本发明属于医用材料领域，特别涉及一种自产氧增强光动力治疗的经皮给药纳米凝胶及其制备方法。
背景技术：
病理性瘢痕是一种异常的创伤愈合过程，组织学上主要表现为成纤维细胞的过度增生，从而导致产生的胶原纤维和细胞外基质大量的沉积。因此成纤维细胞就成了病理性瘢痕治疗的主要靶细胞，如何抑制成纤维细胞的增生，促进其凋亡已成为治疗病理性瘢痕的重要手段。近年来，通过光动力治疗(photodynamictherapy，pdt)诱导成纤维细胞凋亡已成为治疗病理性瘢痕的重要研究方向，得到了广泛的研究并在临床中得到应用。
光动力治疗的机制可以表述为：光敏剂进入细胞后，当在特定波长的光照射下发生光化学作用，并将产生的能量传递给周围分子氧，生成氧产生活性氧族(reactiveoxygenspecies，ros)，从而对靶细胞产生毒性作用，诱导病变细胞凋亡从而达到杀灭细胞的作用。在光动力治疗的三大必要条件：光敏剂、光源和氧。随着各种光敏性材料的开发，多种具有高光敏性能的水溶性光敏剂已应用于临床研究。目前研究发现，病灶部分的氧分子含量水平成为制约光动力治疗效果的主要因素。由于瘢痕组织的血管较少、细胞代谢迅速而造成氧供不足，导致瘢痕微环境呈现低氧状态，这都使单线态氧的产率降低，最终影响光动力治疗效果。为了解决这一问题，研究人员已经尝试了多种措施直接递送氧分子的方式来提高光敏剂周围的氧浓度。然而这些方法都存在药物合成复杂的问题和氧释放效率等难题。目前的研究发现，与正常皮肤相比，瘢痕组织中存在更高浓度的过氧化氢(h2o2)，而h2o2在一定条件下能够分解为水和氧气，因此它是组织中氧气的潜在储备库。研究表明金纳米簇可以与h2o2在中性条件下反应产生氧气，利用这一原理，将金纳米簇与光敏剂共递送到瘢痕组织中，金纳米簇与瘢痕组织中的h2o2反应后增加了氧含量，进而增强了光动力治疗的细胞杀伤作用。然而，如何有效的将金纳米簇和光敏剂共递送进入瘢痕的成纤维细胞中，成为了光动力治疗瘢痕的首要问题。
目前，经皮递送纳米凝胶是通过皮肤渗透实现吸收的新制剂形式，也是治疗皮肤疾病的最佳给药方式。但瘢痕增厚致密的组织结构特点使药物经皮渗透更加困难并且无法有效进入成纤维细胞内，大大限制了药物的利用率，影响瘢痕的疗效。而纳米脂质体类材料是一种性能优越的经皮递送纳米材料，可在渗透过程中利用自身柔性和形变能力，可通过狭小的角质细胞间隙和致密的瘢痕组织，显著提高药物在瘢痕中的渗透量和渗透深度。而如何有效的将金纳米簇和光敏剂有效的包载于脂质体上实现经皮共递送，则是通过自产氧提高光动力治疗瘢痕的最大难题。
技术实现要素：
本发明提供一种自产氧增强光动力治疗的经皮给药纳米凝胶及其制备方法，该纳米凝胶克服了现有技术无法将金纳米簇和光敏剂有效的包载于脂质体上的缺陷。
本发明提供了一种自产氧增强光动力治疗的经皮给药纳米凝胶，所述纳米凝胶中脂质体表面固定金纳米簇，脂质体内部包载光敏剂。
所述金纳米簇通过牛血清蛋白方法制备得到，具有优异的生物相容性、高催化性能和生物降解性等特点。
所述光敏剂为5-氨基酮戊酸类光敏剂、吲哚菁绿类光敏剂或海姆泊芬类光敏剂。
本发明还提供了一种自产氧增强光动力治疗的经皮给药纳米凝胶的制备方法，包括：
(1)预先制备浓度为8-14mg/ml的金纳米簇分散液；然后在1.5-2.5ml磷脂乙醇中加入4-6ml光敏剂分散液，充分搅拌混合后超声，调节ph值，得到含有光敏剂的脂质体分散液；将金纳米簇分散液和含有光敏剂的脂质体分散液按体积比1:3-5混合后，在37-45℃条件下孵育2-4h，得到表面固定金纳米簇、内部包载光敏剂的脂质体；
(2)制备卡波姆凝胶；将步骤(1)得到的脂质体按体积比3-5:1加入到卡波姆凝胶中，得到自产氧增强光动力治疗的经皮给药纳米凝胶。
所述步骤(1)中的金纳米簇分散液的制备方法包括如下步骤：取3-8ml氯金酸溶液(5-10mm)、3-8ml牛血清白蛋白溶液(50-100mg/ml)和2ml氢氧化钠溶液(1-2m)，在35-45℃条件下搅拌8-14h，得到金纳米簇分散液。
所述步骤(1)中的光敏剂分散液的浓度为4-10mg/ml。
所述步骤(1)中利用超声控制脂质体的粒径在50-200nm。
所述步骤(1)中的ph值为7.0-7.5。
所述步骤(2)中的卡波姆凝胶的制备方法包括如下步骤：取1.6-3.2g卡波姆940加入到42-80g水和3-6ml甘油中，充分搅拌水化再加入2.4-4.8ml三乙醇胺调节ph到7.0-7.5，得到卡波姆凝胶。
本发明纳米凝胶的使用方法是直接涂抹于瘢痕表面。所述凝胶的经皮渗透过程中，纳米凝胶进入瘢痕组织时，所述纳米凝胶能经皮渗透进入瘢痕组织中的成纤维细胞。当凝胶进入细胞后，脂质体将释放内部的光敏剂，且其表面的金纳米簇能催化h2o2产生o2，在对应波长的激光照射下，提高ros产率，从而增强光动力治疗瘢痕效果。
有益效果
本发明将光敏剂包封于脂质体内部，利用金纳米簇与磷脂作用力将金纳米簇固定于脂质体表面，通过具有高渗透性能的脂质体实现了共递送进行瘢痕中的成纤维细胞内部。金纳米簇通过催化h2o2产生氧气，克服瘢痕组织缺氧，提高局部氧浓度；光敏剂在相应激光照射下将氧气转化为单线态氧，进行有效的光动力治疗，克服了现有技术无法将金纳米簇和光敏剂有效的包载于脂质体上的缺陷。
附图说明
图1为实施例1制备的经皮给药纳米凝胶的透射电镜图(a)和高分辨透射电镜图(b)。
图2为实施例1制备的经皮给药纳米凝胶和单一脂质体的超声成像。
图3为实施例1制备的经皮给药纳米凝胶在瘢痕组织经皮给药的分布(从上到下分别为1h,2h和3h)。
图4为利用氧探针观察实施例2制备的经皮给药纳米凝胶在细胞内的产氧功能。
图5为实施例2制备的经皮给药纳米凝胶杀伤细胞效果评估。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)自产氧增强光动力治疗病理性瘢痕的经皮给药纳米凝胶的制备
步骤s1、制备金纳米簇：具体为将5ml氯金酸溶液(5mm)，5ml牛血清白蛋白溶液(50mg/ml)和2ml氢氧化钠溶液(1m)，在37℃条件下搅拌12h，得到浓度为2.0mm的金纳米簇分散液。
步骤s2、在2ml磷脂乙醇中加入6ml5-氨基酮戊酸分散液(10％)中，充分搅拌混合后1h后，超声功率为300w条件下超声反应20分钟，制备得到凝胶脂质体粒径为60nm，并调节ph值为7.0-7.5，得到含有光敏剂的脂质体分散液。
步骤s3、将s1和s2得到的分散液按体积比4:1混合后，在37℃条件下孵育2h，得到表面固定金纳米簇、内部包载5-氨基酮戊酸的脂质体。
步骤s4、制备卡波姆凝胶，具体为：将1.6g卡波姆940加入42g水和3ml甘油，充分搅拌水化再加入2.4ml三乙醇胺调节ph到7.0-7.5。
步骤s5、将s3和s4得到的分散液按体积比1:1混合后，即得到一种自产氧增强光动力治疗的经皮给药纳米凝胶，其结构如图1所示，催化h2o2产生氧的效果如图2所示。如图1所示，纳米凝胶中的脂质体大小为均匀，大小为75nm左右。通过高分辨电镜发现，在脂质体表面存在大量的金纳米簇。如图2所示，纳米凝胶具有金纳米簇一样的催化特性，可以将过氧化氢催化产生氧气。
(2)凝胶的渗透性能
将制备的凝胶直接涂抹于离体病理性瘢痕表面进行经皮给药，分别在1，2，3h后将瘢痕制备成垂直于表皮的冰冻切片。通过共聚焦荧光显微镜观察发现，该凝胶具有优异的渗透性能，能渗透于整个瘢痕组织中(如图3所示)。
实施例2
(1)自产氧增强光动力治疗病理性瘢痕的经皮给药纳米凝胶的制备
步骤s1、制备金纳米簇：具体为将6ml氯金酸溶液(5mm)，4ml牛血清白蛋白溶液(50mg/ml)和2ml氢氧化钠溶液(1m)，在37℃条件下搅拌12h，得到浓度为2.5mm的金纳米簇分散液。
步骤s2、在2ml磷脂乙醇中加入4.2ml5-氨基酮戊酸分散液(10％)中，充分搅拌混合后1h后，超声功率为300w条件下超声反应20分钟，制备得到凝胶脂质体粒径为60nm，并调节ph值为7.0-7.5，得到含有光敏剂的脂质体分散液。
步骤s3、将s1和s2得到的分散液按体积比5:2混合后，在37℃条件下孵育2h，得到表面固定金纳米簇、内部包载5-氨基酮戊酸的脂质体。
步骤s4、制备卡波姆凝胶，具体为：将1.6g卡波姆940加入42g水和3ml甘油，充分搅拌水化再加入2.4ml三乙醇胺调节ph到7.0-7.5。
步骤s5、将s3和s4得到的分散液按体积比1:1混合后，即得到一种自产氧增强光动力治疗的经皮给药纳米凝胶，纳米凝胶中的脂质体大小为均匀，大小为80nm左右。
(2)经皮给药纳米凝胶自产氧，提高细胞杀伤效果。
将制备的凝胶、氧分子探针与瘢痕成纤维细胞共孵育6小时后，通过共聚焦显微镜观察发现，制备的凝胶能产生大量的氧气引起氧分子探针发生荧光淬灭(图4所示)。因此，制备的经皮给药纳米凝胶可显著提高细胞内ros的产量，并利用流式分析发现，相比单一脂质体或单一金纳米簇，本实施例制备的经皮给药纳米凝胶对细胞具有更明显的杀伤效果(图5所示)。
1.一种自产氧增强光动力治疗的经皮给药纳米凝胶，其特征在于：所述纳米凝胶中脂质体表面固定金纳米簇，脂质体内部包载光敏剂。
2.根据权利要求1所述的一种双靶向经皮给药纳米凝胶，其特征在于：所述金纳米簇通过牛血清蛋白方法制备得到。
3.根据权利要求1所述的一种双靶向经皮给药纳米凝胶，其特征在于：所述光敏剂为5-氨基酮戊酸类光敏剂、吲哚菁绿类光敏剂或海姆泊芬类光敏剂。
4.一种自产氧增强光动力治疗的经皮给药纳米凝胶的制备方法，包括：
(1)预先制备浓度为8-14mg/ml的金纳米簇分散液；然后在1.5-2.5ml磷脂乙醇中加入4-6ml光敏剂分散液，充分搅拌混合后超声，调节ph值，得到含有光敏剂的脂质体分散液；将金纳米簇分散液和含有光敏剂的脂质体分散液按体积比1:3-5混合后，在37-45℃条件下孵育2-4h，得到表面固定金纳米簇、内部包载光敏剂的脂质体；
(2)制备卡波姆凝胶；将步骤(1)得到的脂质体按体积比3-5:1加入到卡波姆凝胶中，得到自产氧增强光动力治疗的经皮给药纳米凝胶。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的金纳米簇分散液的制备方法包括如下步骤：取3-8ml氯金酸溶液、3-8ml牛血清白蛋白溶液和2ml氢氧化钠溶液，在35-45℃条件下搅拌8-14h，得到金纳米簇分散液。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的光敏剂分散液的浓度为4-10mg/ml。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中利用超声控制脂质体的粒径在50-200nm。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的ph值为7.0-7.5。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的卡波姆凝胶的制备方法包括如下步骤：取1.6-3.2g卡波姆940加入到42-80g水和3-6ml甘油中，充分搅拌水化再加入2.4-4.8ml三乙醇胺调节ph到7.0-7.5，得到卡波姆凝胶。
技术总结