本发明属于生物医学技术检测领域，涉及一种新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测方法及试剂盒。
背景技术：
2019新型冠状病毒(sars-cov-2)是引发新型冠状病毒肺炎(新冠肺炎，covid-19)的病原体。该病毒是一种具有29903个核苷酸的单链rna-β冠状病毒。国际病毒分类委员会(ictv)将新型冠状病毒(2019-ncov)的正式分类为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2，sars-cov-2)。世界卫生组织(who)宣布，由这一病毒导致的疾病的正式名称为covid-19。
该病毒在不到4个月的时间内就散布在210多个国家中，截至2020年6月28日，全世界报告的确诊病例超过1000万，死亡人数近50万。随着病毒的传播，其基因序列已经突变，世界各地出现越来越多的变异菌株，在相关统计中，收集到的48635个sars-cov-2完整基因组样品与原始病毒株相比，在每个样品中平均存在7.23个突变。其中单核苷酸突变是主要的突变类型，最突出的是sars-cov2spike蛋白中的d614g突变，实验表明：携带d614g突变的s-病毒在转导细胞上的效率比野生型s-病毒高8倍，d614g与另外三个突变组c14408t、c241t和c3037t这四个突变几乎总是在同一基因组中同时发生，从而定义了在病毒种群中观察到的主要进化枝g。同时还存在着其余的进化枝gh、gr。
所以，对于突变菌株的鉴定分类与追踪溯源显得尤为重要，目前在分子生物学检测手段上，基因测序最常用的方法。二代测序虽然操作简便，但测序成本贵，测序错误率高，同时依赖大型科研仪器与专业的生物信息分析人员，检测周期也比较长。因此需要一种快速准确检测突变的方法，用于检测临床标本中sars-cov-2病毒核酸突变序列。
当前，已有利用携带荧光报告基团探针检测新型冠状病毒两个碱基突变(8782c→t和28144t→c)的技术，但该技术所需试剂价格昂贵，单次实验耗量高，有效使用次数少，不适宜进行多次批量实验，并且灵敏度较低。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明的目的是为建立一种实现高效、快速、准确且经济的新冠肺炎病毒突变位点快速检测方法，本发明公开了一种pcr-dgge检测突变的试剂盒和检测方法。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
本发明提供一种新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测的引物组及dna片段，所述引物组(带gc夹子)包括：gc c241t-f、c241t-r、gc c3037t-f、c3037t-r、g11083t-f、g11083t-r、gc c14408t-f、c14408t-r、gc a23403g-f、a23403g-r、gc g25563t-f、g25563t-r、gc ggg28881aac-f、ggg28881aac-r，其序列依次如seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：11、seqidno：12、seqidno：13、seqidno：14所示；gc夹子的加入，确保了发生在dna片段中每个碱基处的序列差异都被区分开来。
所述dna片段包括突变后的dna片段及对应的原始dna片段，其中：突变后的dna片段包括c241t片段、c3037t片段、g11083t片段、c14408t片段、a23403g片段、g25563t片段、ggg28881aac片段，序列分别如seqidno：15、seqidno：16、seqidno：17、seqidno：18、seqidno：19、seqidno：20、seqidno：21所示；对应的原始dna片段包括c241片段、c3037片段、g11083片段、c14408片段、a23403片段、g25563片段、ggg28881片段，其序列分别如seqidno：22、seqidno：23、seqidno：24、seqidno：25、seqidno：26、seqidno：27、seqidno：28所示。
进一步，所述引物组及dna片段是通过化学合成的核苷酸片段。
本发明提供一种新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测的试剂盒，包括上述引物组和dna片段，pcr缓冲液。
进一步，所述pcr缓冲液包括：5μl
本发明还提供一种新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测方法，包括以下步骤：
步骤1，对阴性样本、dna片段及新冠肺炎病毒阳性样品分别进行pcr扩增，阴性样本pcr扩增产物作为待测样品的阴性对照，扩增后的dna片段作为待测样品的标准；新冠肺炎病毒阳性样品pcr扩增产物作为dgge检测的待测样品；
步骤2，对标准和待测样品进行dgge检测；
步骤3，dgge检测完毕后，将含有dna片段及样品的凝胶放入2.5×4sredplus染液中染色15分钟，拍照进行分析对比，当阳性待测样品条带与原始dna序列在dgge凝胶上处于同一水平位置时，说明阳性待测样品为未突变的新冠肺炎病毒阳性样品，当阳性待测样品条带与原始dna序列在dgge凝胶上不处于同一水平位置时，将其与突变dna序列比对来确定新冠肺炎病毒分型及突变类型。
进一步，所述的dgge检测的条件为：选择8％-10％的聚丙烯酰胺凝胶，胶变性范围为40％-60％，梯度混合制胶；电泳液温度上升至55℃时，先220v恒压预电泳5分钟，用50μl微量进样器快速上样，上样量为25μl；在55℃，200v条件下恒温恒压电泳8h。
变性梯度凝胶电泳(dgge)技术是检测dna片段中点突变的一种电泳技术。dgge的原理是根据dna在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的dna片段分开。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
本发明利用dgge技术，在保证检出率的基础上，操作简便快捷，时间短，成本低；同时检测具有特异性强、肉眼可直接判读和不依赖大型实验设备等优势，为快速准确检测新冠肺炎病毒的突变提供了简便、易操作、耗时短的平台。对于病毒地理种类的分布鉴定具有重大意义，可对病人的临床特征和病情发展进行预判，因此制定更具针对性的治疗方案。
附图说明
图1为本发明dna片段的dgge检测结果。
图2为本发明dna片段二次pcr扩增的凝胶电泳图。
图3为本发明dna片段阳性克隆验证结果图。
图4为本发明的检测结果图。
具体实施方式
下面结合本发明实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行具体、详细的说明。引物组和dna片段名称的命名规则为：原始核苷酸 突变位点 突变后的核苷酸。
实施例1
通过化学合成新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测的引物组及dna序列。
引物组的组成及其序列如下：
gc c241t-f(seqidno：1)、c241t-r(seqidno：2)，
gc c3037t-f(seqidno：3)、c3037t-r(seqidno：4)，
gc g11083t-f(seqidno：5)、g11083t-r(seqidno：6)，
gc c14408t-f(seqidno：7)、c14408t-r(seqidno：8)，
gc a23403g-f(seqidno：9)、a23403g-r(seqidno：10)，
gc g25563t-f(seqidno：11)、g25563t-r(seqidno：12)，
gc ggg28881aac-f(seqidno：13)、ggg28881aac-r(seqidno：14)；
dna片段包括突变后的dna片段及对应的原始dna片段，其中：
突变后dna片段包括c241t片段、c3037t片段、g11083t片段、c14408t片段、a23403g片段、g25563t片段、ggg28881aac片段，其对应的核苷酸序列依次如seqidno：15、seqidno：16、seqidno：17、seqidno：18、seqidno：19、seqidno：20、seqidno：21所示；
对应的原始dna片段包括c241片段、c3037片段、g11083片段、c14408片段、a23403片段、g25563片段、ggg28881片段，其对应的核苷酸序列依次如seqidno：22、seqidno：23、seqidno：24、seqidno：25、seqidno：26、seqidno：27、seqidno：28所示。
实施例2
1.将新冠肺炎病毒阳性样品rna反转录成dna。
pcr反应体系为：rnatemplate：1μl，forwardgsp：0.4μl，reversegsp：0.4μl，2×tsone-stepreactionmix：10μl，
pcr反应程序为：45℃25min，94℃5min，94℃30s，50-60℃30s，72℃1min，35个循环，72℃10min；
2.对阴性样本、化学合成的dna片段及反转录后的阳性样品dna利用上述对应的带gc夹子的引物组进行pcr扩增，阴性样本pcr扩增产物作为待测样品的阴性对照，dna片段扩增产物作为待测样品的标准；新冠肺炎病毒阳性样品pcr扩增产物作为dgge检测的待测样品。
pcr反应体系为：10*easytaqbuffer:5μl，dntps(2,5mm):4μl，gc f(10umol/l):1μl，r(10umol/l):1μl，easytaqdnapolymerase:1μl，模板dna：1μl，ddh2o:37μl；
pcr反应程序为：94℃5min，94℃30s，45～50℃30s，72℃30s，30个循环，72℃10min，12℃保存。
3.对作为标准的dna片段进行dgge检测及验证：
选择浓度为10％聚丙烯酰胺凝胶，胶变性范围为40％～60％，取40％、60％胶各16ml，分别加入50μl的temed及40μl的10％过硫酸铵，梯度混合制胶，凝胶时间至少3h；加样前，将电泳液温度上升至55℃时，后220v预电泳5min，pcr扩增产物上样量各25μl，后于55℃、200v条件下电泳8h；电泳完毕后，将胶放入2.5×4sredplus染液中染色15分钟，拍照观察，进行分析，见图1；
将特异性目的条带切下，放入无菌的ep管中，编号；用20μlddh2o浸泡胶条，并将胶条弄碎成小段，放于冰箱-20℃浸泡过夜，使用不含gc夹子的引物组再次进行pcr扩增，即第二次pcr扩增，扩增结果见图2，得到的pcr产物用生工生物工程(上海)股份有限公司琼脂糖凝胶dna回收试剂盒纯化回收，-20℃保存备用；
pcr反应体系为：10*easytaqbuffer:5μl，dntps(2,5mm):4μl，f(10umol/l):1μl，r(10umol/l):1μl，easytaqdnapolymerase:1μl，胶条浸泡液：2μl，ddh2o:36μl；
pcr反应程序为：94℃5min，94℃30s，45～50℃30s，72℃30s，30个循环，72℃10min，12℃保存运行；
不含gc夹子的引物组包括：
c241t-f(seqidno：29)、c241t-r(seqidno：2)，
c3037t-f(seqidno：30)、c3037t-r(seqidno：4)，
g11083t-f(seqidno：31)、g11083t-r(seqidno：6)，
c14408t-f(seqidno：32)、c14408t-r(seqidno：8)，
a23403g-f(seqidno：33)、a23403g-r(seqidno：10)，
g25563t-f(seqidno：34)、g25563t-r(seqidno：12)，
ggg28881aac-f(seqidno：35)、ggg28881aac-r(seqidno：14)；将上述纯化回收的dna片段按北京全式金生物技术有限公司的peasy-t3cloningkit方法进行克隆转化测序；克隆反应体系：pcr产物：4μl、cloningvector：1μl。将上述体系轻轻混合，25℃反应10min，反应结束后，将pcr管置于冰上，将上述体系加入50μl的刚解冻的dh5α感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min，42℃热激30s，立即置于冰上2min，加入250μl的lb培养基，200rpm、37℃培养1h。在此期间，取8μl的500mmiptg和40μl的20mg/mlx-gal混合，均匀地涂布在含amp 抗性的lb固体平板上，使iptg和x-gal充分吸收。4000rpm离心菌液1min，弃掉部分上清，悬浮菌体，涂布在准备好的平板上，放于37℃恒温培养箱中培养12h左右；
挑取白色单克隆菌落于amp 抗性的lb固体平板上备份菌种后，放入盛有10μl去离子水的ep管中，沸水浴煮样5min；取2μl沸水浴煮过的样液作模板进行pcr扩增，设阴性对照(以蓝色单克隆菌落为模板)；pcr产物于1.0％琼脂糖凝胶验证大小，片段大小在200-300bp之间的克隆子视为阳性克隆，pcr产物的1.0％琼脂糖凝胶验证图谱如图3；提取阳性克隆子质粒，后送出测序，测序结果与化学合成序列进行比对查看是否一致；
pcr反应体系为：10*easytaqbuffer:1μl，dntps(2,5mm):0.8μl，m13f(10umol/l):0.25μl，m13r(10umol/l):0.25μl，easytaqdnapolymerase:0.25μl，沸水浴煮过后的水样：2μl，ddh20:5.45μl；
pcr反应程序为：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃45s，30个循环，72℃10min，12℃保存。
挑取确定的阳性克隆接种于5ml的lb液体培养基(接种前加入5μl50mg/ml的amp)中，37℃，200rmp培养12～14h，用生工的sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒提取质粒，溶于40μl的去离子水中，-20℃保存备用；
实施例3
对新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测：
按实施例2中dgge的检测方法对验证正确的作为标准的dna片段和待测样品进行dgge检测。通过对阴性样本、原始、突变、待检测样本加以相同的上下游引物gc a23403gf和a23403gr，在同一条件下进行pcr得到大量扩增片段，通过dgge电泳，染色拍照，得到实验结果。
dgge电泳：选择浓度为10％聚丙烯酰胺凝胶，胶变性范围为40％～60％，取40％、60％胶各16ml，分别加入50μl的temed及40μl的10％过硫酸铵，梯度混合制胶，夏天室温凝固，冬天可放在37℃培养箱里凝固，若室温凝固，凝胶时间至少3h；待电泳液温度上升至55℃时，200v预电泳5min，用50μl微量进样器快速上样，上样量为25μl，后于55℃、200v条件下电泳8h；电泳完毕后，将胶放入2.5×4sredplus染液中染色15分钟，拍照观察，进行分析。
检测结果如图4。图中1号为未患病者(新冠肺炎病毒阴性)阴性对照，2号为原始序列，3号为待检测样品序列，4、5号为作标准的突变后dna片段，从图中可以看出待检测样本条带与突变条带在同一水平上，实验结果表明检测样品为突变样品，为g614分型。
实施例4
新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测的试剂盒，包括引物组，dna片段，pcr缓冲液。
引物组包括：gc c241t-f(seqidno：1)、c241t-r(seqidno：2)，gc c3037t-f(seqidno：3)、c3037t-r(seqidno：4)，g11083t-f(seqidno：5)、g11083t-r(seqidno：6)，gc c14408t-f(seqidno：7)、c14408t-r(seqidno：8)，gc a23403g-f(seqidno：9)、a23403g-r(seqidno：10)，gc g25563t-f(seqidno：11)、g25563t-r(seqidno：12)，gc ggg28881aac-f(seqidno：13)、ggg28881aac-r(seqidno：14)；
dna片段包括突变后的dna片段及对应的原始dna片段，其中：突变后的dna片段包括c241t片段(seqidno：15)、c3037t片段(seqidno：16)、g11083t片段(seqidno：17)、c14408t片段(seqidno：18)、a23403g片段(seqidno：19)、g25563t片段(seqidno：20)、ggg28881aac片段(seqidno：21)；对应的原始dna片段包括c241(seqidno：22)、c3037(seqidno：23)、g11083(seqidno：24)、c14408(seqidno：25)、a23403(seqidno：26)、g25563(seqidno：27)、ggg28881(seqidno：28)。
pcr缓冲液包括：5μl
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，都包含在本发明的保护范围之内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
序列表
seqidno：1
cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggcttctgcaggctgcttacg
seqidno：2
gttttctcgttgaaaccagg
seqidno：3
cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggctacttatttgatgagtc
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seqidno：5
cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggggtccagagtactcaatgg
seqidno：6
catcattgcaaaagcagac
seqidno：7
cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggggttttattctctacagtg
seqidno：8
ccagttgaaactacaaatggaacacc
seqidno：9
cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggttggtggtgtcagtgttat
seqidno：10
aggagtaagttgatctgcat
seqidno：11
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seqidno：12
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seqidno：13
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seqidno：14
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seqidno：15
cttctgcaggctgcttacggtttcgtccgtgttgcagccgatcatcagcacatctaggttttgtccgggtgtgaccgaaaggtaagatggagagccttgtccctggtttcaacgagaaaac
seqidno：16
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seqidno：17
gtccagagtactcaatggtctttgttcttttttttttatgaaaatgcctttttaccttttgctatgggtattattgc
seqidno：18
gttttattctctacagtgttcccacttacaagttttggaccactagtgagaaaaatatttgttgatggtgttccatttgtagtttcaactgg
seqidno：19
ttggtggtgtcagtgttataacaccaggaacaaatacttctaaccaggttgctgttctttatcagggtgttaactgcacagaagtccctgttgctattcatgcagatcaacttactcct
seqidno：20
acaagcctcactccctttcggatggcttattgttggcgttgcacttcttgctgtttttcatagcgcttccaaaatcataaccctcaaaaagagatggcaactagcactctccaagggtgtt
seqidno：21
cttctcgttcctcatcacgtagtcgcaacagttcaagaaattcaactccaggcagcagtaaacgaacttctcctgctagaatggctggcaatggcggtgatgctgctcttgctttgctgct
seqidno：22
cttctgcaggctgcttacggtttcgtccgtgttgcagccgatcatcagcacatctaggtttcgtccgggtgtgaccgaaaggtaagatggagagccttgtccctggtttcaacgagaaaac
seqidno：23
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seqidno：25
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seqidno：26
ttggtggtgtcagtgttataacaccaggaacaaatacttctaaccaggttgctgttctttatcaggatgttaactgcacagaagtccctgttgctattcatgcagatcaacttactcct
seqidno：27
acaagcctcactccctttcggatggcttattgttggcgttgcacttcttgctgtttttcagagcgcttccaaaatcataaccctcaaaaagagatggcaactagcactctccaagggtgtt
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cttctcgttcctcatcacgtagtcgcaacagttcaagaaattcaactccaggcagcagtaggggaacttctcctgctagaatggctggcaatggcggtgatgctgctcttgctttgctgct
seqidno：29
cttctgcaggctgcttacg
seqidno：30
ctacttatttgatgagtctgg
seqidno：31
gtccagagtactcaatggtc
seqidno：32
gttttattctctacagtgttccc
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ttggtggtgtcagtgttat
seqidno：34
acaagcctcactccctttc
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cttctcgttcctcatcacgtagtc
序列表
<110>山西大学
<120>新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测方法及试剂盒
<160>35
<170>siposequencelisting1.0
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<212>dna
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<212>dna
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<212>dna
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<213>人工序列(artificialsequence)
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<212>dna
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cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggttggtggtgtcagtgttat59
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gttgatggtgttccatttgtagtttcaactgg92
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<213>人工序列(artificialsequence)
<400>19
ttggtggtgtcagtgttataacaccaggaacaaatacttctaaccaggttgctgttcttt60
atcagggtgttaactgcacagaagtccctgttgctattcatgcagatcaacttactcct119
<210>20
<211>121
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>20
acaagcctcactccctttcggatggcttattgttggcgttgcacttcttgctgtttttca60
tagcgcttccaaaatcataaccctcaaaaagagatggcaactagcactctccaagggtgt120
t121
<210>21
<211>121
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>21
cttctcgttcctcatcacgtagtcgcaacagttcaagaaattcaactccaggcagcagta60
aacgaacttctcctgctagaatggctggcaatggcggtgatgctgctcttgctttgctgc120
t121
<210>22
<211>121
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>22
cttctgcaggctgcttacggtttcgtccgtgttgcagccgatcatcagcacatctaggtt60
tcgtccgggtgtgaccgaaaggtaagatggagagccttgtccctggtttcaacgagaaaa120
c121
<210>23
<211>95
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>23
ctacttatttgatgagtctggtgagtttaaattggcttcacatatgtattgttctttcta60
ccctccagatgaggatgaagaagaaggtgattgtg95
<210>24
<211>77
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>24
gtccagagtactcaatggtctttgttcttttttttgtatgaaaatgcctttttacctttt60
gctatgggtattattgc77
<210>25
<211>92
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>25
gttttattctctacagtgttcccacctacaagttttggaccactagtgagaaaaatattt60
gttgatggtgttccatttgtagtttcaactgg92
<210>26
<211>119
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>26
ttggtggtgtcagtgttataacaccaggaacaaatacttctaaccaggttgctgttcttt60
atcaggatgttaactgcacagaagtccctgttgctattcatgcagatcaacttactcct119
<210>27
<211>121
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>27
acaagcctcactccctttcggatggcttattgttggcgttgcacttcttgctgtttttca60
gagcgcttccaaaatcataaccctcaaaaagagatggcaactagcactctccaagggtgt120
t121
<210>28
<211>121
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>28
cttctcgttcctcatcacgtagtcgcaacagttcaagaaattcaactccaggcagcagta60
ggggaacttctcctgctagaatggctggcaatggcggtgatgctgctcttgctttgctgc120
t121
<210>29
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>29
cttctgcaggctgcttacg19
<210>30
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>30
ctacttatttgatgagtctgg21
<210>31
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>31
gtccagagtactcaatggtc20
<210>32
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>32
gttttattctctacagtgttccc23
<210>33
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>33
ttggtggtgtcagtgttat19
<210>34
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>34
acaagcctcactccctttc19
<210>35
<211>24
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>35
cttctcgttcctcatcacgtagtc24
1.一种新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测的引物组及dna片段，其特征在于：
所述引物组包括：gc c241t-f、c241t-r、gc c3037t-f、c3037t-r、g11083t-f、g11083t-r、gc c14408t-f、c14408t-r、gc a23403g-f、a23403g-r、gc g25563t-f、g25563t-r、gc ggg28881aac-f、ggg28881aac-r，其序列依次如seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：11、seqidno：12、seqidno：13、seqidno：14所示；
所述dna片段包括突变后的dna片段及对应的原始dna片段，其中：突变后的dna片段包括c241t片段、c3037t片段、g11083t片段、c14408t片段、a23403g片段、g25563t片段、ggg28881aac片段，序列分别如seqidno：15、seqidno：16、seqidno：17、seqidno：18、seqidno：19、seqidno：20、seqidno：21所示；对应的原始dna片段包括c241片段、c3037片段、g11083片段、c14408片段、a23403片段、g25563片段、ggg28881片段，其序列分别如seqidno：22、seqidno：23、seqidno：24、seqidno：25、seqidno：26、seqidno：27、seqidno：28所示。
2.根据权利要求1所述的一种新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测的引物组及dna片段，其特征在于，所述引物组及dna片段是通过化学合成的核苷酸片段。
3.一种权利要求1所述的新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物组和dna片段，pcr缓冲液。
4.根据权利要求3所述的一种新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测的试剂盒，其特征在于：所述pcr缓冲液包括：5μl
5.一种新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，对阴性样本、dna片段及新冠肺炎病毒阳性样品分别进行pcr扩增，阴性样本pcr扩增产物作为待测样品的阴性对照，扩增后的dna片段作为待测样品的标准；新冠肺炎病毒阳性样品pcr扩增产物作为dgge检测的待测样品；
步骤2，对标准和待测样品进行dgge检测；
步骤3，dgge检测完毕后，将含有dna片段及样品的凝胶放入2.5×4sredplus染液中染色15分钟，拍照进行分析对比，当阳性待测样品条带与原始dna片段在dgge凝胶上处于同一水平位置时，说明阳性待测样品为未突变的新冠肺炎病毒阳性样品，当阳性待测样品条带与原始dna片段在dgge凝胶上不处于同一水平位置时，将其与突变dna片段比对来确定新冠肺炎病毒分型及突变类型。
6.根据权利要求5所述的一种新冠肺炎病毒分型及突变位点快速检测方法，其特征在于，所述的dgge检测的条件为：选择8％-10％的聚丙烯酰胺凝胶，胶变性范围为40％-60％，梯度混合制胶；电泳液温度上升至55℃时，先220v恒压预电泳5分钟，用50μl微量进样器快速上样，上样量为25μl；在55℃，200v条件下恒温恒压电泳8h。
技术总结