本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重荧光pcr检测试剂盒及使用方法。
背景技术：
非洲猪瘟(africanswinefever，asf)是由非洲猪瘟病毒(africanswinefevervirus，asfv)引起的一种传染病，家猪感染后发病率严重，死亡率高，目前尚无有效药物和疫苗防控，猪场一旦发病损失惨重，该病在世界范围广泛流行，给全球养猪业造成严重的经济损失。
猪传染性胸膜肺炎(porcinecontagiouspleuropneumonia，pcp)是由胸膜肺炎放线杆菌(actiuobacilluspleuropueumouiae，app)引起的一种猪呼吸道传染病，各日龄猪均可感染，是导致育肥猪和种猪突然死亡的主要原因之一。猪场一旦感染app，则很难净化，治疗难度较大，且该疾病常与其他疾病混合感染发生，给全球的养猪业造成了严重的经济损失。
非洲猪瘟和猪传染性胸膜肺炎均能引起肥猪口鼻出血、突然死亡，两者的症状相似，因此，在发生猪口鼻出血死亡大猪的情况时，容易产生恐慌，而由于非洲猪瘟具有强传染性，因此，不会对死亡猪进行剖检，导致死亡病因难以查出，进而导致补救措施难以正确实施。
染料法荧光pcr与taqman探针法荧光pcr技术相比成本低，应用广泛，适用的pcr仪类型和范围广，结合熔解曲线分析，可区分不同pcr产物，可实现多种病原检测，是病毒核酸检测的重要方法，当前国内外均没有对非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌同时检测双重荧光pcr检测试剂盒，因此，本发明的研究对非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌的检测具有重要意义。
技术实现要素：
针对现有技术的上述不足，本发明提供了非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重荧光pcr检测试剂盒及使用方法，在该试剂盒中，使用了荧光染料lygreen，引物的核苷酸序列为seqidno.1至seqidno.4所示的特定序列；4条引物之间不干扰，使该试剂盒具有敏感性和特异性高的优点；荧光染料lygreen的荧光信号更强、对pcr反应抑制性小、稳定好、耐冻融的优点，使该试剂盒具有适用性广、稳定性高的优点；使用该试剂盒，可一次性完成对非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌检测，使检测过程更加简单、易于操作。
本发明的技术方案如下：
非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重lygreen荧光pcr检测试剂盒，包含核酸释放剂、反应预混液premixtaq、荧光染料lygreen、阴性对照、阳性对照以及引物混合液，引物混合液中，引物的核苷酸序列为seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4所示。
进一步的，seqidno.1和seqidno.2为用于非洲猪瘟病毒扩增的引物组，seqidno.1为上游引物，基因序列为ccaaagggctcctccact；seqidno.2为下游引物，基因序列为atggcatctatcaggttcactc。
进一步的，seqidno.3和seqidno.4为用于猪传染性胸膜放线杆菌扩增的引物组，seqidno.3为上游引物，基因序列为ccgtaggattgcgggtaa；seqidno.4为下游引物，基因序列为atccgaaccactaacagaca。
优选的，seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4所示的引物的浓度均为10pmol/μl，引物混合液中，seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4的摩尔比为1:1:1:1。
与目前常用的sybrgreenⅰ、lcgreenplus、evagreen等荧光染料相比，使用lygreen染料后获得的荧光信号更强，对pcr反应抑制性小，稳定好，耐冻融；获得的光谱与sybrgreenⅰ光谱类似，且在使用不同品牌qpcr仪器时，不需要改变光谱元件设置，也不需要改变操作步骤，使该试剂盒具有更广泛的应用前景。
优选的，核酸释放剂通过以下方法制备得到：
以纯化水、浓hcl、tris碱配制500mm/l的tris-hcl溶液，加入nacl，使nacl浓度达到150mm/l，加入乙二胺四乙酸二钠，使乙二胺四乙酸二钠浓度达到3mm/l，加入2％(质量体积比)的十二烷基磺酸钠、加入0.5％(质量体积比)的十二烷基硫酸锂和1％(质量体积比)的甜菜碱，混匀，即可。
优选的，阳性对照为含有seqidno.5所示基因序列的pmd-mgf质粒和seqidno.6所示基因序列的pmd-apxⅳ质粒组成的混合质粒(pmd-mgf/apxⅳ)，阴性对照为无核酶水。
优选的，pmd-mgf质粒与pmd-apxⅳ质粒的体积比为1:1。
优选的，seqidno.5所示基因序列为非洲猪瘟病毒mgf基因序列，如下：
cctttttgatagagggaacaccgaagctacgttgctaacgcaacatctcaagaagacagcggccaaagggctcctccactttgtgctagaaacgttaaaatacggcggcaacatagataccgtcctgacccaagccgtaaagtacaatcatagaaaacttttagattattttctgcgtcaactacctcgtaaacatattgaaaaacttttgttgctggccgtgcaggaaaagggcttctaaaaaaacattgaacttactgttgtcacatttaaactactccgtgaaacgcatcaaaaaactaccgcgctatgtgatagagtacgagtccaccttggtgataaagattttattaaaaaaaagagtgaacctgatagatgccatgttggaaaagatggt。
优选的，seqidno.6所示基因序列为猪传染性胸膜放线杆菌apxⅳ基因序列，如下：
attattaaaaaactatgggacagtggctcaattaagcatttatatcaagataaagatacgggcaaattaaaaccgattatttacggcacggccggcaacgacagtaagattgaaggcactaaaatcacccgtaggattgcgggtaaagaagttacgcttgatattgccaatcagaaaattgaaaaaggcgtgttagagaaattggggctgtctgttagtggttcggatatcattaaattgttgtttggagcattgactccaactttaaatagaatgttgctatca。
本发明中，根据genbank上发表的asfvmgf基因和appapxⅳ基因序列，应用dnastar软件进行序列分析，并分别设计特异性引物，分别对设计所得引物序列不断优化和调整，最终得到了用于asfv和app检测的引物组，同时通过对lygreen荧光pcr的扩增条件和引物浓度进行优化，获得较好的特异性和扩增效率。
上述检测试剂盒的使用方法，步骤如下：
(1)制备待测样本模板：于1.5ml离心管中加入猪脾脏研磨悬液样本100μl，然后加入100μl核酸释放剂，置恒温金属浴中，98℃加热5min，12000rpm离心1min，取20μl上清于灭菌离心管中，即可；
(2)荧光pcr扩增：荧光pcr总体系为20μl，其中，premixtaq10μl、引物混合液4μl、lygreen1μl、无核酸酶水3μl，加入到0.1ml扩增管中，平行3份，标记为扩增管a、扩增管b和扩增管c；
分别向扩增管a加入阴性对照2μl，向扩增管b中加入待检样本模板2μl，向扩增管c中加入阳性对照2μl，加样完成后，瞬时离心，置荧光pcr仪中进行扩增反应；
荧光pcr扩增条件为：95℃预变性3min；94℃变性20s；55℃退火20s；72℃延伸20s；40个循环，熔解曲线分析温度为60～97℃，温度变化速率为0.1℃/s；
(3)结果分析：循环结束后，经软件分析后得熔解曲线；
观察熔解曲线峰值(tm值)分析试验结果：若在tm＝89.27℃±0.5℃出现特异性峰，则判为非洲猪瘟病毒核酸阳性；若在tm＝83.47℃±0.5℃出现特异性峰，则判为猪传染性胸膜放线杆菌核酸阳性；若tm＝89.27℃±0.5℃和tm＝83.47℃±0.5℃均出现峰值，表明非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌混合感染。
相对于现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明提供的核酸释放剂，可从动物组织，血拭子样本中直接提取病原核酸获得模板，模板可直接用于后续荧光pcr扩增反应，避免了现有技术中模板获取需要有机溶剂抽提且仪器复杂的缺点，使模板制备过程简单、快速，且模板质量稳定可靠。
2、本发明提供的试剂盒，在一个体系中可同时检测非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌，且4条不同引物之间无相互干扰，提高了试剂盒检测的敏感性、准确性和特异性；另外，本发明通过熔解曲线分析判定结果，避免了现有技术中的电泳检测，使结果判定更加简单、直观。
3、本发明提供的试剂盒使用过程中，具有操作简单、无污染的优点，使该试剂盒具有实用性强的优点，该试剂盒具有良好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重lygreen实时荧光pcr检测敏感性图谱。
图2为非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重lygreen实时荧光pcr检测特异性图谱。
图3为实施例4和实施例5样品检测图谱。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1用于猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重lygreen荧光pcr检测方法的建立
1、引物的设计和引物混合液的制备
从genbank(基因库)查找asfv毒株mgf基因和app不同血清型apxⅳ基因序列，经序列比对，选取保守区域设计扩增引物对，序列如下：
用于非洲猪瘟病毒扩增的引物组为：
seqidno.1：上游引物ccaaagggctcctccact，
seqidno.2：下游引物atggcatctatcaggttcactc；
用于猪传染性胸膜放线杆菌扩增的引物组为：
seqidno.3：上游引物ccgtaggattgcgggtaa，
seqidno.4：下游引物atccgaaccactaacagaca；
上述引物组由通用生物系统(安徽)有限公司合成；
seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4所示的引物的浓度均为10pmol/μl，引物混合液中，seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4的摩尔比为1:1:1:1。
2、阳性对照质粒的制备
阳性对照为人工合成的含有非洲猪瘟病毒mgf基因序列(seqidno.5)的pmd-mgf质粒和含有猪传染性胸膜放线杆菌apxⅳ基因序列(seqidno.6)的pmd-apxⅳ质粒组成的混合质粒(简称为pmd-mgf/apxⅳ)，阴性对照品无核酸酶水；
pmd-mgf质粒与pmd-apxⅳ质粒的体积比为1:1；
seqidno.5所示基因序列为非洲猪瘟病毒mgf基因序列，如下：
cctttttgatagagggaacaccgaagctacgttgctaacgcaacatctcaagaagacagcggccaaagggctcctccactttgtgctagaaacgttaaaatacggcggcaacatagataccgtcctgacccaagccgtaaagtacaatcatagaaaacttttagattattttctgcgtcaactacctcgtaaacatattgaaaaacttttgttgctggccgtgcaggaaaagggcttctaaaaaaacattgaacttactgttgtcacatttaaactactccgtgaaacgcatcaaaaaactaccgcgctatgtgatagagtacgagtccaccttggtgataaagattttattaaaaaaaagagtgaacctgatagatgccatgttggaaaagatggt；
seqidno.6所示基因序列为猪传染性胸膜放线杆菌apxⅳ基因序列，如下：
attattaaaaaactatgggacagtggctcaattaagcatttatatcaagataaagatacgggcaaattaaaaccgattatttacggcacggccggcaacgacagtaagattgaaggcactaaaatcacccgtaggattgcgggtaaagaagttacgcttgatattgccaatcagaaaattgaaaaaggcgtgttagagaaattggggctgtctgttagtggttcggatatcattaaattgttgtttggagcattgactccaactttaaatagaatgttgctatca；
3、核酸释放剂的制备
以纯化水、浓hcl、tris碱配制500mm/l的tris-hcl溶液，加入nacl，使nacl浓度达到150mm/l，加入乙二胺四乙酸二钠，使乙二胺四乙酸二钠浓度达到3mm/l，加入2％(质量体积比)的十二烷基磺酸钠、加入0.5％(质量体积比)的十二烷基硫酸锂和1％(质量体积比)的甜菜碱，混匀，即可。
4、制备试剂盒
本发明试剂盒由以下组分组成：
核酸释放剂、反应预混液premixtaq、荧光染料lygreen、阴性对照，阳性对照以及引物混合液。
实施例2试剂盒敏感性分析
使用实施例1提供的试剂盒进行试验。
(1)制备pmd-mgf/apxⅳ标准溶液，分别根据pmd-mgf质粒和pmd-apxⅳ质粒标准品浓度计算拷贝数，pmd-mgf和pmd-apxⅳ质粒拷贝数分别为7.3×1010拷贝/μl和2.5×1010拷贝/μl；两种质粒分别10倍比系列梯度稀释，分别取106拷贝/μl～10-1拷贝/μl的pmd-mgf和pmd-apxⅳ质粒标准品，同等稀释度等量混合后做模板，具体如下：
溶液1：7.3×106拷贝/μl的pmd-mgf和2.5×106拷贝/μl的pmd-apxⅳ质粒标准品混合液；
溶液2：7.3×105拷贝/μl的pmd-mgf和2.5×105拷贝/μl的pmd-apxⅳ质粒标准品混合液；
溶液3：7.3×104拷贝/μl的pmd-mgf和2.5×104拷贝/μl的pmd-apxⅳ质粒标准品混合液；
溶液4：7.3×103拷贝/μl的pmd-mgf和2.5×103拷贝/μl的pmd-apxⅳ质粒标准品混合液；
溶液5：7.3×102拷贝/μl的pmd-mgf和2.5×102拷贝/μl的pmd-apxⅳ质粒标准品混合液；
溶液6：7.3×101拷贝/μl的pmd-mgf和2.5×101拷贝/μl的pmd-apxⅳ质粒标准品混合液；
溶液7：7.3×100拷贝/μl的pmd-mgf和2.5×100拷贝/μl的pmd-apxⅳ质粒标准品混合液；
溶液8：7.3×10-1拷贝/μl的pmd-mgf和2.5×10-1拷贝/μl的pmd-apxⅳ质粒标准品混合液；
(2)荧光pcr扩增：荧光pcr总体系为20μl，其中，premixtaq10μl、引物混合液4μl、lygreen1μl、无核酸酶水3μl，加入到0.1ml扩增管中，标记为1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、9#，待用；
将步骤(1)制备8个溶液分别取2μl后，分别加入1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#中，使用无核酸酶水替代步骤(1)的标准溶液，加入9#中；加样完成后，瞬时离心，置荧光pcr仪中进行扩增反应；
荧光pcr扩增条件为：95℃预变性3min；94℃变性20s；55℃退火20s；72℃延伸20s；40个循环，熔解曲线分析温度为60～97℃，温度变化速率为0.1℃/s，观察分析扩增结果；
(3)结果分析：循环结束后，经软件分析后得熔解曲线。
如图1所示，使用本发明提供的试剂盒对pmd-mgf的最低检测限度为7.3拷贝/μl，对pmd-apxⅳ的最低检测限度为2.5拷贝/μl，表明所建方法具有很好的敏感性。
实施例3试剂盒特异性分析
(1)准备模板：以质粒pmd-mgf/apxⅳ、质粒pmd-mgf、质粒pmd-apxⅳ、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、大肠杆菌、沙门氏菌、副猪嗜血杆菌、猪链球菌基因组作为模板，无核酸酶水作为对照，待用；
(2)荧光pcr扩增：荧光pcr总体系为20μl：premixtaq10μl，引物混合液4μl，lygreen1μl，无核酸酶水3μl，标记为1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、9#，10#、11#、12#待用；
将步骤(1)中的质粒pmd-mgf/apxⅳ、质粒pmd-mgf、质粒pmd-apxⅳ、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、大肠杆菌、沙门氏菌、副猪嗜血杆菌、猪链球菌、无核酸酶水分别加入1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、9#，10#、11#、12#扩增管中，加样完成后，瞬时离心，置荧光pcr仪中进行扩增反应；
荧光pcr扩增条件为：95℃预变性3min；94℃变性20s；55℃退火20s；72℃延伸20s；40个循环，熔解曲线分析温度为60～97℃，温度变化速率为0.1℃/s，观察分析扩增结果；
(3)结果分析：循环结束后，经软件分析后得熔解曲线。
如图2所示，质粒pmd-mgf/apxⅳ在tm＝89.27℃±0.5℃和tm＝83.47℃±0.5℃均出现峰值，质粒pmd-mgf在tm＝89.27℃±0.5℃出现特异性峰，质粒pmd-apxⅳ在tm＝83.47℃±0.5℃出现特异性峰，其余均为阴性，证明该方法特异性较好。
实施例4
使用实施例1提供的试剂盒对检测猪脾脏中的asfv和app，步骤如下：
(1)制备待测样本模板：于1.5ml离心管中加入猪脾脏研磨悬液样本100μl，然后加入100μl核酸释放剂，置恒温金属浴中，98℃加热5min，12000rpm离心1min，取20μl上清于灭菌离心管中，即可；
(2)荧光pcr扩增：荧光pcr总体系为20μl，其中，premixtaq10μl、引物混合液4μl、lygreen1μl、无核酸酶水3μl，加入到0.1ml扩增管中，平行3份，标记为扩增管a、扩增管b；
分别向扩增管a加入阴性对照2μl，向扩增管b中加入待检样本模板2μl，加样完成后，瞬时离心，置荧光pcr仪中进行扩增反应，程序设置许下：95℃预变性3min；94℃变性20s；55℃退火20s；72℃延伸20s；40个循环，熔解曲线分析温度为60～97℃，温度变化速率为0.1℃/s；
(3)结果分析：循环结束后，经软件分析后得熔解曲线，结合图3中的曲线1(标号1)观察分析扩增结果，结果为：本实施例提供的待检样本在tm＝89.27℃±0.5℃和tm＝83.47℃±0.5℃均出现峰值，表明非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌混合感染；图3中的曲线3(标号3)为阴性对照图谱。
实施例5
该实施例与实施例4的区别在于，在步骤(1)制备模板的过程中，离心管中加入猪鼻腔血拭子，本实施例中不再制作阴性对照，采用实施例4提供的阴性对照；血拭子样本和脾脏样本的主要区别在于病毒含量不同，在采用本发明提供的试剂盒检测后，结合图3的曲线2(标号2)观察分析扩增结果为：本实施例提供的待检样本在tm＝89.27℃±0.5℃和tm＝83.47℃±0.5℃均出现峰值，表明非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌混合感染。
通过实施例4和实施例5可以看出，本发明提供的试剂盒能够对不同来源的样品进行检测，且对不同样本均能有效检测。
可见，本发明通过的检测试剂盒，敏感性和特异性高，能够快速、准确的对非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌检测，且检测过程能够同时进行，即通过一次检测，可判断样品中是否含有非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌，采用荧光pcr检测，可实时观察样品的状况。
尽管通过参考优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。
序列表
<120>非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重荧光pcr检测试剂盒及使用方法
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>18
<212>dna
<213>system.data.datarowview
<400>1
ccaaagggctcctccact18
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<213>system.data.datarowview
<400>6
attattaaaaaactatgggacagtggctcaattaagcatttatatcaagataaagatacg60
ggcaaattaaaaccgattatttacggcacggccggcaacgacagtaagattgaaggcact120
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ttgtttggagcattgactccaactttaaatagaatgttgctatca285
1.非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重lygreen荧光pcr检测试剂盒，其特征在于，包含核酸释放剂、反应预混液premixtaq、荧光染料lygreen、阴性对照、阳性对照以及引物混合液，引物混合液中，引物的核苷酸序列为seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4所示。
2.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重lygreen荧光pcr检测试剂盒，其特征在于，seqidno.1和seqidno.2为用于非洲猪瘟病毒扩增的引物组，seqidno.1为上游引物，基因序列为ccaaagggctcctccact；seqidno.2为下游引物，基因序列为atggcatctatcaggttcactc。
3.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重lygreen荧光pcr检测试剂盒，其特征在于，seqidno.3和seqidno.4为用于猪传染性胸膜放线杆菌扩增的引物组，seqidno.3为上游引物，基因序列为ccgtaggattgcgggtaa；seqidno.4为下游引物，基因序列为atccgaaccactaacagaca。
4.如权利要求1～3任一项所述的非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重lygreen荧光pcr检测试剂盒，其特征在于，seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4所示的引物的浓度均为10pmol/μl，引物混合液中，seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4的摩尔比为1:1:1:1。
5.如权利要求4所述的非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重lygreen荧光pcr检测试剂盒，其特征在于，核酸释放剂通过以下方法制备得到：
以纯化水、浓hcl、tris碱配制500mm/l的tris-hcl溶液，加入nacl，使nacl浓度达到150mm/l，加入乙二胺四乙酸二钠，使乙二胺四乙酸二钠浓度达到3mm/l，加入2％(质量体积比)的十二烷基磺酸钠、加入0.5％(质量体积比)的十二烷基硫酸锂和1％(质量体积比)的甜菜碱，混匀，即可。
6.如权利要求1～3任一项所述的非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重lygreen荧光pcr检测试剂盒，其特征在于，阳性对照为含有seqidno.5所示基因序列的pmd-mgf质粒和seqidno.6所示基因序列的pmd-apxⅳ质粒组成的混合质粒，阴性对照为无核酸酶水。
7.如权利要求6所述的非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重lygreen荧光pcr检测试剂盒，其特征在于，pmd-mgf质粒与pmd-apxⅳ质粒的体积比为1:1。
8.如权利要求6所述的非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重lygreen荧光pcr检测试剂盒，其特征在于，seqidno.5所示基因序列为非洲猪瘟病毒mgf基因序列，如下：
cctttttgatagagggaacaccgaagctacgttgctaacgcaacatctcaagaagacagcggccaaagggctcctccactttgtgctagaaacgttaaaatacggcggcaacatagataccgtcctgacccaagccgtaaagtacaatcatagaaaacttttagattattttctgcgtcaactacctcgtaaacatattgaaaaacttttgttgctggccgtgcaggaaaagggcttctaaaaaaacattgaacttactgttgtcacatttaaactactccgtgaaacgcatcaaaaaactaccgcgctatgtgatagagtacgagtccaccttggtgataaagattttattaaaaaaaagagtgaacctgatagatgccatgttggaaaagatggt。
9.如权利要求6所述的非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重lygreen荧光pcr检测试剂盒，其特征在于，seqidno.6所示基因序列为猪传染性胸膜放线杆菌apxⅳ基因序列，如下：
attattaaaaaactatgggacagtggctcaattaagcatttatatcaagataaagatacgggcaaattaaaaccgattatttacggcacggccggcaacgacagtaagattgaaggcactaaaatcacccgtaggattgcgggtaaagaagttacgcttgatattgccaatcagaaaattgaaaaaggcgtgttagagaaattggggctgtctgttagtggttcggatatcattaaattgttgtttggagcattgactccaactttaaatagaatgttgctatca。
10.一种权利要求1～9任一项所述的非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重lygreen荧光pcr检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤如下：
(1)制备待测样本模板：于1.5ml离心管中加入猪脾脏研磨悬液样本100μl，然后加入100μl核酸释放剂，置恒温金属浴中，98℃加热5min，12000rpm离心1min，取20μl上清于灭菌离心管中，即可；
(2)荧光pcr扩增：荧光pcr总体系为20μl，其中，premixtaq10μl、引物混合液4μl、lygreen1μl、无核酸酶水3μl，加入到0.1ml扩增管中，平行3份，标记为扩增管a、扩增管b和扩增管c；
分别向扩增管a加入阴性对照2μl，向扩增管b中加入待检样本模板2μl，向扩增管c中加入阳性对照2μl，加样完成后，瞬时离心，置荧光pcr仪中进行扩增反应；
荧光pcr扩增条件为：95℃预变性3min；94℃变性20s；55℃退火20s；72℃延伸20s；40个循环；经软件分析后得熔解曲线，熔解曲线分析温度为60～97℃，温度变化速率为0.1℃/s；
(3)结果分析：循环结束后，观察熔解曲线峰值(tm值)分析试验结果：若在tm＝89.27℃±0.5℃出现特异性峰，则判为非洲猪瘟病毒核酸阳性；若在tm＝83.47℃±0.5℃出现特异性峰，则判为猪传染性胸膜放线杆菌核酸阳性；若tm＝89.27℃±0.5℃和tm＝83.47℃±0.5℃均出现峰值，表明非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌混合感染。
技术总结