是26.1–50.1kb。这些snp主要位于基因之间的区域，有364203个，占84.1，其次是cds区，39901个（9.2%）、内含子区22215个（5.1%）、5’utr区3543个（0.8%）和3’utr区3300个（0.8%）。表1.gbs鉴定的snp位点在小麦基因组中的分布染色体snp个数覆盖区间大小标记间距cds内含子基因之间5‘utr3’utr1a18066593.832.91634980151681861202a24573780.531.827031451200551802153a21405750.835.11603966186141131224a22895744.332.51879959197941451305a20279709.635.019381160168771711526a1774261834.81666808149731551607a25824736.628.52021121922271128199a基因组1507844933.632.9134447543127752107810981b23116689.529.819291252197081231742b30733801.226.128481653257762732213b31149830.626.721771249273342281894b18628673.336.112881027160161951295b25545713.127.919011172221591651636b25809720.927.91982965225432001477b27212750.527.61631114324240122112b基因组1821925179.128.9137568461157776130611351d12729495.238.9185190696771591692d17887651.536.427531113136492311553d14893615.541.31564910121231281834d10177509.550.1104367982291241245d13920565.940.71706946110791301376d12371473.538.3175270096231711567d17635638.536.2203295714295216143d基因组996123949.640.31270162117867511591067全基因组43258814062.334.0399012221536420335433300实施例2抗小麦条锈病数量性状基因位点的全基因组鉴定2.1材料用于gbs技术鉴定基因型的768份小麦材料，同实施例1。2.2方法2.2.1条锈病抗性的鉴定为鉴定这些材料对条锈病（yellowrust，yr）的抗性，将这768份小麦材料于2017-2018(ta17)，2018-2019(ta18)，和2019-2020(ta19)年度种植于泰安山东农业大学实验站病害鉴定圃，进行条锈病抗性鉴定。每年春季在小麦起身后，接种小麦条锈病菌混合生理小种“cyr29”、“cyr32”、“su11”和“su14”。利用针管注射法接种条锈病菌，用注射器（2.5ml）往茎秆中注射少量孢子悬浮液（用无菌水稀释混合菌的孢子至浅黄色）。接种时，左手将麦茎弯下，右手推动注射器，把菌液注到麦茎中，以麦茎顶端冒水为有效针。接种一般在下午3时后进行，这时温度逐渐降低，菌液的蒸发量小，有利于孢子的萌发和侵入。在2017-2018年度，在洛阳、贵阳也对这些材料在大田自然发病条件下进行了条锈病抗性的鉴定。在所有的试验条件下，利用辉县红和铭贤169作为感病对照材料。每个材料种植1行，行长3米，行距25厘米。在每年的5月中下旬，当感病材料充分发病时对这些材料进行抗病性的鉴定。按0–4级法进行鉴定，0=无明显症状或坏死斑点；1=孢子堆很少且很小；2=孢子堆小或中等，较分散；3=孢子堆中等大小至很大，数量较多；4=普遍出现大孢子堆（sheng，1988）。2.2.2全基因组关联分析对所有鉴定到的432588个snp位点，进一步筛选最小等位基因频率（maf）大于0.01，缺失率小于80%的snp位点，得到到的327609个snp。对条锈病抗病性进行全基因组关联分析。采用gapitv.3程序包进行，它使用emma，压缩的混合线性模型（compressedmixedlinearmodel，cmlm）和populationparameterspreviouslydetermined(p3d)提高gwas运行的效率。利用emma算法分析kinship，使用前3个主成分控制群体结构。显著性阈值设定为1.0×10-5。2.3结果2.3.1条锈病抗病性的全基因组关联分析通过对多个环境下测定的条锈病抗性反应进行gwas，共鉴定到87个关联snp位点（markertraitassociation，mta），根据ld将其合并为34个抗条锈病qtl。其中有24个qtl被定位在1.0mb区间内，各含有不到10个注释基因。说明利用我们通过gbs鉴定到的高密度snp标记进行gwas能够将qtl定位在较窄的物理区间内，极大的方便了后续qtl的精细定位、基因克隆以及分子标记辅助育种。2.3.2鉴定出的与条锈病抗性关联的snp对通过gwas鉴定到的snp，每一个位点选取各环境下最显著关联的一个snp，共获得38个与条锈病抗性显著关联的snp位点，这些位点的信息见表2。表中“qtl”一列，表明snp连锁的qtl名称；表中“snp所在染色体及物理位置”一列，表明snp染色体所在的染色体和物理位置，物理位置参照以中国春基因组iwgscreferencegenomev1.1(iwgsc,2018)为参考序列；表中“序列与snp变异位点”一列，“[]”中碱基表明变异的位点，有的位点仅有一个碱基，表示变异后缺失此碱基。表2与小麦条锈病显著关联的snp位点信息实施例3小麦抗条锈性基因qyr2a.1的验证与作图3.1材料研究材料包括抗条锈病的亲本gh9、高感条锈病的亲本烟农19及二者杂交杂交构建的f2分离群体，共有273个f2单株，感病对照辉县红。3.2方法3.2.1抗病性的表型鉴定同实施例1。3.2.2dna提取同实施例1。3.2.3kasp引物设计、稀释：根据gwas分析结果，将与抗条锈病qtlqyr2a.1显著关联的两个gbs-snp（2a_19902461和2a_20010283）根据snp位点信息设计了两组（各三条）kasp引物k2a19902和k2a20010。将这两组引物三条引物用超纯水稀释到100μm后按照体积比正向引物-fam-r：正向引物-hex-s：反向引物：超纯水=6：6：15：23的比例进行混合后，保存至-20℃备用。3.2.4kasppcr扩增体系和程序如下：kasp反应体系采用6μl体系：依下表在冰上配制体系，模板dna3μl（20ng/μl左右），2×mastermix3μl（lgcgroupuk）,kasp化验引物0.0825μl（上海生工生物公司合成）。表3kasp反应体系药品体积模板dna3μl（20ng/μl左右）2xmastermix3μlkasp化验引物0.0825μl总和6.0825μlpcr程序如下：1.94℃预变性5min；2.94℃变性20s；3.65℃退火30s（每个循环降低0.8℃），步骤2-3循环10次。4.94℃变性20s；5.57℃退火30s，步骤4-5循环35次。6.10℃保存。信号检测。3.3结果3.3.1分离群体中条锈病抗性的分离gwas分析结果表明，qyr2a.1是一个控制小麦条锈病抗性的qtl，位于2as上0.5–21.8mb的区间内。gh9与烟农19在这两个位点间存在多态性。gh9高抗条锈病、烟农9高感条锈病。为进一步验证这个qtl并开发与其连锁的kasp标记，利用gh9与烟农19杂交构建了f2分离群体。对该群体进行条锈病抗性鉴定表明，f2代条锈病抗性出现明显的分离，以0-2级为抗病，3-4级为感病统计，抗病、感病单株各有210、63株，卡方检验符合抗：感=3:1的比例。3.3.2分离群体中条锈病抗性与标记基因型的关系将与该qtl关联最显著的两个gbs-snp（2a_19902461和s2a_20010283）转换成kasp标记后，对该群体进行基因分型，结果表明，这两个kasp标记均能将f2群体进行分型。将基因型与抗病性表现进行anova分析，结果p值<0.001，表明两个标记与抗病性极显著关联，两个snp标记基因型与gh9相同的f2单株表现为抗病(it≤1)，与烟农19相同的单株表现为感病(it接近3)，杂合个体的抗病性介于二者之间，表明在该区间内存在一个控制小麦条锈病抗性的qtl。以上所述仅是本专利的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本专利的保护范围。序列表<110>山东农业大学<120>一组与小麦条锈病抗性显著关联的snp位点及其在遗传育种中的应用<160>76<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>101<212>dna<213>小麦(triticumaestivum)<400>1ggaaatttagcaggcctgcagatcatgttagatgtgagcaacaataacttaactggcatg60ttaccgcagcaacttgggaagttggagatgctagaattttt101<210>2<211>101<212>dna<213>小麦(triticumaestivum)<400>2ggaaatttagcaggcctgcagatcatgttagatgtgagcaacaataacttcactggcatg60ttaccgcagcaacttgggaagttggagatgctagaattttt101<210>3<211>101<212>dna<213>小麦(triticumaestivum)<400>3ggcgtgttgaccctatacgggctgcagttgcactgccttactccaagtgttgtgctacac60atgtcctactttgcgaccctttgtgaatgcttcttgggagt101<210>4<211>101<212>dna<213>小麦(triticumaestivum)<400>4ggcgtgttgaccctatacgggctgcagttgcactgccttactccaagtgtcgtgctacac60atgtcctactttgcgaccctttgtgaatgcttcttgggagt101<210>5<211>101<212>dna<213>小麦(triticumaestivum)<400>5gaacatcatcttccccgacaccttggccaagatggcgatatcccgatcccacctgcagtc60ctcgcccatcgccttccagttttgcacttggcaggcaggtg101<210>6<211>101<212>dna<213>小麦(triticumaestivum)<400>6gaacatcatcttccccgacaccttggccaagatggcgatatcccgatcccgcctgcagtc60ctcgcccatcgccttccagttttgcacttggcaggcaggtg101<210>7<211>101<212>dna<213>小麦(triticumaestivum)<400>7ttggagcttctttgcagcttcctctctatgttgccggataaatctgcagataaaaaggat60ttgttgttttgtttgccaataatcaaacaactatgatatac101<210>8<211>101<212>dna<213>小麦(triticumaestivum)<400>8ttggagcttctttgcagcttcctctctatgttgccggataaatctgcagacaaaaaggat60ttgttgttttgtttgccaataatcaaacaactatgatatac101<210>9<211>101<212>dna<213>小麦(triticumaestivum)<400>9ttgcctggagcgattggaaatttagcaggcctgcagatcatgttagatgtgagcaacaat60aacctcagtggtgtgttgccacaacaacttgggaagttgga101<210>10<211>101<212>dna<213>小麦(triticumaestivum)<400>10ttgcctggagcgattggaaatttagcaggcctgcagatcatgttagatgtaagcaacaat60aacctcagtggtgtgttgccacaacaacttgggaagttgga101<210>11<211>101<212>dna<213>小麦(triticumaestivum)<400>11ggaaatttagcaggcctgcagatcatgttagatgtgagcaacaataacctcagtggtgtg60ttgccacaacaacttgggaagttggagatgctagaatttct101<210>12<211>101<212>dna<213>小麦(triticumaestivum)<400>12ggaaatttagcaggcctgcagatcatgttagatgtgagcaacaataaccttagtggtgtg60ttgccacaacaacttgggaagttggagatgctagaatttct101<210>13<211>101<212>dna<213>小麦(triticumaestivum)<400>13ttggtcaatggcaacaccataatgggagttctgcaggtcaagtcaggaggtcgactgatt60ggagaatgggtatgccctgcccgcttgtaagtgatcacatc101<210>14<211>101<212>dna<213>小麦(triticumaestivum)<400>14ttggtcaatggcaacaccataatgggagttctgcaggtcaagtcaggaggccgactgatt60ggagaatgggtatgccctgcccgcttgtaagtgatcacatc101<210>15<211>101<212>dna<213>小麦(triticumaestivum)<400>15tctaccgtcgccatgtgcttcccatgggcaagcctggaaagggtcgagagtgcaaatcct60agcgtggacggaggcacatcaagacatctgcagtggattgc101<210>16<211>101<212>dna<213>小麦(triticumaestivum)<400>16tctaccgtcgccatgtgcttcccatgggcaagcctggaaagggtcgagagggcaaatcct60agcgtggacggaggcacatcaagacatctgcagtggattgc101<210>17<211>101<212>dna<213>小麦(triticumaestivum)<400>17tccgcttcgatctgtctttcttttgccaaccaggtctgctatttgctcatcgatgaatcg60gaagcgcccatcggccttggctgcctgcagcagcaatcgcc101<210>18<211>101<212>dna<213>小麦(triticumaestivum)<400>18tccgcttcgatctgtctttcttttgccaaccaggtctgctatttgctcattgatgaatcg60gaagcgcccatcggccttggctgcctgcagcagcaatcgcc101<210>19<211>101<212>dna<213>小麦(triticumaestivum)<400>19acctgataggtacggaccactagcttaactctctcgtgctagctgcagctagccatggcc60catgcaagaggcatcctcctccccacgtactgcctgatcag101<210>20<211>101<212>dna<213>小麦(triticumaestivum)<400>20acctgataggtacggaccactagcttaactctctcgtgctagctgcagctggccatggcc60catgcaagaggcatcctcctccccacgtactgcctgatcag101<210>21<211>101<212>dna<213>小麦(triticumaestivum)<400>21gccaccacagaacgtcgcaacatcgccgcagtcgtcgagctcgaagcaccatgggccgct60gtcgcagcatatgtggcaggtcgccccaccagcctgcagca101<210>22<211>101<212>dna<213>小麦(triticumaestivum)<400>22gccaccacagaacgtcgcaacatcgccgcagtcgtcgagctcgaagcaccgtgggccgct60gtcgcagcatatgtggcaggtcgccccaccagcctgcagca101<210>23<211>101<212>dna<213>小麦(triticumaestivum)<400>23catatcatggtgctctgtctgtttacacccaatggcttgatgatgatgctcgtgctgcag60ctgttctcactgctagtgttctgcctcagtttgcttctgag101<210>24<211>101<212>dna<213>小麦(triticumaestivum)<400>24catatcatggtgctctgtctgtttacacccaatggcttgatgatgatgcttgtgctgcag60ctgttctcactgctagtgttctgcctcagtttgcttctgag101<210>25<211>101<212>dna<213>小麦(triticumaestivum)<400>25ggcgatgcgcgtggtggtggtgcctcccttggcggctttcggtgtgggaaggaaggggag60cggcttggacaggggcggcggagccgacggcgtgccggctg101<210>26<211>101<212>dna<213>小麦(triticumaestivum)<400>26ggcgatgcgcgtggtggtggtgcctcccttggcggctttcggtgtgggaacgaaggggag60cggcttggacaggggcggcggagccgacggcgtgccggctg101<210>27<211>101<212>dna<213>小麦(triticumaestivum)<400>27ggcgagatgtgcagcaatcatgttatccaaagggctcgaaaagtgacccggtggtgttga60cacgtattgcagcgggttatccgttcgtcgaggtggttcca101<210>28<211>101<212>dna<213>小麦(triticumaestivum)<400>28ggcgagatgtgcagcaatcatgttatccaaagggctcgaaaagtgacccgatggtgttga60cacgtattgcagcgggttatccgttcgtcgaggtggttcca101<210>29<211>101<212>dna<213>小麦(triticumaestivum)<400>29aacttggaagaagtgccagtccgcgccgacgaggagaagagcctcacctgtgacaccacc60gatgcggagctgcagcgcatcgccactaggacagaggaggc101<210>30<211>101<212>dna<213>小麦(triticumaestivum)<400>30aacttggaagaagtgccagtccgcgccgacgaggagaagagcctcacctgcgacaccacc60gatgcggagctgcagcgcatcgccactaggacagaggaggc101<210>31<211>101<212>dna<213>小麦(triticumaestiv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技术特征：1.一组与小麦条锈病抗病性显著关联的snp位点，其特征在于：所述的snp位点包括38个snp位点，编号分别为snp01～snp38，它们的信息如下：
表中物理位置以中国春基因组iwgscreferencegenomev1.1(iwgsc,2018)为参考序列；
表中所列序列见序列表seqidno.1～seqidno.76。
2.根据权利要求1所述的一组与小麦条锈病抗性显著关联的snp位点在小麦条锈病抗性鉴定中的应用。
3.根据权利要求1所述的一组与小麦条锈病抗性显著关联的snp位点在制备小麦条锈病抗性鉴定试剂盒中的应用。
4.根据权利要求1所述的一组与小麦条锈病抗性显著关联的snp位点在制备单个可检测的snp标记或基因芯片中的应用。
5.根据权利要求1所述的一组与小麦条锈病抗性显著关联的snp位点在制备与抗条锈病基因位点qyr2a.1共分离的kasp标记2a_19902461或2a_20010283中的应用。
6.根据权利要求1所述的一组与小麦条锈病抗性显著关联的snp位点在小麦条锈病抗性鉴定检测方法中的应用。
7.根据权利要求6所述的检测方法中的应用，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
根据snp位点设计kasp引物，根据包含snp位点上下游各50bp的dna短序列设计kasp引物；具体利用网站http://www.polymarker.info/进行引物设计，采用网站默认的参数设置；引物前加接头，fam序列为“gaaggtgaccaagttcatgct”，hex序列为“gaaggtcggagtcaacggatt”；
引物设计合成后，可以利用分离群体或者自然群体进行有效性检测，验证通过gwas鉴定到的qtl是否存在，也可以用于基因作图、标记辅助选择等，其使用方法分别如下：
（1）以小麦dna为pcr扩增模板，以设计合成的kasp引物，进行pcr扩增，反应体系为6μl；上述反应体系具体包括：20-50ng/μl的dna3μl，2×kaspmastermix3μl,kaspassaymix上下游引物混合液0.0825μl；置于384孔pcr仪扩增；
（2）pcr扩增程序为:94℃预变性15min；94℃变性20s，65-57℃复性60s；每循环降低0.8℃；10个循环；94℃变性20s，57℃复性60s，30个循环；10℃保存；
（3）pcr结束后，置于omegasnp分型仪检测pcr分型结果；
（4）分析鉴定，根据分型结果分析基因型。
技术总结本发明公开了一组（38个）与小麦条锈病抗病性显著关联的SNP位点及其在遗传和育种中的应用方法。这些SNP是通过对768份小麦品种和优良品系进行简化基因组测序（GBS）并比对参考基因组序列发掘单核苷酸多态性位点（SNP），然后通过全基因组关联分析鉴定出来的。SNP位点准确性高，可用于转化成KASP标记和SNP芯片，广泛应用于小麦抗条锈病基因的定位、精细作图和候选基因鉴定，以及小麦抗条锈病的标记辅助选择及全基因组选择育种，选育抗条锈病新种质和新品种。
技术研发人员：刘树兵;庞昀龙;刘春霞;赵萌;武玉叶
受保护的技术使用者：山东农业大学
技术研发日：2020.12.23
技术公布日：2021.03.12
