一种用于检测玉米植物ND4403的核酸分子及其检测方法与流程

专利2022-07-08 102

本发明涉及植物生物技术领域。具体的说，涉及一种用于检测玉米植物nd4403的核酸分子及其检测方法，特别是涉及一种具有高产和/或氮缺乏耐受性状的转基因玉米事件nd4403和用于检测生物样品中是否包含特定转基因玉米事件nd4403的核酸分子及其检测方法。

背景技术：

氮素是植物必须的矿质营养元素之一，是合成蛋白质、核酸和许多生物活性物质的必需组分。氮素缺乏通常导致植物生长迟缓，成熟叶片失绿并伴随着花青素的积累(diazc,saliba-colombaniv,loudeto,etal.leafyellowingandanthocyaninaccumulationaretwogeneticallyindependentstrategiesinresponsetonitrogenlimitationinarabidopsisthaliana[j].plant&cellphysiology,2006,47(1):74-83.)。氮肥在农业生产中的大量使用极大地提高了作物产量。当前全球每年施用大约8-9千万吨氮肥，经预测到2050年可增加至2.4亿吨(tilmand.globalenvironmentalimpactsofagriculturalexpansion:theneedforsustainableandefficientpractices[j].procnatlacadsciusa.1999,96(11):5995-6000.)。能源费用的提高导致了氮肥价格的不断上涨，从而增加了农业生产成本，同时氮肥的流失也在逐步恶化生态环境。基于经济效益和环境保护的双重考虑，在现代农业生产中种植氮高效作物品种是解决氮肥利用率低，降低生产成本，减小环境污染的有效途径，也是农业可持续发展和增强产品国际竞争力的基本要求。传统选育新品种是个非常长期的过程，现如今基因工程的不断成熟使得我们有可能通过基因工程的手段快速获得氮高效品种。玉米zmnrt1.1基因编码一种低亲和性的硝酸盐转运蛋白，能够影响植株根系对硝态氮的吸收，从而提高氮素的利用效率(quaggiottis,rupertib,pizzeghellod,etal.effectoflowmolecularsizehumicsubstancesonnitrateuptakeandexpressionofgenesinvolvedinnitratetransportinmaize(zeamaysl.)[j].journalofexperimentalbotany,2004,55(398):816-823.)，利用该基因可提高玉米在氮缺乏条件下的耐受性，并最终增加产量。

已知外源基因在植物体内的表达受到它们的染色体位置的影响，可能是由于染色质结构(如异染色质)或转录调节元件(如增强子)接近整合位点。为此，通常需要筛选大量的事件才有可能鉴定出可以商业化的事件(即导入的目标基因得到最优表达的事件)。例如，在植物和其他生物体中已经观察到导入基因的表达量在事件间可能有很大差异；在表达的空间或时间模式上可能也存在差异，如在不同植物组织之间转基因的相对表达存在差异，这种差异表现在实际的表达模式可能与根据导入的基因构建体中的转录调节元件所预期的表达模式不一致，从而导致了转化事件在性状表现上存在差异。因此，通常需要产生成百上千个不同的事件并从这些事件中筛选出具有以商业化为目的所预期的转基因表达量和表达模式的单一事件。具有预期的转基因表达量和表达模式的事件可用于采用常规育种方法通过有性异型杂交将转基因渗入到其他遗传背景中。通过这种杂交方式产生的后代保持了原始转化事件的转基因表达特征。应用这种策略模式可以确保在许多品种中具有可靠的基因表达，而这些品种能很好地适应当地的生长条件。因此，需要对更多的转化事件进行性状鉴定和筛选，以获得综合性状表现优异，具有商业化前景的优异转化事件。

能够检测特定事件的存在以确定有性杂交的后代是否包含目的基因将是有益的。此外，检测特定事件的方法还将有助于遵守相关法规，例如来源于重组农作物的食物在投入市场前需要获得正式批准和进行标记。通过任何熟知的多核苷酸检测方法来检测转基因的存在都是可能的，例如聚合酶链式反应(pcr)或利用多核苷酸探针的dna杂交。这些检测方法通常集中于常用的遗传元件，例如启动子、终止子、标记基因等。因此，除非与插入的转基因dna相邻的染色体dna(“侧翼dna”)的序列是己知的，上述这种方法就不能够用于区别不同的事件，特别是那些用相同的dna构建体产生的事件。所以，目前常利用跨越了插入的转基因和侧翼dna的接合部位的一对引物通过pcr来鉴定转基因特定事件，具体地说是包含侧翼序列的第一引物和包含插入序列的第二引物。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种产量性状和/或氮缺乏耐受性状表现优异的玉米转化事件以及用于检测玉米植物nd4403的核酸分子及其检测方法。转基因玉米事件nd4403因具有较高的氮素利用效率而表现高产和/或氮缺乏耐受性状，且检测方法可以准确快速地鉴定生物样品中是否包含特定转基因玉米事件nd4403的dna分子。

为实现上述目的，本发明使用利用农杆菌侵染技术将pcambia1301-zmnrt1.1a表达载体转化玉米y822幼胚中，获得了转zmnrt1.1a及bar基因玉米转化事件45个。其中，nd4403表现出稳定的世代遗传性，氮缺乏耐受性和产量性状突出，具有较好的应用前景。

为了表征nd4403的身份特征，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含seqidno:1和/或seqidno:2所示序列，或其互补序列。

进一步地，所述核酸分子序列包含seqidno:3所示序列，或其互补序列。

进一步地，所述核酸分子序列包含seqidno:4所示序列，或其互补序列。

更进一步地，所述核酸分子序列包含seqidno:5所示序列或其互补序列。

另一方面，本发明提供了用于检测玉米转化事件的探针，其特征在于，包括seqidno:1或seqidno:2或seqidno:3或seqidno:4或seqidno:5所示序列或其片段或其变体或其互补序列。

本发明还提供了用于检测玉米转化事件的引物对，其特征在于，所述引物对包括：

特异性识别seqidno:5所示序列第1-647位核苷酸序列的一条引物和特异性识别seqidno:5所示序列第648-5737位核苷酸序列的一条引物；和/或

特异性识别seqidno:5所示序列第648-5737位核苷酸序列的一条引物和特异性识别seqidno:5所示序列第5738-6093位核苷酸序列的一条引物；

在一些实施方案中，所述引物对的扩增产物包含权利要求2所述的序列；

在一些实施方案中，所述引物对为seqidno:6和seqidno:7所示的序列或其互补序列；或seqidno:8和seqidno:9所示的序列或其互补序列。

本发明还提供了用于检测玉米转化事件的试剂盒或微阵列，其特征在于，包含上述的探针和/或上述的引物对。

本发明还提供了检测玉米转化事件的方法，其特征在于，包括利用上述的探针或上述的引物对或上述的探针和引物对或上述的试剂盒或微阵列来检测待测样品中是否存在所述转化事件。

本发明还提供了对玉米进行育种的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)获得包含上述核酸分子的玉米；

2)将步骤1)所获得的玉米通过花粉培养、未受精胚培养、加倍培养、细胞培养、组织培养、自交或杂交或以上的组合得到玉米植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分；以及任选地，

3)对步骤2)所获得的后代植物进行产量性状鉴定和/或氮缺乏耐受性鉴定，并利用上述的方法来检测其中是否存在所述转化事件。

进一步的，本发明还提供了利用上述方法获得的玉米植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分制成的制品，包括食品、饲料或工业原料。

本发明中，所述核酸分子序列可以为所述seqidno:1或其互补序列中转基因插入序列的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第一核酸分子)，或者为所述seqidno:1或其互补序列中5’左侧翼玉米基因组dna区域的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第二核酸分子)。所述核酸分子进一步可以为同源于或互补于包含完整的所述seqidno:5的所述seqidno:3的一部分。当第一核酸分子和第二核酸分子一起使用时，这些核酸分子在产生扩增产物的dna扩增方法中包括dna引物对。使用dna引物对在dna扩增方法中产生的扩增产物是包括seqidno:1或seqidno:3或seqidno:5的扩增产物时，可以诊断转基因玉米事件nd4403或其后代的存在。

所述seqidno:1或其互补序列为转基因玉米事件nd4403中在插入序列的5’末端位于插入接合部位附近的一个长度为971个核苷酸的序列，所述seqidno:1或其互补序列由647个核苷酸的玉米左侧翼基因组dna序列(seqidno:1的核苷酸1-647)、125个核苷酸的pcambia1301-zmnrt1.1a构建体左边界dna序列(seqidno:1的核苷酸648-772)和199个核苷酸的耐草铵膦基因的第一表达盒dna序列(seqidno:1的核苷酸773-971)组成，包含所述seqidno:1或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件nd4403的存在。

所述核酸分子序列可以为所述seqidno:2或其互补序列中转基因插入序列的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第三核酸分子)，或者为所述seqidno:2或其互补序列中3’右侧翼玉米基因组dna区域的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第四核酸分子)。当第三核酸分子和第四核酸分子一起使用时，这些核酸分子在产生扩增产物的dna扩增方法中包括dna引物组。使用dna引物对在dna扩增方法中产生的扩增产物是包括seqidno:2或seqidno:4或seqidno:5的扩增产物时，可以诊断转基因玉米事件nd4403或其后代的存在。

所述seqidno:2或其互补序列为转基因玉米事件nd4403中在插入序列的3’末端位于插入接合部位附近的一个长度为1031个核苷酸的序列，所述seqidno:2或其互补序列由377个核苷酸的氮高效利用基因的第二表达盒的3’末端dna序列(seqidno:2的核苷酸1-377)、298个核苷酸的pcambia1301-zmnrt1.1a构建体右边界dna序列(seqidno:2的核苷酸378-675)和356个核苷酸的玉米整合位点右侧翼基因组dna序列(seqidno:2的核苷酸676-1031)组成，包含所述seqidno:2或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件nd4403的存在。

所述seqidno:5或其互补序列为表征转基因玉米事件nd4403的长度为6093个核苷酸的序列，其具体包含的基因组和遗传元件如表1所示。包含所述seqidno:5或其互补序列即可鉴定为转基因玉米事件nd4403的存在。

表1seqidno:5包含的基因组及遗传元件

1：单位bp。

本领域技术人员熟知的，第一和第二核酸分子或第三和第四核酸分子不必仅仅由dna组成，也可包括rna、dna和rna的混合物，或者dna、rna或其它不作为一种或多种聚合酶模板的核苷酸或其类似物的组合。此外，本发明中所述探针或引物应该是至少大约11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个连续核苷酸的长度，其可以选自seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4或seqidno:5中所述的核苷酸。当选自seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4或seqidno:5所示的核苷酸时，所述探针和引物可以为长度是至少大约21个到大约50个或更多的连续核苷酸。

本发明还提供了一种提高玉米产量和/或氮缺乏耐受性的方法，其特征在于，包括在土壤中种植至少一种转基因玉米植物，所述转基因玉米植物在其基因组中包含seqidno:5第2243-6093位核酸序列，或者所述转基因玉米植物的基因组中包含seqidno:5；所述转基因玉米植物具有高产和/或氮缺乏耐受性状。

本发明还提供了提高玉米产量和/或氮缺乏耐受性的方法，其特征在于，将如seqidno:5的第2243-5439位核苷酸所示序列的表达氮高效利用基因的表达盒导入玉米基因组中

在本发明用于检测玉米植物的核酸分子及其检测方法中，以下定义和方法可以更好地定义本发明和指导本领域的普通技术人员实施本发明，除非另作说明，根据本领域普通技术人员的常规的用法来理解术语。

所述“玉米”是指玉蜀黍(zeamays)，并且包括可以与玉米交配的所有植物品种，包括野生玉米种。

所述“包含”是指“包括但不限于”。

术语“植物”包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛(plantclumps)和植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎秆、根、根尖、花药等。应理解为本发明范围内的转基因植物的部分包括但不限于植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚以及花、茎、果实、叶和根，以上植物部分源自事先用本发明的dna分子转化的并因此至少部分地由转基因细胞组成的转基因植物或其子代。

术语“基因”是指表达特定蛋白的核酸片段，包括编码序列前的调节序列(5’非编码序列)和编码序列后的调节序列(3’非编码序列)。“天然基因”是指天然发现具有其自身调节序列的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，其包含非天然发现的调节和编码序列。“内源基因”是指天然基因，所述天然基因位于生物体基因组中它的天然位置。“外源基因”是现存在于生物的基因组中且原来不存在的外来基因，也指经转基因步骤导入受体细胞的基因。外源基因可以包含插入非天然生物体的天然基因或嵌合基因。“转基因”是通过转化程序已经被引入基因组的基因。植物基因组中重组dna已被插入的位点可以称为“插入位点”或“靶位点”。

“侧翼dna”可以包含天然存在于例如植物的生物体中的基因组或通过转化过程引入的外源(异源)dna，例如与转化事件相关的片段。因此，侧翼dna可以包括天然和外源dna的组合。在本发明中，“侧翼区”或“侧翼序列”或“基因组边界区”或“基因组边界序列”是指至少3、5、10、11、15、20、50、100、200、300、400、1000、1500、2000、2500或5000碱基对或更长的序列，其位于最初外源插入dna分子的直接上游或下游并且与最初外源插入dna分子相邻。当该侧翼区位于上游时，其也可以称为“左边界侧翼”或“5’侧翼”或“5’基因组侧翼区”或“基因组5’侧翼序列”等。当该侧翼区位于下游时，其也可以称为“右边界侧翼”或“3’侧翼”或“3’基因组侧翼区”或“基因组3’侧翼序列”等。

引起外源dna的随机整合的转化程序会导致含有不同侧翼区的转化事件，所述不同侧翼区是每个转化事件所特异性含有的。当重组dna通过传统杂交被引入植物时，其侧翼区通常不会改变。转化事件也会含有异源插入物dna和基因组dna的段之间或两段基因组dna之间或两段异源dna之间的独特的接合。“接合”是两个具体的dna片段连接的点。例如，接合存在于插入物dna连接侧翼dna的位置。接合点还存在于转化的生物体中，其中两个dna片段以修饰自天然生物体中发现的方式的连接在一起。“接合dna”是指包含接合点的dna。

本发明提供了称为nd4403的转基因玉米事件及其后代，所述转基因玉米事件nd4403即为玉米植物nd4403，其包括转基因玉米事件nd4403的植物和种子及其植物细胞或其可再生部分，所述转基因玉米事件nd4403的植物部分，包括但不限于细胞、花粉、胚珠、花、芽、根、茎、穗丝、花序、耳穗、叶和来自玉米植物nd4403的产物，例如玉米粉、玉米面、玉米油、玉米浆、玉米穗丝、玉米淀粉和留在玉米作物田间的生物量。

本发明转基因玉米事件nd4403包含了一个dna构建体，当其在植物细胞内表达时，所述转基因玉米事件nd4403获得产量提升和/或氮缺乏耐受性状。所述dna构建体包含一个表达盒，表达盒包含用于在植物中表达的适合的启动子和适合的多聚腺苷酸化信号序列，所述启动子可操作地连接编码玉米硝酸盐转运蛋白基因zmnar1.1a，所述zmnar1.1a的核酸分子对氮缺乏具有耐受性。所述dna构建体包含另一个表达盒，表达盒包含用于在植物中表达的适合的启动子和适合的多聚腺苷酸化信号序列，所述启动子可操作地连接编码膦丝菌素乙酰转移酶(pat)的基因bar，所述pat蛋白的核酸分子对草铵膦除草剂具有耐受性，可以作为转化阶段的筛选标记使用。进一步地，所述启动子可以为从植物分离的适合启动子，包括组成型、诱导型和/或组织特异型启动子，所述适合启动子包括但不限于，花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、玄参花叶病毒(fmv)35s启动子、泛素蛋白(ubiquitin)启动子、肌动蛋白(actin)启动子、土壤农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)胭脂碱合成酶(nos)启动子、章鱼碱合成酶(ocs)启动子、夜香树属(cestrum)黄叶卷曲病毒启动子、马铃薯块茎储藏蛋白(patatin)启动子、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(rubisco)启动子、谷胱甘肽硫转移酶(gst)启动子、e9启动子、gos启动子、alca/alcr启动子、毛根农杆菌(agrobacteriumrhizogenes)rold启动子和拟南芥属(arabidopsisthaliana)suc2启动子。所述多聚腺苷酸化信号序列可以为在植物中起作用的适合多聚腺苷酸化信号序列，所述适合多聚腺苷酸化信号序列包括但不限于，来源于土壤农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)胭脂碱合成酶(nos)基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于花椰菜花叶病毒(camv)35s终止子、来源于蛋白酶抑制剂ⅱ(pinⅱ)基因的多聚腺苷酸化信号序列和来源于α-微管蛋白(α-tubulin)基因的多聚腺苷酸化信号序列。

此外，所述表达盒还可以包括其他的遗传元件，所述遗传元件包括但不限于，增强子和信号肽/转运肽。所述增强子可以增强基因的表达水平，所述增强子包括但不限于，烟草蚀刻病毒(tev)翻译激活因子、camv35s增强子和fmv35s增强子。所述信号肽/转运肽可以引导epsps蛋白转运到细胞外或者细胞内特定的细胞器或区室，例如，利用编码叶绿体转运肽序列靶向叶绿体，或者利用‘kdel’保留序列靶向内质网。

所述dna构建体采用转化方法被引入到植物中，所述转化方法包括但不限于，农杆菌(agrobacterium)介导转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。

所述农杆菌介导转化法是植物转化的常用方法。将要引入到植物中的外源dna克隆到载体的左和右边界共有序列之间，即t-dna区。所述载体被转化到农杆菌细胞中，随后，所述农杆菌细胞用于感染植物组织，包含外源dna的载体的所述t-dna区被插入到植物基因组中。

转化后，必须从转化的植物组织再生转基因植物，并且利用适合的标记选择具有外源dna的后代。

dna构建体是dna分子互相连接起来的组合，该组合提供了一个或多个表达盒。dna构建体优选地是能够在细菌细胞内自我复制，而且含有不同的限制性内切酶位点的质粒，所含的限制性内切酶位点用于导入提供功能性基因元件，即启动子、内含子、前导序列、编码序列、3’终止子区域和其他序列的dna分子。dna构建体中所含有的表达盒包括提供信使rna的转录所必需的基因元件，所述表达盒可以设计为在原核细胞或真核细胞中表达。本发明的表达盒被设计为最优选地在植物细胞内表达。

转基因“事件”是通过用异源dna构建体转化植物细胞而得到的，即包括至少一个含有目标基因的核酸表达盒，通过转基因的方法插入到植物基因组中以产生植物群体，再生所述植物群体，和选择具有插入特定基因组位点特征的特定植株。术语“事件”指包括异源dna的原始转化事件和该转化事件的后代。术语“事件”还指转化事件和含有异源dna的其它品种个体之间进行有性杂交而得到的后代，即使在与回交亲本进行反复回交后，来自于转化事件亲本的插入dna和侧翼基因组dna也存在于杂交后代中的同一染色体位置。术语“事件”还指来自原始转化事件的dna序列，该dna序列包含插入dna和与插入dna紧密相邻的侧翼基因组序列，该dna序列被预期转移到子代中，该子代由含有插入dna的亲本系(例如原始转化事件和其自交产生的子代)与不含有插入dna的亲本系进行有性杂交而产生，且该子代接受了包含目标基因的插入dna。

本发明中“重组”是指通常不能在自然界中发现并且因此通过人工干预产生的dna和/或蛋白和/或生物体的形式。这种人工干预可产生重组dna分子和/或重组植物。所述“重组dna分子”是通过人工组合两种在其它情况下是分离的序列区段而获得的，例如通过化学合成或通过遗传工程技术操作分离的核酸区段。进行核酸操作的技术是众所周知的。

术语“转基因”包括任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，以上的基因型由于异源核酸的存在而改变，所述“转基因”包括最初被这样改变的转基因体以及由最初的转基因体通过有性杂交或无性繁殖生成的子代个体。在本发明中，术语“转基因”不包括通过常规植物育种方法或天然发生事件的基因组的(染色体的或染色体外的)改变，所述天然发生事件例如随机异体受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变。

本发明中“异源的”是指自然界中第一分子通常不被发现与第二分子组合。例如，分子可以源自第一物种并插入到第二物种的基因组中。因此这种分子对于宿主是异源的并被人工引入宿主细胞的基因组中。

培养高产和/或对氮缺乏具有耐受性的转基因玉米事件nd4403，通过以下步骤：首先使第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物有性杂交，从而产生了多样的第一代子代植株，所述第一亲本玉米植物由培育自转基因玉米事件nd4403及其后代的玉米植物组成，该转基因玉米事件nd4403及其后代是通过利用本发明的氮高效利用表达盒进行转化而得到的，第二亲本玉米植物缺乏高产和/或氮缺乏耐受性；然后选择对氮缺乏具有耐受性或产量增加的子代植株，可以培育出对氮缺乏具有耐受性或产量提高的玉米植物。这些步骤可以进一步包括使高产和/或氮缺乏耐受性的子代植株与第二亲本玉米植物或第三亲本玉米植物进行回交，然后通过与性状相关的分子标记物(如包含转基因玉米事件nd4403中插入序列的5’端和3’端鉴定出的接合位点的dna分子)的鉴定来选择子代，从而产生产量提高和/或氮缺乏具有耐受性的玉米植物。

还应理解的是，两种不同的转基因植物也可以杂交以产生含有两个独立的、分离式添加的外源基因的后代。适当后代的自交可以得到对两个添加的外源基因来说都是纯合子的后代植株。如前所述的对亲本植株的回交和与非转基因植物的异型杂交也是可以预期的，无性繁殖也是同样的。

术语“探针”是一段分离的核酸分子，其上面结合有常规的可检测标记或报告分子，例如，放射性同位素、配体、化学发光剂或酶类。这种探针与目标核酸的一条链是互补的，在本发明中，探针与来自转基因玉米事件nd4403基因组的一条dna链互补，不论该基因组dna是来自转基因玉米事件nd4403或种子还是来源于转基因玉米事件nd4403的植物或种子或提取物。本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，还包括特异性地与目标dna序列结合并可用于检测该目标dna序列的存在的聚酰胺及其他探针材料。

术语“引物”是一段分离的核酸分子，其通过核酸杂交，退火结合到互补的目标dna链上，在引物和目标dna链之间形成杂合体，然后在聚合酶(例如dna聚合酶)的作用下，沿目标dna链延伸。本发明的引物对涉及其在目标核酸分子扩增中的应用，例如，通过聚合酶链式反应(pcr)或其他常规的核酸扩增方法。

探针和引物的长度一般是11个多核苷酸或更多，优选的是18个多核苷酸或更多，更优选的是24个多核苷酸或更多，最优选的是30个多核苷酸或更多。这种探针和引物在高度严格杂交条件下与目标序列特异性地杂交。尽管不同于目标dna序列且对目标dna序列保持杂交能力的探针是可以通过常规方法设计出来的，但是，优选的，本发明中的探针和引物与目标序列的连续核酸具有完全的dna序列同一性。

如本文所用，“试剂盒”或“微阵列”是指用于生物样品中玉米转化事件的鉴定和/或检测目的的试剂组或芯片。为质量控制(例如种子批次的纯度)、植物材料中或包含植物材料或来源于植物材料的材料例如但不限于食品或饲料产品中事件的检测的目的，可以使用试剂盒或芯片，并且其组分可以具体地调整。

基于本发明的侧翼基因组dna和插入序列的引物和探针可以通过常规方法确定，例如，通过从来源于转基因玉米事件nd4403的植物材料中分离相应的dna分子，并确定该dna分子的核酸序列。所述dna分子包含转基因插入序列和玉米基因组侧翼区域，所述dna分子的片段可以用作引物或探针。

本发明的核酸探针和引物在严格条件下与目标dna序列杂交。任何常规的核酸杂交或扩增方法都可以用于鉴定样品中来源于转基因玉米事件nd4403的dna的存在。核酸分子或其片段在一定情况下能够与其他核酸分子进行特异性杂交。如本发明使用的，如果两个核酸分子能形成反平行的双链核酸结构，就可以说这两个核酸分子彼此间能够进行特异性杂交。如果两个核酸分子显示出完全的互补性，则称其中一个核酸分子是另一个核酸分子的“互补物”。如本发明使用的，当一个核酸分子的每一个核苷酸都与另一个核酸分子的对应核苷酸互补时，则称这两个核酸分子显示出“完全互补性”。如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在至少常规的“低度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子为“最低程度互补”。类似地，如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在常规的“高度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子具有“互补性”。从完全互补性中偏离是可以允许的，只要这种偏离不完全阻止两个分子形成双链结构。为了使一个核酸分子能够作为引物或探针，仅需保证其在序列上具有充分的互补性，以使得在所采用的特定溶剂和盐浓度下能形成稳定的双链结构。

如本发明使用的，基本同源的序列是一段核酸分子，该核酸分子在高度严格条件下能够和相匹配的另一段核酸分子的互补链发生特异性杂交。促进dna杂交的适合的严格条件，例如，大约在45℃条件下用6.0×氯化钠/柠檬酸钠(ssc)处理，然后在50℃条件下用2.0×ssc洗涤，这些条件对本领域技术人员是公知的。例如，在洗涤步骤中的盐浓度可以选自低度严格条件的约2.0×ssc、50℃到高度严格条件的约0.2×ssc、50℃。此外，洗涤步骤中的温度条件可以从低度严格条件的室温约22℃，升高到高度严格条件的约65℃。温度条件和盐浓度可以都发生改变，也可以其中一个保持不变而另一个变量发生改变。优选地，本发明的一个核酸分子可以在中度严格条件下，例如在约2.0×ssc和约65℃下与seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:5、seqidno:6和seqidno:7中一个或多个核酸分子或其互补序列，或者上述序列的任一片段发生特异性杂交。更优选地，本发明的一个核酸分子在高度严格条件下与seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3和seqidno:5中一个或多个核酸分子或其互补序列，或者上述序列的任一片段发生特异性杂交。本发明中，优选的标记物核酸分子具有seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3或seqidno:5或其互补序列，或者上述序列的任一片段。

本发明另一优选的标记物核酸分子与seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4或seqidno:5或其互补序列，或者上述序列的任一片段具有80％到100％或90％到100％的序列同一性。seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4或seqidno:5可以用作植物育种方法中的标记物以鉴定遗传杂交的后代。探针与目标dna分子的杂交可以通过任何一种为本领域技术人员所熟知的方法进行检测，这些方法包括但不限于，荧光标记、放射性标记、抗体类标记和化学发光标记。

关于使用特定的扩增引物对目标核酸分子进行的扩增(例如，通过pcr)，“严格条件”指的是在dna热扩增反应中仅允许引物对目标核酸分子发生杂交的条件，具有与目标核酸分子相应的序列(或其互补序列)的引物，能够与所述目标核酸分子结合，并且优选产生唯一的扩增产物，扩增产物即扩增子。

术语“特异性结合(目标序列)”是指在严格杂交条件下探针或引物仅与包含目标分子的样品中的目标分子发生杂交。

如本发明使用的，“经过扩增的dna”或“扩增子”是指作为核酸模板一部分的目标核酸分子的核酸扩增产物。例如，为了确定玉米植物是否由含有本发明转基因玉米事件nd4403通过有性杂交方式产生，或采集自田地的玉米样品是否包含转基因玉米事件nd4403，或玉米提取物，例如粗粉、粉或油是否包含转基因玉米事件nd4403，从玉米植物组织样品或提取物提取的dna可以通过使用引物对的核酸扩增方法以产生对于转基因玉米事件nd4403的dna的存在是诊断性的扩增子。所述引物对包括一个来源于植物基因组中与插入的外源dna插入位点相邻的侧翼序列的第一引物，和来源于插入的外源dna的第二引物。扩增子具有一定长度和序列，所述序列对所述转基因玉米事件nd4403也是诊断性的。

扩增子的长度范围可以是引物对的结合长度加上一个核苷酸碱基对，优选加上约五十个核苷酸碱基对，更优选加上约两百五十个核苷酸碱基对，最优选加上约四百五十个核苷酸碱基对或更多。

可选的，引物对可以来源于插入dna两侧的侧翼基因组序列，以产生包括整个插入核苷酸序列的扩增子。来源于植物基因组序列的引物对中的一个可以位于距插入dna序列一定距离处，该距离的范围可以为一个核苷酸碱基对到约两万个核苷酸碱基对。术语“扩增子”的使用特别排除了在dna热扩增反应中形成的引物二聚体。

核酸扩增反应可以通过本领域已知的任何一种核酸扩增反应方法实现，包括聚合酶链式反应(pcr)。各种核酸扩增方法已是本领域技术人员所熟知的。pcr扩增方法已经发展到可扩增22kb的基因组dna和42kb的噬菌体dna。这些方法以及本领域的其他dna扩增方法可以用于本发明。插入的外源dna序列和来自转基因玉米事件nd4403的侧翼dna序列可以通过利用所提供的引物序列对转基因玉米事件nd4403的基因组进行扩增，扩增后对pcr扩增子或克隆的dna进行标准的dna测序。

基于dna扩增方法的dna检测试剂盒含有dna引物分子，它们在适当的反应条件下特异性杂交到目标dna上并扩增诊断性扩增子。试剂盒可提供基于琼脂糖凝胶的检测方法或者现有技术已知的检测诊断性扩增子的许多方法。含有与seqidno:1或seqidno:2的玉米基因组区的任何部分同源或互补的以及与seqidno:5的转基因插入区的任何部分同源或互补的dna引物的试剂盒是本发明所提供的。特别地鉴别在dna扩增方法中有用的引物对是seqidno:6和seqidno:7，其扩增与转基因玉米事件nd4403的5’转基因/基因组区的一部分同源的诊断性扩增子，其中扩增子包括seqidno:3。鉴别在dna扩增方法中有用的引物对还可以是seqidno:8和seqidno:9，其扩增与转基因玉米事件nd4403的3’转基因/基因组区的一部分同源的诊断性扩增子，其中扩增子包括seqidno:4。

这些方法所产生的扩增子可以通过多种技术进行检测。其中一个方法是geneticbitanalysis，该方法设计了一个跨越插入dna序列和相邻的侧翼基因组dna序列的dna寡核苷酸链。将该寡核苷酸链固定在一个微孔板的微孔内，在对目标区域进行pcr扩增后(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)，单链pcr产物可与固定的寡核苷酸链进行杂交，并且作为单碱基延伸反应的模板，该延伸反应使用了dna聚合酶和为下一个预期的碱基特定标记的ddntps。可以通过荧光或elisa类方法得到结果。信号代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增、杂交和单碱基延伸反应是成功的。

另一种方法是pyrosequencing(焦磷酸测序)技术。该方法设计了一个跨越插入dna序列和相邻的基因组dna结合部位的寡核苷酸链。将该寡核苷酸链和目标区域的单链pcr产物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)进行杂交，然后和dna聚合酶、atp、硫酰基酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、腺苷-5’-磷硫酸盐和萤光素一起进行温育。分别加入dntps，测量产生的光信号。光信号代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增、杂交、和单碱基或多碱基延伸反应是成功的。

荧光偏振现象也是可以用于检测本发明扩增子的一种方法(chenx,levinel,andkwokpy.fluorescencepolarizationinhomogeneousnucleicacidanalysis[j].genomeres,1999,9(5):492-8.)。使用这种方法需要设计一个跨越插入dna序列和相邻的基因组dna结合部位的寡核苷酸链。将该寡核苷酸链和目标区域的单链pcr产物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)进行杂交，然后和dna聚合酶以及一种荧光标记的ddntp一起进行温育。单碱基延伸会导致插入ddntp。这种插入可以利用荧光仪测量其偏振的改变。偏振的改变代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增、杂交和单碱基延伸反应是成功的。

taqman被描述为一种检测和定量分析dna序列存在的方法，该方法在制造商所提供的使用说明中有详细介绍。现简要举例说明如下，设计一个跨越插入dna序列和相邻的基因组侧翼结合部位的fret寡核苷酸探针。该fret探针和pcr引物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)在热稳定聚合酶和dntps存在下进行循环反应。fret探针的杂交导致fret探针上荧光部分和淬灭部分的分裂以及荧光部分的释放。荧光信号的产生代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增和杂交是成功的。

基于杂交原理，用于检测来源于转基因玉米事件nd4403的植物材料的适合技术还可以包括southern印迹杂交、northern印迹杂交和原位杂交。特别地，所述适合技术包括温育探针和样品，洗涤以移除未结合的探针和检测探针是否已经杂交。所述的检测方法取决于探针所附标记的类型，例如，通过x光片曝光和显影可以检测放射性标记的探针，或通过底物转化实现颜色变化可以检测酶标记的探针。

也可应用分子标记对序列进行检测(tyagisandkramerfr.molecularbeacons:probesthatfluoresceuponhybridization[j].natbiotechnol,1996,14(3):303-8.)。设计一个跨越插入dna序列和相邻的基因组侧翼结合部位的fret寡核苷酸探针。该fret探针的独特结构导致其含有二级结构，该二级结构能够在近距离内保持荧光部分和淬灭部分。该fret探针和pcr引物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)在热稳定聚合酶和dntps存在下进行循环反应。经过成功的pcr扩增，fret探针和目标序列的杂交导致探针二级结构的丧失，从而使荧光部分和淬灭部分在空间上发生分离，产生荧光信号。荧光信号的产生代表了插入/侧翼序列的存在，其说明扩增和杂交是成功的。

其他描述的方法，例如微流体(microfluidics)提供了分离和扩增dna样品的方法和设备。光染料用于检测和测定特定的dna分子。包含用于检测dna分子的电子传感器或结合特定dna分子的纳珠并因而可被检测的纳试管(nanotube)设备对于检测本发明的dna分子是有用的。

可以使用本发明所述的组合物和dna检测领域描述的或已知的方法来开发dna检测试剂盒。所述试剂盒有利于鉴定样品中是否存在转基因玉米事件nd4403的dna，还可以用于培育含有转基因玉米事件nd4403的dna的玉米植物。所述试剂盒可以含有dna引物或探针，其同源于或互补于seqidno:1、2、3、4或5的至少一部分，或含有其它dna引物或探针，其同源于或互补于dna的转基因遗传元件中所含的dna，这些dna序列可以用于dna扩增反应，或作为dna杂交方法中的探针。在玉米基因组中含有的以及在表1中说明的转基因插入序列与玉米基因组结合部位的dna结构包含：位于转基因插入序列5’末端的玉米nd4403左侧翼基因组区域，来自载体的左侧边界区域的一部分插入序列，第一个表达盒由花椰菜花叶病毒的35s启动子(camv35spromoter)，可操作地连接到草丁膦(草铵膦)抗性基因序列(bar)上，并可操作地连接到花椰菜花叶病毒的35s终止子(camv35spolya)上而组成；第二个表达盒由玉米ubiquitin基因启动子(ubiquitinpromoter)，可操作地连接到玉米硝酸盐转运蛋白基因zmnar1.1a上，并可操作地连接到胭脂碱合成酶基因终止子(nosterminator)上而组成，来自载体的右侧边界区域的一部分插入序列，以及位于转基因插入序列3’末端的玉米植物nd4403右侧翼基因组区域(seqidno:5)。在dna扩增方法中，作为引物的dna分子可以是来源于转基因玉米事件nd4403中转基因插入序列的任何部分，也可以是来源于转基因玉米事件nd4403中侧翼玉米基因组的dna区域的任何部分。

转基因玉米事件nd4403可以与其他转基因玉米品种组合，例如除草剂(如草甘膦、麦草畏等)耐受性的玉米，或携带抗虫基因的转基因玉米品种。所有这些不同转基因事件的各种组合，与本发明的转基因玉米事件nd4403一起育种，可以提供多种性状的改良杂种转基因玉米品种。这些品种相比于非转基因品种和单性状的转基因品种可以表现出产量提升等更优异的特征。

本发明提供了一种用于检测玉米植物的核酸分子及其检测方法，转基因玉米事件nd4403具有高产和/或氮缺乏耐受性状。该性状的玉米植株表达硝酸盐转运蛋白zmnar1.1a蛋白，其赋予植物氮素高效利用性状从而增加产量和/或氮缺乏耐受性状(除草剂抗性基因bar作为转化阶段的筛选标记)。同时本发明检测方法中seqidno:1或其互补序列、seqidno:2或其互补序列、seqidno:3或其互补序列、seqidno:4或其互补序列、seqidno:5或其互补序列的核酸分子可以作为dna引物或探针以产生诊断为转基因玉米事件nd4403或其后代的扩增产物，且可以快速、准确、稳定的鉴定出来源于转基因玉米事件nd4403的植物材料的存在。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1重组表达载体pcambia1301-zmnrt1.1a的物理图谱。各元件英文及缩写含义列举如下：

t-border(left)t-dna左边界序列。

camv35spolya花椰菜花叶病毒(camv)的35s终止子。

bar编码pat蛋白，解除草铵膦毒性。

camv35spromoter花椰菜花叶病毒(camv)的35s启动子。

nosterminator胭脂碱合成酶基因的终止子。

zmnar1.1aanvp1基因cds。

ubiquitinpromoter玉米ubiquitin基因的启动子。

nosterminator胭脂碱合成酶基因的终止子。

t-border(right)t-dna右边界序列。

pvs1stapvs1质粒的质粒稳定位点。

pvs1reppvs1质粒的复制起始位点。

pbr322bompbr322质粒的bom位点。

pbr322oripbr322质粒的复制起始位点。

kanamycin(r)编码氨基糖苷磷酸转移酶蛋白，赋予细菌卡那霉素抗性。

图2转化事件特异性pcr验证结果。a：5’端扩增结果，片段预期大小559bp(seqidno:3)；b：3’端扩增结果，片段预期大小728bp(seqidno:4)。m：dl2000dnamarker；t：nd4403玉米材料；ck：非转基因玉米。

具体实施方式

本申请涉及的转化事件nd4403是指以玉米自交系y822为受体经过遗传转化后得到在特定基因组序列之间插入外源基因插入物(t-dna插入物)的玉米植株。在具体实施例中，转基因所用表达载体具有图1所示的物理图谱，所得到的t-dna插入物具有seqidno:5的第648-5737位核苷酸所示序列。转化事件nd4403可以指这一转基因过程，也可以指由这一过程所得到的基因组内的t-dna插入物与侧翼序列的组合，或可以指由这一转基因过程得到的玉米植株。在具体实例中，该事件也适用于同样的表达载体转化其他受体品种，从而将t-dna插入物插入到同样基因组位置而获得的植物。转化事件nd4403还可以指由上述植物进行无性繁殖、有性繁殖、减倍或加倍繁殖或以上的组合而得到的后代植物。

实施例1转化事件的获得和筛选

从玉米中克隆得到zmnrt1.1a基因的cdna序列，通过酶切连接插入中间载体pcambia1301-ubi，该中间载体已包含bar基因，最终构建成为pcambia1301-zmnrt1.1a表达载体，载体的物理图谱见图1。利用农杆菌侵染技术将重组质粒高效转化到吉林省农业科学院农业生物技术研究所自选系玉米y822幼胚中，获得了转zmnrt1.1a及bar基因玉米转化事件45个。其中，转基因玉米事件nd4403含有外源基因zmnrt1.1a和bar，表现出稳定的世代遗传性和突出的产量性状和氮缺乏耐受性，具有较好的应用前景。

其中外源zmnrt1.1a和bar基因的检测方法为：以玉米的基因组dna为模板，利用zmnrt1.1a和bar的特异性引物对进行pcr扩增，分别获得452bp大小(zmnrt1.1a基因)和441bp大小(bar基因)条带的材料为含有zmnrt1.1a基因和bar基因的植株。

表2zmnrt1.1a基因和bar基因pcr检测引物序列

实施例2转化事件nd4403的氮高效利用和产量性状鉴定

玉米zmnrt1.1a蛋白具有促进硝酸盐吸收功能。本发明采用组成型表达方式在玉米中表达zmnrt1.1a蛋白，通过提高玉米硝酸盐吸收的能力，进而提高玉米氮素利用效率，最终提高产量。本发明对nd4403植株大田生长形态及生理性状在不同的氮肥梯度下进行了鉴定。

试验地点在吉林省四平市公主岭市吉林省农业科学院转基因试验基地。试验土壤为沙壤土，地势平坦，耕层(20cm)土壤碱解氮含量125.94mg/kg，速效磷含量23.96mg/kg，速效钾含量149.24mg/kg，有机质含量25.22g/kg。小区行长5m，行距0.60m，株距0.25m，每个小区6行。

测试条件：参照农业农村部发布的《小麦、玉米、水稻三大粮食作物区域大配方与施肥建议(2013)》，高氮处理(hn)按照正常耕作的施肥量施入配方肥38kg/亩；中氮处理(mn)：施70％的配方肥，补充磷肥和钾肥与高氮处理相同；低氮处理(ln)不施配方肥，补充磷肥和钾肥与高氮处理相同。

实验设计：试验采用随机区组设计，每小区取长势大致相同的10株玉米，测定相关形态及生理指标，具体指标包括：穗重、穗长、穗行、百粒重、植株地上部全氮含量。

结果发现，玉米nd4403阳性植株在各种氮素供应条件下，穗重、穗长均显著高于阴性植株，增产效果显著。具体表现为低氮条件下穗重增加3.1％。在中氮条件下穗重增加17.2％、穗长增加5.0％、穗行数增加约1行。在高氮条件下穗重增加28.8％、穗长增加4.2％(详见表3)。这表明nd4403阳性植株对氮缺乏条件的耐受性好且具有增产特性。

表3nd4403和对照的农艺性状鉴定比较

在不同氮素条件下的植株茎秆全氮含量结果来看，nd4403在不同氮素条件下植株全氮含量均低于受体对照材料。尤其在高氮条件下，对照的茎秆全氮含量为3.00g/kg，而nd4403的全氮含量仅为2.00g/kg(表4)。这表明nd4403的氮素利用效率比野生型对照高，而这也是nd4403产量更高的原因。

表4nd4403和受体对照的植株茎秆全氮含量测定

实施例3转化事件nd4403外源序列的侧翼序列及玉米基因组插入位置

为了明确转化事件nd4403的身份特征，本发明进一步鉴定了nd4403外源序列在玉米基因组上的插入位点。

本发明采用第三代测序方法定位转基因玉米nd4403的t-dna插入位置。第三代测序技术利用英国牛津纳米孔公司(oxfordnanoporetechnologies，简称ont)的纳米孔测序技术对转化体nd4403进行重测序，测序深度10倍，数据平均读长为20kb，最长读长60kb，准确率为85％。

利用t-dna外源序列对三代测序结果进行blast检索比对，发现一条读长约为10kb的contg含有目标序列，这说明nd4403中的外源序列为单拷贝插入。测序获得的外源序列5’端647bp和3’端356bp基因组旁侧序列，分别在玉米公开基因组数据库(http://ensembl.gramene.org/zea_mays/info/annotation/#assembly)进行blast核酸-核酸比对，发现外源序列整合在玉米第3号染色体7866623-7866705位置处。

在插入位点的左边界，选取基因组上的647bp及外源插入序列设计引物对，使得f引物可结合基因组序列，r引物可结合外源插入序列，扩增产物融合一部分玉米基因组序列和一部分外源插入序列。或者在插入位点的右边界，选取基因组上的356bp及外源插入序列设计引物对，使得f引物可结合外源插入序列，r引物可结合基因组序列，扩增产物融合一部分外源插入序列和一部分玉米基因组序列。利用设计好的引物对nd4403进行pcr检测。以转基因玉米株系基因组dna为模板，进行pcr扩增。pcr反应在20μl体系中进行。扩增循环程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，tm退火30s，72℃延伸一定时间(按产物片段大小设置)，35个循环；72℃延伸5min。

根据侧翼序列和插入位置的结果分别利用基因组上游引物(seqidno:6)与载体左边界引物(seqidno:7)以及载体右边界引物(seqidno:8)与基因组下游引物(seqidno:9)对nd4403转化事件进行pcr扩增，以验证外源片段插入位置。结果见图2。结果证明nd4403外源片段稳定插入到第3号染色体7866623-7866705位置处。

实施例4转化事件nd4403的检测方法

可由转基因玉米事件nd4403进行育种，并用育成的新品种生产诸如农产品或商品。如果在所述农产品或商品中检测到足够的量，所述农产品或商品预期含有能够诊断转基因玉米事件nd4403材料在所述农产品或商品中存在的核苷酸序列。所述农产品或商品包括但不限于玉米油、玉米粗粉、玉米面、玉米面筋、玉米饼、玉米淀粉、以及将要作为食物源供动物消费的任何其它食品、或者另外作为膨大剂或化妆组合物中的成分用于化妆用途等。基于探针或引物对的核酸检测方法和/或试剂盒可以被开发以检测生物样品中是否含有转基因玉米事件nd4403的核酸分析，其中探针序列或引物扩增序列选自如seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4或seqidno:5中所示的序列，以诊断转基因玉米事件nd4403的存在。

其中一个检测方法为：

采用普通ctab法提取玉米样品的基因组dna，具体操作过程按农业部1485号公告-4-2010，转基因植物及其产品成分检测dna提取和纯化实施。其中，所述玉米样品包括待转基因玉米nd4403和非转基因玉米y822。利用pcr方法对nd4403植株中的特异性边界序列进行检测，所用的pcr引物对分别为seqidno:6和seqidno:7以及seqidno:8和seqidno:9，pcr反应体系：

反应程序为：

第2～4步：循环35次

取pcr产物于1％(w/v)1×tae琼脂糖凝胶中电泳检测，结果见图2。nd4403转化事件中可以扩增得到预期的目标条带(seqidno:3和seqidno:4)。而且该pcr方法能够追踪转化事件的存在，从而应用于育种工作。

综上所述，本发明转基因玉米事件nd4403具有较高的产量和/或对氮缺乏的耐受性，且检测方法可以准确快速的鉴定生物样品中是否包含转基因玉米事件nd4403的dna分子。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

序列表

<110>吉林省农业科学院

<120>一种用于检测玉米植物nd4403的核酸分子及其检测方法

<130>1

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>971

<212>dna

<213>人工合成(unknown)

<400>1

tctttatcagctataagtttcgctgaaggcttgagtccgttactactatcaaaacagcag60

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<212>dna

<213>人工合成(unknown)

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<210>4

<211>728

<212>dna

<213>人工合成(unknown)

<400>4