本发明属于医学基因工程及分子遗传学领域，尤其涉及用于检测乙型肝炎病毒的成套试剂与方法。
背景技术：
：：乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus,hbv)主要通过接触受感染者的血液或其它液体传播，可引起急性和慢性肝脏疾病。绝大多数为慢性感染，其中约5％最终发展成肝硬化或肝癌，每年约有一百万人死于hbv感染引起的各种终末期肝病。而我国hbv感染人群的比例则更高，据不完全统计约10％-20％。乙型肝炎病毒在繁殖的过程中其基因组核苷酸序列可发生变异，这种变异有时可导致病毒生物特性的变化。人群中存在着很多乙型肝炎病毒亚型，而这些亚型有的就是乙型肝炎病毒的变异株。目前国内通过基因测序可以检测的乙型肝炎病毒亚型为a、b、c、d、e、f、g、h8个基因型。感染不同基因型的患者，临床治疗和预后均有不同，研究hbv基因分型，对于发现新的hbv基因型及开展流行病学调查治疗等方面具有重要作用。细胞外乙型肝炎病毒dna是一种松弛环状的双链dna(relaxedcirculardna，rcdna)分子，其两条链均不是闭合的，其中负链较长，约3200个碱基，含有乙肝病毒基因组的全长基因，在其5’起始端与3’末端之间有一个数个碱基的“缺刻”(nick)；正链较短，有较大的“缺口”(gap)，其3’末端不固定，故长度是可变的，约为负链长度的50％～100％。在乙肝病毒的复制过程中，病毒dna进入宿主细胞核，在dna聚合酶的作用下，两条链的缺口均被补齐，形成超螺旋的共价、闭合、环状dna分子(covalentlyclosedcirculardna，cccdna)。cccdna是乙肝病毒前基因组rna复制的原始模板，虽然其含量较少，每个肝细胞内只有约5～50个拷贝，但对乙肝病毒的复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义，只有清除了细胞核内的cccdna，才能彻底消除乙肝患者病毒携带状态，是抗病毒治疗的目标。目前全球主要国家推荐的停药标准实质上基于两个方面，一是hbsag清除，二是持续性治疗应答。但现有停药标准在两个方面与此共识不协调。第一，以hbsag清除为标准，并不能完整和准确地反映cccdna的状况，主要原因之一是存在相当比例的患者存在hbvdna整合情况，这导致hbsag并不仅仅来源于cccdna。第二，基于传统检测指标来定义的“持续治疗应答”也不能足够准确地反映cccdna的状况，按照这些标准停药的患者中，有很高的复发比例。在临床实践中，第一方面的问题，导致原本可以停药的患者无法停药，第二方面的问题，导致不该停药的患者却错误地停止治疗。无疑，这些问题将导致社会资源浪费，损害患者福利。所以现在急需一种可以准确检测cccdna状况和hbvdna整合情况的检测方法。目前市面上，hbv核酸检测技术主要包括聚合酶链式反应-限制性酶切片断长度多态性、q-pcr以及pcr-反向点杂交法等。然而这些hbv核酸检测手段存在操作繁琐、通量低,无法检测hbv整合状态，无法检测hbv基因型及判定结果不确定等缺点。技术实现要素：本发明的一个目的是提供一种成套探针组。本发明提供的成套探针组，其由80条探针组成；所述80条探针为如下a1)-a3)中任一种：a1)所述80条探针分别为序列表中序列1至序列80所示的探针；a2)所述80条探针分别为序列表中序列1第16-135位至序列80中的第16-135位所示的探针；a3)将a1)或a2)中每条探针经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的探针。每条探针对应一条序列。上述成套探针组中，所述80条探针等摩尔质量混合。上述成套探针组中，所述每条探针的5’端均标记功能基团，在本发明的实施例中每条探针的5’端均标记生物素。上述成套探针组均可用于检测乙型肝炎病毒。本发明第二个目的是提供用于检测或辅助检测乙型肝炎病毒的试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括上述成套探针组。上述试剂盒还包括如下独立包装的含有引物1和引物2的富集缓冲液、杂交缓冲液、结合缓冲液、漂洗液1、漂洗液2、0.1mnaoh水溶液、1m且ph值为7.5的tris-hcl缓冲液、含有引物3和引物4的pcr反应液和te缓冲液中的至少一种；所述富集缓冲液包括人cot-1dna、鲑鱼精dna、引物1和引物2；所述引物1为序列表中序列81所示的单链dna，所述引物2为序列表中序列82所示的单链dna；所述杂交缓冲液包括nacl、柠檬酸钠、bsa和tween20；所述结合缓冲液包括nacl和edta；所述漂洗液1包括sds和ssc溶液；所述ssc溶液(即为1×ssc溶液)由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其在所述1×ssc溶液中的浓度分别为nacl175g/l和柠檬酸三钠88g/l，所述1×ssc溶液的ph值为7.4；所述漂洗液2包括sds和10倍稀释的ssc溶液；所述pcr反应液包括引物3和引物4；所述引物3和所述引物4的序列分别为序列表中序列83和序列84，所述te缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷和edta。上述试剂具体配方如下：所述富集缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为人cot-1dna、鲑鱼精dna、引物1和引物2，所述引物1为序列表中序列81所示的单链dna，所述引物2为序列表中序列82所示的单链dna；所述杂交缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为50mm-200mmtris-hcl(ph7.6)，所述溶质及其在所述杂交缓冲液中的浓度分别为1.25mnacl，0.125m柠檬酸钠，0.1g/100mlbsa，5％-10％(体积比)tween20；其中，所述50mm-200mmtris-hcl(ph7.6)由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷(tris)和用于调节ph的hcl，三羟甲基氨基甲烷的浓度为50mm-200mm，ph为7.6；所述结合缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为10mmtris-hcl(ph7.5)，所述溶质及其浓度分别为1mnacl，1mmedta；所述10mmtris-hcl(ph7.5)由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷(tris)和用于调节ph的hcl，三羟甲基氨基甲烷的浓度为10mm，ph为7.5。上述试剂盒中，所述富集缓冲液中所述溶质的含量分别可为invitrogen的人cot-1dna35％(体积比)、invitrogen的鲑鱼精dna15％(体积比)、所述引物10.5nmol/μl和所述引物20.5nmol/μl；所述杂交缓冲液中，所述溶剂为100mmtris-hcl(ph7.6)，所述溶质及其在所述杂交缓冲液中的浓度分别为1.25mnacl，0.125m柠檬酸钠，0.1g/100mlbsa，7％(体积比)tween20；所述100mmtris-hcl(ph7.6)由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷和用于调节ph的hcl，三羟甲基氨基甲烷的浓度为100mm，ph为7.6。所述漂洗液1由溶剂和溶质组成，所述溶剂为1×ssc溶液，所述溶质为sds，sds在所述漂洗液1中的质量百分比浓度为0.1％；所述1×ssc溶液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其在所述1×ssc溶液中的浓度分别为nacl175g/l和柠檬酸三钠88g/l，ph7.4；所述漂洗液2由溶剂和溶质组成，所述溶剂为0.1×ssc溶液，所述溶质为sds，sds在所述漂洗液2中的质量百分比浓度为0.1％；其中，所述0.1×ssc溶液为将所述1×ssc溶液稀释10倍得到的溶液；所述naoh溶液(0.1m)由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及在所述naoh溶液(0.1m)中的浓度为0.1mnaoh；所述tris-hcl缓冲液(1m，ph7.5)由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷和用于调节ph的hcl，三羟甲基氨基甲烷的浓度为1m，ph为7.5；所述pcr反应液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为1倍浓度的phusion缓冲液，所述溶质及其在所述pcr反应液中的浓度分别为0.2mmdatp、0.2mmdttp、0.2mmdctp、0.2mmdgtp、2.5pmol引物3、2.5pmol引物4、0.05u/μlhotstartphusion酶、5％(体积比)dmso；其中，所述1倍浓度的phusion缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为50mmtris-hcl(ph8.8)，所述溶质及其在所述1倍浓度的phusion缓冲液中的浓度分别为4mmmgcl2，500mmkcl，0.8％(v/v)nonidetp40；所述50mmtris-hcl(ph8.8)由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷和用于调节ph的hcl，三羟甲基氨基甲烷的浓度为50mm，ph为8.8；所述引物3和所述引物4的序列分别可为序列表中序列83和84，所述引物3和所述引物4的最后一位核苷酸均可带有硫代修饰；所述te缓冲液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质为三羟甲基氨基甲烷、edta和用于调节ph的hcl，三羟甲基氨基甲烷的浓度为10mm，edta的浓度为1mm，ph为8.0。所述1倍浓度的phusion缓冲液具体可为将newenglandbiolabs的5倍浓度的phusion缓冲液稀释5倍得到的溶液。所述hotstartphusion酶具体可为newenglandbiolabs产品。上述试剂盒中，探针组和各个试剂单独包装。上述成套探针组或上述试剂盒在制备具有如下b1)-b9)至少一种功能的产品中的应用：b1)检测或辅助检测待测患者是否携带乙型肝炎病毒；b2)检测或辅助检测待测患者携带乙型肝炎病毒分型种类；b3)检测或辅助检测待测样本中是否含有乙型肝炎病毒；b4)检测或辅助检测待测样本中乙型肝炎病毒分型种类；b5)检测或辅助检测乙型肝炎病毒分型种类；b6)检测或辅助检测待测患者或待测样本中乙型肝炎病毒的整合位点；b7)检测检测乙型肝炎病毒dna在人基因组中插入位点；b8)捕获乙型肝炎病毒dna；b9)检测乙型肝炎病毒基因组序列。本发明还有个目的是提供如下方法。本发明提供了下述任一方法：c1)捕获待测样本中乙型肝炎病毒dna的方法，包括：利用上述成套探针组或上述试剂盒(具体采用富集缓冲液、杂交缓冲液、结合缓冲液、漂洗缓冲液等)对待测样本的基因组dna进行捕获，得到捕获片段；实现捕获待测样本中乙型肝炎病毒dna；c2)检测乙型肝炎病毒基因组序列的方法，包括：利用上述成套探针组或上述试剂盒捕获待测样本中乙型肝炎病毒基因组dna，得到捕获到的基因组dna，对所述捕获到的基因组dna进行测序，得到乙型肝炎病毒基因组序列；测序前需要进行纯化(结合缓冲液、漂洗液1、漂洗液2、0.1mnaoh溶液、1m、ph7.5的tris-hcl缓冲液、te缓冲液)、pcr扩增(pcr反应液)、再次纯化(agencourtampurexp核酸纯化试剂盒)的步骤。c3)检测待测样本中乙型肝炎病毒分型种类的方法，包括：利用上述成套探针组或上述试剂盒捕获待测样本乙型肝炎病毒基因组dna，得到捕获到的基因组dna，对所述捕获到的基因组dna进行测序，得到待测样本乙型肝炎病毒基因组序列；测序前需要进行纯化(结合缓冲液、漂洗液1、漂洗液2、0.1mnaoh溶液、1m、ph7.5的tris-hcl缓冲液、te缓冲液)、pcr扩增(pcr反应液)、再次纯化(agencourtampurexp核酸纯化试剂盒)的步骤。将所述待测样本乙型肝炎病毒基因组序列与乙型肝炎病毒基因组参考序列进行比对，得到所述待测样本的乙型肝炎病毒分型种类；c4)检测乙型肝炎病毒dna在人基因组中插入位点的方法，包括：利用上述成套探针组或上述试剂盒捕获待测样本基因组dna，得到捕获到的基因组dna，对所述捕获到的基因组dna进行测序，得到测序序列；测序前需要进行纯化(结合缓冲液、漂洗液1、漂洗液2、0.1mnaoh溶液、1m、ph7.5的tris-hcl缓冲液、te缓冲液)、pcr扩增(pcr反应液)、再次纯化(agencourtampurexp核酸纯化试剂盒)的步骤。将所述测序序列与乙型肝炎病毒基因组参考序列以及人参考基因组序列(hg19基因组)进行比对，确定所述待测样本的乙型肝炎病毒dna在人基因组中的插入位点；所述乙型肝炎病毒分型可为hbva、b、c、d、e、f、g、h中的至少一种。本发明提供的用于检测乙型肝炎病毒的成套试剂，其在捕获乙型肝炎病毒基因组与测序中，可以区分其不同的分型，还可以确定乙型肝炎病毒dna是否整合到人基因组，若有整合情况，可以检测到具体的整合位点和整合序列，具有分型准确、可获得整合信息与拷贝数、灵敏度高等特点。利用本发明的成套试剂可以同时检测8种hbv基因型别。本发明的成套试剂可以应用于乙型肝炎及癌前病变筛查、治疗后残留或复发病变的预测以及进行相应的健康咨询、探究hbv致病机制等，符合精准医疗的发展趋势，意义非常重大。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna的5′末端核苷酸，末位均为相应dna的3′末端核苷酸。实施例1、检测乙型肝炎病毒的成套探针组与试剂盒的制备1、检测乙型肝炎病毒的成套探针组根据8种乙型肝炎病毒hbv基因型别设计用于识别这8种hbv基因型别的80条探针，这8种hbv基因型别分别为hbva、b、c、d、e、f、g、h，并且对探针调整和优化。这80条探针的核苷酸序列分别为序列表中序列1-80，每条序列的第16-135位用于识别乙型肝炎病毒，每条序列的第1-15位和第136-150位均相同，可以用来扩增探针，每条探针的5’端均标记生物素(与捕获富集纯化步骤中的myonec1链霉亲和素磁珠结合)。检测乙型肝炎病毒的成套探针组，由上述80条探针组成，且所有探针包装在一起，各探针的摩尔数均相等(等摩尔质量混合)。2、检测乙型肝炎病毒的试剂盒本实施例提供的检测乙型肝炎病毒的试剂盒由上述1的成套探针组和以下试剂组成：富集缓冲液、杂交缓冲液、结合缓冲液、漂洗液1、漂洗液2、naoh溶液(0.1m)、tris-hcl缓冲液(1m，ph7.5)、pcr反应液、te缓冲液。探针和各试剂单独包装。其中各溶液组成如下：(1)富集缓冲液：富集缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，各种溶质及其浓度分别为35％(体积百分比)人cot-1dna(invitrogen)、15％(体积百分比)鲑鱼精dna(invitrogen)、0.5nmol/μl引物1和0.5nmol/μl引物2。其中引物1和引物2(用来封闭文库两端引物)的序列如下：引物1：aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctct(序列表中序列81)；引物2：caagcagaagacggcatacgagatcggtctcggcattcctgctgaaccgc(序列表中序列82)。(2)杂交缓冲液：杂交缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为100mmtris-hcl(ph7.6)，各种溶质及其浓度分别为1.25mnacl，0.125m柠檬酸钠，0.001g/mlbsa和7％(体积比)tween20；其中，100mmtris-hcl(ph7.6)由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为浓度为100mm三羟甲基氨基甲烷(tris)，用hcl调节ph值为7.6。(3)结合缓冲液：结合缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为10mmtris-hcl(ph7.5)，各种溶质及其浓度分别为1mnacl和1mmedta；10mmtris-hcl(ph7.5)由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为三羟甲基氨基甲烷(tris)，tris的浓度为10mm，用hcl调节ph值为7.5。(4)漂洗液1：漂洗液1由溶剂和溶质组成，溶剂为1×ssc溶液，溶质为质量百分比浓度为0.1％的sds。其中，1×ssc溶液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其在1×ssc溶液中的浓度分别为175g/lnacl和88g/l柠檬酸三钠，ph7.4。(5)漂洗液2：漂洗液2由溶剂和溶质组成，溶剂为0.1×ssc溶液，溶质为质量百分比浓度为0.1％sds；其中，0.1×ssc溶液为将1×ssc溶液稀释10倍得到的溶液。(6)naoh溶液(0.1m)naoh溶液(0.1m)由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度为0.1mnaoh。(7)tris-hcl缓冲液(1m，ph7.5)tris-hcl缓冲液(1m，ph7.5)由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为1m三羟甲基氨基甲烷(tris)，用hcl调节ph值为7.5。(8)pcr反应液：pcr反应液由溶剂和溶质组成，溶剂为1倍浓度的phusion缓冲液(newenglandbiolabs)，溶质及其浓度分别为0.2mmdatp、0.2mmdttp、0.2mmdctp、0.2mmdgtp、2.5pmol/μl引物3、2.5pmol/μl引物4、0.05u/μlhotstartphusion酶(newenglandbiolabs)、5％(体积百分比)dmso；其中，1倍浓度的phusion缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为50mmtris-hcl(ph8.8)，溶质及其浓度分别为4mmmgcl2、500mmkcl和0.8％(体积百分含量)nonidetp40；50mmtris-hcl(ph8.8)由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为50mm三羟甲基氨基甲烷(tris)，用hcl调节ph值为8.8。其中，引物序列如下：引物3：aatgatacggcgaccaccga*g(序列表中序列83)；引物4：caagcagaagacggcatacg*a(序列表中序列84)；*表示硫代修饰。(9)te缓冲液te缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为10mmtris和1mmedta，用hcl调节ph值为8.0。实施例2、检测乙型肝炎病毒基因型的方法的建立本发明利用实施例1的试剂盒中的探针组和试剂检测乙型肝炎病毒的方法如下：1、全基因组文库的制备经患者知情同意，提取hbv病毒感染个体的血清的cfdna，总量10ngdna，利用kapahyperprip文库构建试剂盒(货号为kk8504)构建cfdna文库。所用接头的两条单链dna的序列如下：单链dna1：aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct单链dna2：agatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacnnnnnnnnatctcgtatgccgtcttctgcttg，其中，n为a、t、c或g。2、hbv基因片段的特异性捕获及测序捕获富集：1)取步骤1的cfdna文库，向其中加入13μl富集缓冲液和5μl成套探针组溶液(该溶液为利用水溶解实施例1的成套探针组得到的液体，该溶液中探针的总浓度为100ng/μl)，将得到的反应体系置于pcr仪上，反应条件为95℃7min，之后65℃2min，反应结束得到反应产物；2)将65℃预热的杂交缓冲液23μl加入到上述步骤1)得到的反应产物中,然后于pcr仪上65℃杂交22小时，得到富集体系混合物；纯化：3)将myonec1链霉亲和素磁珠(invitrogen)漩涡震荡使磁珠充分悬浮，取50μlmyonec1链霉亲和素磁珠到新的1.5ml的离心管；4)将步骤3)的装有50μlmyonec1链霉亲和素磁珠的1.5ml离心管漩涡震荡至少5s，使磁珠充分悬浮，短暂离心后放入磁力架上保持静止一分钟(不要旋转离心管)，小心吸弃上清；5)取下步骤4)的离心管，向其中加入50μl结合缓冲液，漩涡震荡至少5s，短暂离心后放入磁力架上静止一分钟，小心吸弃上清，重复三次；6)取下步骤5)的离心管，向其中加入100μl的2倍浓度的结合缓冲液(即将实施例1中结合缓冲液的各溶质浓度加倍得到的溶液，即2倍浓度的结合缓冲液中各溶质浓度为实施例结合缓冲液相应溶质浓度的2倍)，漩涡震荡至少5s，短暂离心后放入磁力架上静止一分钟；7)将步骤2)得到的富集体系混合物加入到骤6)处理后的离心管中，漩涡震荡至少5s，然后置于旋转仪上室温旋转1小时(60转/分钟)；8)步骤7)完成后，利用漂洗液1室温清洗步骤7)的磁珠一次，15分钟，然后再用漂洗液2于65℃下清洗3次，每次15分钟；9)步骤8)完成后，将磁珠用naoh溶液(0.1m)室温下洗脱10分钟，然后将得到的洗脱液漩涡震荡至少5s，短暂离心后放入磁力架上静止一分钟，然后将上清液转移到含有70μltris-hcl缓冲液(1m，ph7.5)的干净离心管中，即得到dna溶液；10)采用qiagenminelutecolumn(qiagen产品)对步骤9)得到的dna溶液进行纯化，将得到dna利用te缓冲液溶解，得到纯化dna溶液；pcr扩增：11)向30μl步骤10)得到的纯化dna溶液中加入70ulpcr反应液进行pcr扩增，得到pcr产物；pcr反应条件为：98℃30s，1个循环；98℃25s,65℃30s,72℃30s，15个循环；72℃5min，1个循环；纯化：12)利用agencourtampurexp核酸纯化试剂盒(beckmancoulter)纯化步骤11)的pcr产物，得到纯化产物。测序：13)将步骤12)得到的纯化产物在illuminanextseq500测序仪上进行测序，所用测序引物为测序引物1和测序引物2，测序引物1：aatgatacggcgaccaccga；测序引物2：caagcagaagacggcatacgagat。3、生物信息学分析流程及结果输出根据步骤2的测序结果对hbv病毒分型和确定hbv病毒的整合位点：(1)hbv病毒分型分析流程①获取测序原始序列；②数据预处理：去除测序数据中的防污染接头和低质量数据等，所用到的参数：-m40-q10,10-o6-e0.08，具体参数含义参考：http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/；③用bwa工具将预处理后数据与所有hbv参考基因组进行比对，所用到的参数：bwamem-m，具体参数含义参考：http://bio-bwa.sourceforge.net/bwa.shtml④统计测序结果信息，确定hbv病毒域覆盖大小、平均测序深度以及hbv病毒的分型等；得到hbv病毒分型。(2)hbv病毒整合分析流程①根据步骤(1)的分型信息，选取每种型比对最优株型作为hbv-integration分析参考基因组；②筛选后数据与人参考基因组序列hg19和hbv-integration分析参考基因组进行bwamem比对，得到比对bam结果，所用到的参数：bwamem-m，具体参数含义参考：http://bio-bwa.sourceforge.net/bwa.shtml；③根据比对bam结果，用svdetect分析structralvariations，得到初步整合位点区域，具体参数含义参考：http://svdetect.sourceforge.net/site/manual.html；④用crest分析hbv整合位点，将crest分析结果和svdetect分析结果整合，得到hbv病毒整合结果。实施例3、利用实施例1的试剂盒检测hbv分型结果利用实施例1的试剂盒检测11例hbv患者(均经患者知情同意)的hbv基因型别，按照实施例2的方法进行。结果证实，实施例1的试剂盒对hbv基因具有高捕获率，目标区域(hbv基因)的平均有效测序read量达到20mb，目标区域(hbv基因)的平均测序深度为1000x以上(见表1)，检测到不同患者感染的hbv基因型别如表1所示，所检测到的患者感染的hbv基因型别均为中国大陆常见的hbv基因型别。表1为利用本发明试剂盒对12例乙型肝炎患者检测的hbv分型结果用之江乙型肝炎病毒(hbv)基因分型测定试剂盒(荧光pcr法)(国食药监械(准)字2011第3400126号)检测以上样本，所检测各样本的hbv基因型别与利用实施例1的试剂盒检测结果完全一致。其中检测到病毒整合到人基因组的样本及整合位点如下表2所示。表2为利用本发明试剂盒对部分乙型肝炎患者检测到的hbv整合情况上述表中每列分别为如下：第1列为样品编号，第2列为整合到人基因组上的hbv病毒的转录基因名称，第3列和第4列为整合到人基因组上的hbv的转录基因的genbankid和该基因的断点，代表病毒整合位点位置，第5列为hbv整合到人基因组上的染色体及染色体上的位置，代表人整合位点位置。分别在每个插入位点的上下游设计引物，并对插入位点进行pcr扩增与sanger测序，引物序列如表3所示。结果显示，利用实施例1的试剂盒得到的结果与sanger测序的结果完全一致。表3为引物序列样品编号正向引物(5’-3’)反向引物(5’-3’)18c067260tgttcacctcaccatacggcttgtgtgctcctgtgaggtg18c067260agttcatttattttagcctagaactcaacagcaacatgagggaaaca19c045736accagatggattcacagccgggaggagttggtggaggaga19c045736tgtactaggaggctgtaggcaaccagatggattcacagccg19c045736atctcctcccccaactcctcccatgggacccctctgattg25ycgttcacggtggtctccatgaccgtgttgtctgagctgaa2018-r-hbv-5tgtggaggcacagacattcccgacgcaccatgcaactttt2018-r-hbv-4tgtggaggcacagacattccataagcagagctcgtcgacg39ygctgaaagggcctagagcaaagcccagtaaagtttcccacc39ytaccgtccccttcttcgacttcagaaaatggggtgggcaa上述结果表明，本发明的试剂盒同时可以实现hbv基因分型和整合位点检测。sequencelisting<110>迈基诺(重庆)基因科技有限责任公司<120>用于检测乙型肝炎病毒的成套试剂与方法<160>84<170>patentinversion3.5<210>1<211>150<212>dna<213>artificialsequence<400>1gactacatgggacatctccaccacattccaccaagctctgctacaccccagagtaagggg60cctatactttcctgctggtggctccagttccggaacagtaaaccctgttccgactactgc120ctctcccatatcgtcggaacctacgacgta150<210>2<211>150<212>dna<213>artificialsequence<400>2gactacatgggacatttccacaacatttcaccaagctctgcaggatcccagagtaagagg60cctgtattttcctgctggtggctccagttccggaacagtgaaccctgttccgactactgc120ctcactcatctcgtcggaacctacgacgta150<210>3<211>150<212>dna<213>artificialsequence<400>3gactacatgggacatctccaccacgttccaccaaactcttcaagatcccagagtcagggc60tctgtactttcctgctggtggctccagttcaggaacagtaaaccctgttcagaacactgc120ctcttccatatcgtcggaacctacgacgta150<210>4<211>150<212>dna<213>artificialsequence<400>4gactacatgggacatctcaactcagttccaccaggctctgttggatccgagggtaagggc60tctgtattttcctgctggtggctccagttcagggacacagaaccctgctccgactattgc120ctctctcacatcatcggaacctacgacgta150<210>5<211>150<212>dna<213>artificialsequence<400>5gactacatgggacatctctacagcattccaccaagctctacaaaatcccaaagtcagggg60cctgtattttcctgctggtggctccagttcagggatagtgaaccctgttccgactattgc120ctctcacatctcgtcggaacctacgacgta150<210>6<211>150<212>dna<213>artificialsequence<400>6gactacatgggacatatggctgctaggttgtactgccaactggattcttcgagggacgtc60ctttgtttacgtcccgtcggcgctgaatcccgcggacgacccctcgcgaggccgcttggg120gctgtatcgtcccctggaacctacgacgta150<210>7<211>150<212>dna<213>artificialsequence<400>7gactacatgggacataactccaccactttccaccaaactcttcaagatcccagagtcagg60gccctgtactttcctgctggtggctccagttcaggaacagtgagccctgctctgaatact120gtctctgccatatcgggaacctacgacgta150<210>8<211>150<212>dna<213>artificialsequence<400>8gactacatgggacatctctacagcattccaccaagctctacaaaatcccaaagtcagggg60cctgtattttcctgctggtggctccagttcagggatagtgaaccctgttccgactattgc120ctctcacatctcgtcggaacctacgacgta150<210>9<211>150<212>dna<213>artificialsequence<400>9gactacatgggacatctcaacccagttccaccaggccttgttggatccgagggtaagggc60tctgtattttcctgctggtggctccagttcagagacgcagaaccctgctccgactattgc120ctctctcacatcatcggaacctacgacgta150<210>10<211>150<212>dna<213>artificialsequence<400>10gactacatgggacatctctacagcattccaccaagctctacaaaatcccaaagtcagggg60cctgtattttcctgctggtggctccagttcagggatagtgaaccctgttccgactattgc120ctctcacatctcgtcggaacctacgacgta150<210>11<211>150<212>dna<213>artificialsequence<400>11gactacatgggacatgaactcaacacagttccaccaagcactgttggatccgagagtcag60gggtctgtattttcctgctggtggctccagttcagaaacacagaaccctgttccgactat120tgcctctctcacatcggaacctacgacgta150<210>12<211>150<212>dna<213>artificialsequence<400>12gactacatgggacatgaactcaacacagttccaccaagcactgttggatccgagagtaag60gggtctgtatcttcctgctggtggctccagttcagaaacacagaaccctgttccgactat120tgcctctctcacatcggaacctacgacgta150<210>13<211>150<212>dna<213>artificialsequence<400>13gactacatgggacatgaactcaacacagttccaccaagcactgttggatccgagagtaag60gggtctgtattttcctgctggtggctccagttcagaaacacagaaccctgctccgactat120tgcctctctcacatcggaacctacgacgta150<210>14<211>150<212>dna<213>artificialsequence<400>14gactacatgggacatctcgaggactggggaccctgcaccgaacatggagagcacaacatc60aggattcctaggacccctgctcgtgttacaggcggggtttttcttgttgacaagaatcct120cacaataccacagagggaacctacgacgta150<210>15<211>150<212>dna<213>artificialsequence<400>15gactacatgggacatctccaccactttccaccaaactcttcaagatcccagagtcagggc60tctgtactttcctgctggtggctccagttcaggaacagtaagccctgctcagaatactgt120ctcagccatatcgtcggaacctacgacgta150<210>16<211>150<212>dna<213>artificialsequence<400>16gactacatgggacataactccacaaccttccaccaaactctgcaagatcccagagtgaga60ggcctgtatctccctgctggtggctccagttcaggaacagtaaaccctgttccgactact120gtctctcccatatcgggaacctacgacgta150<210>17<211>150<212>dna<213>artificialsequence<400>17gactacatgggacatcatgcaactttttcacctctgcctaatcatctcttgtacatgtcc60cactgttcaagcctccaagctgtgccttgggtggctttggggcatggacattgaccctta120taaagaatttggagcggaacctacgacgta150<210>18<211>150<212>dna<213>artificialsequence<400>18gactacatgggacatctccacaacattccaccaagctctgctagatcccagagtgagggg60cctatattttcctgctggtggctccagttccggaacagtaaaccctgttccgactactgc120ctcacccatatcgtcggaacctacgacgta150<210>19<211>150<212>dna<213>artificialsequence<400>19gactacatgggacatttccactgccttccaccaagctctgcaagaccccagagtcagggg60tctgtattttcctgctggtggctccagttcaggaacagtaaaccctgctccgaatattgc120ctctcacatctcgtcggaacctacgacgta150<210>20<211>150<212>dna<213>artifi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技术特征：1.成套探针组，其由80条探针组成；
所述80条探针为如下a1)-a3)中任一种：
a1)所述80条探针分别为序列表中序列1至序列80所示的探针；
a2)所述80条探针分别为序列表中序列1第16-135位至序列80中的第16-135位所示的探针；
a3)将a1)或a2)中每条探针经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的探针。
2.根据权利要求1所述的成套探针组，其特征在于：所述80条探针等摩尔质量混合。
3.根据权利要求1所述的成套探针组，其特征在于：所述每条探针的5’端均标记有功能基团。
4.用于检测或辅助检测乙型肝炎病毒的试剂盒，包括权利要求1-3中任一所述成套探针组。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括如下独立包装的含有引物1和引物2的富集缓冲液、杂交缓冲液、结合缓冲液、漂洗液1、漂洗液2、0.1mnaoh水溶液、1m且ph值为7.5的tris-hcl缓冲液、含有引物3和引物4的pcr反应液和te缓冲液中的至少一种；
所述富集缓冲液中的溶质包括人cot-1dna、鲑鱼精dna、引物1和引物2；
所述引物1为序列表中序列81所示的单链dna，所述引物2为序列表中序列82所示的单链dna；
所述杂交缓冲液包括nacl、柠檬酸钠、bsa和tween20；
所述结合缓冲液包括nacl和edta；
所述漂洗液1包括sds和ssc溶液；
所述漂洗液2包括sds和10倍稀释的ssc溶液；
所述pcr反应液包括引物3和引物4；
所述引物3和所述引物4的序列分别为序列表中序列84和85，
所述te缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷和edta。
6.权利要求1-3任一所述成套探针组或权利要求4-5中任一所述试剂盒在制备具有如下b1)-b9)至少一种功能的产品中的应用：
b1)检测或辅助检测待测患者是否患有乙型肝炎病毒；
b2)检测或辅助检测待测患者乙型肝炎病毒分型种类；
b3)检测或辅助检测待测样本中是否含有乙型肝炎病毒；
b4)检测或辅助检测待测样本中乙型肝炎病毒分型种类；
b5)检测或辅助检测乙型肝炎病毒分型种类；
b6)检测或辅助检测待测患者或待测样本中乙型肝炎病毒的整合位点；
b7)检测检测乙型肝炎病毒dna在人基因组中插入位点；
b8)捕获乙型肝炎病毒dna；
b9)检测乙型肝炎病毒基因组序列。
7.下述任一方法：
c1)捕获待测样本中乙型肝炎病毒dna的方法，包括：利用权利要求1-3任一所述成套探针组或权利要求4-55中任一所述试剂盒对待测样本的基因组dna进行捕获，得到捕获片段；实现捕获待测样本中乙型肝炎病毒dna。
c2)检测乙型肝炎病毒基因组序列的方法，包括：利用权利要求1-3任一所述成套探针组或权利要求4-5中任一所述试剂盒捕获待测样本中乙型肝炎病毒基因组dna，得到捕获到的基因组dna，对所述捕获到的基因组dna进行测序，得到乙型肝炎病毒基因组序列；
c3)检测乙型肝炎病毒分型的方法，包括：利用权利要求1-3任一所述成套探针组或权利要求4-5中任一所述试剂盒捕获待测样本乙型肝炎病毒基因组dna，得到捕获到的基因组dna，对所述捕获到的基因组dna进行测序，得到待测样本乙型肝炎病毒基因组序列；将所述待测样本乙型肝炎病毒基因组序列与乙型肝炎病毒基因组参考序列进行比对，得到所述待测样本的乙型肝炎病毒分型；
c4)检测乙型肝炎病毒dna在人基因组中插入位点的方法，包括：利用权利要求1-3任一所述成套探针组或权利要求4-5中任一所述试剂盒捕获待测样本基因组dna，得到捕获到的基因组dna，对所述捕获到的基因组dna进行测序，得到测序序列；将所述测序序列与乙型肝炎病毒基因组参考序列以及人参考基因组序列进行比对，确定所述待测样本的hbvdna在人基因组中的插入位点。
8.根据权利要求6所述的应用或权利要求7所述的方法，其特征在于：所述乙型肝炎病毒分型为hbva、b、c、d、e、f、g和h中的至少一种。
技术总结本发明公开了用于检测乙型肝炎病毒的成套试剂与方法。本发明公开的用于检测乙型肝炎病毒的成套试剂由80条探针组成，这80条探针的序列为序列表中序列1‑80，序列1‑80的每条序列的第1‑15位和第136‑150位均相同，可用于扩增所述80条探针；每条探针的5’端均可标记有生物素。本发明的成套试剂在捕获乙型肝炎病毒基因组与测序中，可以区分其不同的分型，还可以确定其DNA是否整合到人基因组，且具有分型准确、可获得整合信息、灵敏度高等特点，符合精准医疗的发展趋势，意义非常重大。
技术研发人员：伍建
受保护的技术使用者：迈基诺(重庆)基因科技有限责任公司
技术研发日：2020.12.09
技术公布日：2021.03.12
