本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种载大黄酸的乳铁蛋白纳米粒子及其制备方法和用途。
背景技术：
溃疡性结肠炎(uc)是结肠中的常见炎症性疾病，在全世界范围内发病率和患病率呈上升趋势，并且年轻人更容易患病，这表明它是一种全球性疾病。uc的特征是上皮屏障的破坏和炎症稳态的失衡。因此，临床uc治疗的主要目标是加速结肠愈合并减轻炎症。目前，uc的一线疗法主要集中在抗炎药、免疫调节剂和生物制品。但是，患者使用各种临床认可药物的出现的不良反应已经被报道，例如肾毒性、神经毒性和机会性感染等。为了改善治疗效果并减少不良反应，筛选天然的生物活性化合物已成为一种有希望的替代策略。
大黄酸(rh)是从大黄、唐古特大黄以及其他中草药中分离的活性成分。现代药理研究证明，大黄酸具有良好的抗炎作用。近年来，研究表明rh可通过多种炎症途径(nf-κb，tlr4-myd88-nf-κb，mapk，jak/stat，pi3k-akt-mtor等)来抑制一系列疾病中的炎症。特别地，nf-κb是公认的介导rh在体外抗炎作用的信号分子之一，这表明rh可能是通过tlr4连接的nf-κb信号通路治疗uc的有希望的活性化合物。另一方面，据报道rh在诸如uc和iga肾病等一系列疾病中对肠粘膜屏障具有保护作用。rh对uc的两个明显作用准确地对应于uc在抗炎和结肠损伤修复中的临床治疗。
但是，大黄酸(rh)在使用时存在一些问题，如：水溶性低、生物利用度低、对结肠靶向能力较差。这些问题使rh的临床应用受到了很大的限制，克服这些问题，将有利于rh的临床应用。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种载大黄酸的乳铁蛋白纳米粒子及其制备方法和用途。
本发明提供了一种载药物的乳铁蛋白纳米粒子，它是具有三层结构的纳米粒；该三层结构从外到内分别是果胶层、透明质酸层、载药物的乳铁蛋白层。
进一步地，所述果胶层为钙离子交联后的果胶层。
进一步地，前述的载药物的乳铁蛋白纳米粒子是由如下重量配比的原料制备而成：乳铁蛋白50～100份，药物1～10份，透明质酸10～50份，果胶10～50份，氯化钙10～50份；
优选地，它是由如下重量配比的原料制备而成：乳铁蛋白50～60份，药物5～10份，透明质酸10～20份，果胶10～20份，氯化钙10～20份；
更优选地，它是由如下重量配比的原料制备而成：乳铁蛋白50份，药物5份，透明质酸20份，果胶10份，氯化钙10份。
进一步地，所述药物为大黄酸、姜黄素、绿原酸、大黄素或栀子苷；
优选地，所述药物为大黄酸。
进一步地，所述载药物的乳铁蛋白纳米粒子的制备方法包括如下步骤：
(1)将乳铁蛋白溶于水相，药物溶于油相，然后将水相和油相混合，得载药物的乳铁蛋白；
(2)将透明质酸加入载药物的乳铁蛋白中，使ha粘附在载药物的乳铁蛋白表面，得具有透明质酸的载药物的乳铁蛋白；
(3)在步骤(2)中加入果胶，然后加入氯化钙进行交联反应，离心，收集沉淀，即得。
进一步地，
步骤(1)中，所述水相为去离子水；
和/或，步骤(1)中，所述乳铁蛋白与水相的质量体积比为(1～10)mg：(1～10)ml；
和/或，步骤(1)中，所述油相为dmso；
和/或，步骤(1)中，所述药物与油相的的质量体积比为(1～10)mg：(1～10)ml；
和/或，步骤(1)中，所述将水相和油相混合后超声处理，然后透析、过滤；
和/或，步骤(2)中，所述将透明质酸加入载药物的乳铁蛋白中后室温下摇动2～5小时；
和/或，步骤(3)中，所述交联反应时间为2～5小时；
优选地，
步骤(1)中，所述乳铁蛋白与水相的质量体积比为5mg：2ml；
和/或，步骤(1)中，所述药物与油相的的质量体积比为5mg：1ml；
和/或，步骤(1)中，所述超声处理为以50％的振幅功率超声处理形成乳液。
本发明还提供了一种制备前述的载药物的乳铁蛋白纳米粒子的方法，它包括如下步骤：
(1)将乳铁蛋白溶于水相，药物溶于油相，然后将水相和油相混合，得载药物的乳铁蛋白；
(2)将透明质酸加入载药物的乳铁蛋白中，使ha粘附在载药物的乳铁蛋白表面，得具有透明质酸的载药物的乳铁蛋白；
(3)在步骤(2)中加入果胶，然后加入氯化钙进行交联反应，离心，收集沉淀，即得。
进一步地，
步骤(1)中，所述水相为去离子水；
和/或，步骤(1)中，所述乳铁蛋白与水相的质量体积比为(1～10)mg：(1～10)ml；
和/或，步骤(1)中，所述油相为dmso；
和/或，步骤(1)中，所述药物与油相的的质量体积比为(1～10)mg：(1～10)ml；
和/或，步骤(1)中，所述将水相和油相混合后超声处理，然后透析、过滤；
和/或，步骤(2)中，所述将透明质酸加入载药物的乳铁蛋白中后室温下摇动2～5小时；
和/或，步骤(3)中，所述交联反应时间为2～5小时；
优选地，
步骤(1)中，所述乳铁蛋白与水相的质量体积比为5mg：2ml；
和/或，步骤(1)中，所述药物与油相的的质量体积比为5mg：1ml；
和/或，步骤(1)中，所述超声处理为以50％的振幅功率超声处理形成乳液。
本发明还提供了前述的载药物的乳铁蛋白纳米粒子在制备抗炎药物中的用途；所述载药物的乳铁蛋白纳米粒子中药物为大黄酸。
进一步地，所述药物为治疗结肠炎的药物；
优选地，所述药物为治疗溃疡性结肠炎的药物。
本发明研究了一种具有果胶酸钙(cp)包被和透明质酸(ha)修饰的nps的药物递送系统，其具有双重靶向能力，可口服治疗。该药物递送系统具有良好的可控粒径，狭窄的粒径分布，带负电荷的表面。该纳米结构是专门针对rh在抗炎和结肠损伤修复中的药理作用而设计的。cp/ha/rh-nps从外到内可以分为三层，分别是cp，ha和lf：
(1)cp层：根据体外对胃稳定性和释放曲线评价的研究结果，在cp的帮助下，cp/ha/rh-nps表现出良好的胃稳定性，并在含有丰富的肠道菌群的大鼠盲肠刺激下进行了rh的控制释放。重要的是，在体内靶向递送研究中，结果表明cp/ha/ir780-nps表面的cp可以帮助lf不在正常肠段周围提前进行lf暴露，并进一步集中暴露并靶向结肠病变，而另外两个由于未保护和暴露的lf，而进一步集中暴露并靶向结肠病变，即赋予了cp/ha/rh-nps结肠靶向能力。
(2)ha层：ha修饰的纳米颗粒可以通过cd44介导的内吞途径靶向巨噬细胞，从而增加巨噬细胞的摄取率，这在定性和定量分析的吸收评估研究中得到了证实。此外，该巨噬细胞靶设计可通过tlr4/myd88/nf-κb途径有效促进rh的抗炎作用，具有体内抗uc治疗效果。
(3)lf层：lf作为一种常见的纳米载体，具有丰富的来源和良好的载药能力，对rh的包封效率高(95.08％)。此外，这项研究证实了lf可以提高细胞摄取率，并可以增强大黄酸的修复作用。
与其他口服ndds相比，本发明乳铁蛋白大黄酸纳米粒子还具有两个优点：首先，nps中的所有材料，例如果胶、lf和ha，都是食品级的，并且对环境无害，并且其毒性远低于其他合成化学纳米材料。而且，纳米颗粒的制备方法相对简单并且易于按比例放大，并且药物和聚合物相对便宜并且可大量获得。其次，研究发现rh可以抑制tnf-α，il-6，il-1β和inos等促炎性细胞因子的表达水平，并改善dss诱导的小鼠结肠炎，并首先证实rh的抗炎作用是通过本研究中的tlr4/myd88/nf-κb途径。本发明使用纳米技术增强了uc治疗中rh的靶向能力和药理作用，提供了一种活性抗uc天然化合物rh，并设计了专门用于rh应用临床治疗的环保纳米载体。
总之，本发明提供了一种载药物的双重靶向药物递送纳米粒子，该纳米粒子生物相容性良好，稳定性良好，可口服给药，并且具有良好靶向能力。其中，本发明主要提供了一种载大黄酸的双重靶向药物递送纳米粒子，该纳米粒子除生物相容性良好，稳定性良好，可口服给药外，并且具有良好的结肠病变炎症和结肠损伤靶向能力。该纳米粒子口服给药时在胃和小肠中保持稳定性，释放药物慢，靶向到结肠病变部位后持续释放药物，治疗结肠炎，特别是溃疡性结肠炎效果良好。该纳米粒子的治疗效果优于单独使用大黄酸，以及其他结构的载大黄酸纳米粒子，具有良好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明rh-nps、ha/rh-nps和cp/ha/rh-nps的粒径分布和zeta电位测量。
图2为本发明乳铁蛋白大黄酸纳米粒子的理化特性表征结果(n＝3)：a为本发明乳铁蛋白大黄酸纳米粒子的制备过程示意图；b为rh-nps、ha/rh-nps和cp/ha/rh-nps的zeta电位检测结果；c为本发明乳铁蛋白大黄酸纳米粒子的透射电子显微镜图和粒径分布；d为不同样品的x射线衍射图；e为不同样品的红外光谱图；f为ha/rh-nps和cp/ha/rh-nps模拟胃液稳定性结果；g为37℃条件下，在不含大鼠盲肠内容物的pbs中rh从游离rh、ha/rh-nps、cp/ha/rh-nps中释放的体外释放曲线，以及在含大鼠盲肠内容物的pbs中rh从cp/ha/rh-nps中释放的体外释放曲线；图d和图e中，a为原料rh，b为lf，c为果胶，d为ha，e为空白nps，f为cp/ha/rh-nps，g为原料rh和空白nps混合物。
图3为使用caco-2细胞系和raw264.7巨噬细胞对不同c6制剂的细胞摄取定量评估：a为在不同浓度(6.25ng/ml，12.5ng/ml，25ng/ml，50ng/ml和100ng/ml)孵育4小时后，定量测量caco-2细胞摄取的ha/c6-nps；b为在c6浓度为100ng/ml的不同孵育时间点(0h，0.25h，0.5h，1h，2h和4h)定量测量caco-2细胞摄取的ha/c6-nps；c为在c6浓度为100ng/ml孵育4小时后，定量测量不同制剂(对照组，游离c6，c6-nps和ha/c6-nps)中caco-2细胞的摄取情况；d为定量测量在有或没有lf存在下与c6-nps和ha/c6-nps一起孵育的caco-2细胞的摄取；e为在不同浓度(0ng/ml，6.25ng/ml，12.5ng/ml，25ng/ml，50ng/ml，和100ng/ml)孵育4小时后，定量测量raw264.7巨噬细胞摄取的ha/c6-nps；f为在c6浓度为100ng/ml的不同孵育时间点(0h，0.25h，0.5h，1h，2h和4h)定量测量raw264.7巨噬细胞摄取的ha/c6-nps；g为在c6浓度为100ng/ml的条件下孵育4小时后，不同制剂(对照组，游离c6，c6-nps和ha/c6-nps)的raw264.7巨噬细胞摄取的定量测量；h为在有或没有ha存在下，与c6-nps和ha/c6-nps一起孵育的raw264.7巨噬细胞摄取的定量测量。数据表示为平均值±sd(n＝3)。*p＜0.05；**p＜0.01。
图4为使用caco-2细胞系和raw264.7巨噬细胞对不同c6制剂的细胞摄取定性评估：a为在有或没有lf存在下，与游离c6，c6-nps或ha/c6-nps一起孵育的caco-2细胞摄取的定性分析结果；b为在有或没有ha存在下，与游离c6，c6-nps或ha/c6-nps一起孵育的raw264.7巨噬细胞摄取的定性分析结果。
图5为nps的体内生物分布：a为在3h，6h，12h和24h口服递送不同制剂后的溃疡性结肠炎小鼠的荧光图像；b为在3h，6h，12h和24h口服递送不同制剂后的溃疡性结肠炎小鼠的荧光信号分析的直方图；c为在最终点采用不同制剂后，小肠和结肠的荧光图像；d为在最终点通过每种制剂对鼠小肠和结肠进行荧光信号分析的直方图；e为给药后结肠炎组织的冷冻切片，绿色为c6，蓝色为hoechst33342(核)。数据表示为平均值±sd(n＝6)。*p<0.05vs游离ir780；**p<0.01vs游离ir780；##p<0.01vsir780-nps；▲▲p<0.01vscp/ha/ir780-nps。
图6为cp/ha/rh-nps在溃疡性结肠炎治疗中的体内治疗效果：a为各制剂中鼠体重随时间变化的曲线图，标准化为零日体重的百分比；b为各制剂中dai得分的曲线图分析；c为用不同的rh制剂口服处理后的鼠结肠的照片；d为不同制剂之间结肠长度的直方图分析；e为不同制剂之间脾脏重量的直方图分析；f为在六种制剂中的小鼠结肠mpo表达的直方图分析；g为各制剂中结肠切片的h&e染色。数据表示为平均值±sd(n＝6)；*p<0.01，**p<0.01。
图7为接受不同制剂的小鼠的心脏，肝，脾，肺和肾切片的h&e染色。
图8为cp/ha/rh-nps治疗溃疡性结肠炎后结肠炎性细胞因子的变化和蛋白质表达的结果：a为各制剂中鼠结肠炎性细胞因子(il-1β，inos，tnf-α和il-6)变化的直方图分析；b为各制剂中鼠结肠蛋白表达(myd88，tlr4，nf-κbp65和gapdh)的蛋白质印迹结果和直方图分析。数据表示为平均值±sd(n＝6)；*p<0.01，**p<0.01。
图9为nps对dss诱导的实验性结肠炎中紧密连接蛋白表达的影响；a为zona-occludin1(zo-1)和claudin-1的免疫组织化学分析；b为远端结肠中zo-1和claudin-1的平均面积密度；c为各制剂中鼠结肠紧密连接蛋白表达(zo-1，claudin-1和β-actin)的蛋白质印迹结果和直方图分析。数据表示为平均值±sd(n＝6)；*p<0.01，**p<0.01。
具体实施方案
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。主要材料如下：
动物实验获得了成都中医药大学伦理委员会(cdutcm，许可cdu2019s121)的批准，所有动物实验均严格按照中国科学技术部《实验动物的护理和使用指南》进行。从spf(北京)生物技术有限公司(中国北京)获得雄性balb/c小鼠(22-25g)。在标准条件下饲养小鼠，并提供食物和蒸馏水。
人结肠腺上皮癌细胞系(caco-2细胞)和鼠白血病单核巨噬细胞系(raw264.7巨噬细胞)获自美国典型培养物保藏中心(美国马纳萨斯)。
ir780、果胶和透明质酸(ha)购自sigma-aldrichcompany(美国密苏里州圣路易斯)。葡聚糖硫酸钠(dss，分子量：36-50kda)购自mpbiomedicalsinc.(美国加利福尼亚)。大黄酸(rh)由大连梅生物技术有限公司(中国大连)提供。从阿拉丁试剂公司(中国上海)获得氯化钙和香豆素6(c6)。hoechst33342由苏州裕恒生物技术有限公司(中国苏州)提供。乳铁蛋白(lf)购自上海glycarbo.co.,ltd(中国上海)。髓过氧化物酶(mpo)试剂盒，白介素1β(il-1β)试剂盒，肿瘤坏死因子-α(tnf-α)试剂盒，白介素6(il-6)试剂盒和抗髓样分化因子88(myd88)，抗-claudin-1，抗zo-1，抗核因子kappa-b(nf-κb)p65和抗toll样受体4(tlr4)抗体由多科学(联科)生物技术有限公司(中国杭州)提供。诱导型一氧化氮合酶(inos)试剂盒购自益宝生物科技有限公司(武汉，中国)。所有溶剂(包括丙酮，乙腈和甲醇)均为色谱级，无需进一步更改即可使用。
实施例1、本发明乳铁蛋白大黄酸纳米粒子的制备
采用透析技术制备乳铁蛋白大黄酸纳米粒子(载大黄酸的乳铁蛋白纳米粒子)。将乳铁蛋白(lf)50mg溶解在20ml去离子水中以制备lf溶液。同时，将大黄酸(rh)5mg完全溶解在1mldmso中，得到rh溶液。在恒定磁力搅拌下，将上述rh溶液滴加到lf溶液中。然后将混合物置于冰浴中并使用探针超声仪(sonicatorxl，misonix，melville，ny，usa)以50％的振幅功率超声处理5分钟以形成乳液。然后，将乳液在去离子水中透析(截留分子量为1000da)6h，以除去dmso。随后，用0.45μm过滤器过滤，以去除灰尘和游离药物，过滤后获得rh-nps。
之后，将透明质酸(ha)20mg加入到rh-nps中，在室温下摇动2小时，以静电方式将ha粘附在rh-nps的表面上，形成ha/rh-nps。
最后，在恒定磁力搅拌下，将10mg果胶添加到ha/rh-nps中，并持续搅拌30分钟之后，加入10mg氯化钙进行交联反应，交联反应2小时。最终，将交联后的体系以15000rpm离心15分钟，收集沉淀得本发明乳铁蛋白大黄酸纳米粒子(cp/ha/rh-nps)。将沉淀洗涤3次，然后冷冻干燥，即得干燥的cp/ha/rh-nps。将最终干燥的cp/ha/rh-nps储存在-20℃下，备用。
以下通过具体试验例证明本发明的有益效果。
试验例中的数据均进行统计分析，即所有数据均表示为均值±标准差(sd)，并且所有实验结果均在相同条件下的至少三个独立的单独实验中得到确认(即n≥3)。使用学生t检验进行统计比较。p<0.05被认为具有统计学意义。
试验例1、本发明乳铁蛋白大黄酸纳米粒子的理化特性
一、试验方法
(1)粒径和zeta电位的测量
按照实施例1方法制得rh-nps、ha/rh-nps和cp/ha/rh-nps，使用动态光散射(dls)和粒子分析仪litesizer500(奥地利安东帕尔)分别测量其平均流体动力学粒径、多分散指数(pdi)和zeta电位。每组nps各3个平行样(n＝3)。
(2)tem检测
按照实施例1方法制得干燥cp/ha/rh-nps，使用透射电子显微镜(tem，jem1200x，jeol，日本)对其表面结构和形状进行分析。将一滴稀释的样品沉积在碳涂层的铜网上，5分钟后用滤纸除去过量的样品，将铜网上的nps用醋酸铀酰进行负染，然后进行tem分析。
(3)xrd检测
取原料大黄酸(即游离大黄酸，rh)、乳铁蛋白(lf)、透明质酸(ha)、果胶和不同nps(空白nps、按照实施例1方法制得的cp/ha/rh-nps、rh和空白nps混合物)，通过x射线衍射仪(d8advance，bruker，germany)分别检测，得x射线衍射(xrd)光谱。x射线衍射的检测条件：以6的速度从5°扫描到90°进行测量，每分钟6°，并在40kv和40ma下工作。
其中，空白nps的制备方法如下：
将乳铁蛋白(lf)50mg溶解在20ml去离子水中以制备lf溶液。在恒定磁力搅拌下，将1mldmso滴加到lf溶液中。然后将混合物置于冰浴中并使用探针超声仪(sonicatorxl，misonix，melville，ny，usa)以50％的振幅功率超声处理5分钟以形成乳液。然后，将乳液在去离子水中透析(截留分子量为1000da)6h，以除去dmso。随后，用0.45μm过滤器过滤，以去除灰尘，过滤后获得nps(空白nps)。
(4)红外检测
取原料大黄酸(即游离大黄酸，rh)、乳铁蛋白(lf)、透明质酸(ha)、果胶和不同nps(空白nps、按照实施例1方法制得的cp/ha/rh-nps)，使用傅立叶变换红外光谱仪(irtracer-100，日本岛津，日本)检测。波数范围设置为400-4000cm-1，并以4cm-1的分辨率平均进行16次扫描记录光谱。将样品与kbr混合，然后在测量之前将所得混合物进一步压制成薄饼状。空白nps的制备方法同“(3)xrd检测”。
(5)装载效率和包封效率
rh装载效率(le)和包封效率(ee)均使用配备c18色谱柱(250×4.6mm)的高效液相色谱(hplc)(lc-45202-46，shimadzu，日本)测定。流动相为甲醇/0.1％磷酸(85：15，v/v)，检测波长为254nm，流速为1ml/min，柱温为25℃。在hplc分析之前，使用1ml甲醇破坏nps结构并溶解rh。ee和le分别使用公式i和ii计算：
包封效率：ee(％)＝rh的装载量/rh的添加量×100％式i
装载效率：le(％)＝rh的装载量/制备nps的材料总量×100％式ii
(6)模拟胃液稳定性评估
按照实施例1方法制得cp/ha/rh-nps和ha/rh-nps，在模拟胃液中评估cp/ha/rh-nps和ha/rh-nps的稳定性。将1ml新鲜制备的cp/ha/rh-nps或ha/rh-nps添加到9ml模拟胃液(sgf，ph2，包含1mg/ml胃蛋白酶)中，然后在37℃下孵育保持2小时，然后测tem、粒度和pdi。
(7)nps释放曲线评估
使用透析方法检查不同nps(按照实施例1方法制得cp/ha/rh-nps和ha/rh-nps)的rh和游离rh释放曲线。将3ml去离子水溶解游离rh，ha/rh-nps和cp/ha/rh-nps(rh浓度为190μg/ml)分别添加到透析袋中(分子量截断值1000da)。将装有游离rh，ha/rh-nps，cp/ha/rh-nps的袋子分别浸入30ml含有1％吐温-80的pbs介质(ph7.4)中，进行释放曲线评估。同时，还用30ml盲肠含量为5％(ph7.4)的pbs对cp/ha/rh-nps的释放曲线进行了评估：同一天处死大鼠并在氮气室中收集盲肠内容物(多糖降解酶)，加入pbs中。在37℃下以100rpm的速度摇动四组样品，并分别在预设的不同时间点(1、2、4、8、12、16、20、24h)收集1ml培养基，并向其中补充等量的新溶出介质。通过hplc确定所得滤液中的药物浓度。
二、试验结果
静电吸附和交联反应是本发明形成三层cp/ha/rh-nps的过程机理。
图1为rh-nps、ha/rh-nps和cp/ha/rh-nps的粒径分布和zeta电位测量。由图1所示结果可知：lf封装的rh(rh-nps)流体动力学粒径约为172nm，具有绝对正zeta电位(21.50±0.31mv)和相对较低的多分散指数(pdi)值(0.206±0.009)。与ha一起摇动后，绝对zeta电位值从约21.50mv降低到3.52mv，这证明了ha成功地静电吸附到了nps的第二层上。此外，ha/rh-nps的粒径从约172略微增加到190，pdi值增加到约0.285，这表明ha可能会使系统变得相对不均匀。cp/ha/rh-nps的zeta电位(ζ电位)从正(3.52±0.90mv)变为高度负(-24.9±0.95mv)，这证实了果胶钙在纳米粒子表面上形成；此时，pdi值降低至0.163±0.062，nps的均一性得到提高。试验结果说明本发明乳铁蛋白大黄酸纳米粒子制备成功。
图2为本发明乳铁蛋白大黄酸纳米粒子的理化特性表征结果。其中，图a为本发明乳铁蛋白大黄酸纳米粒子的制备过程示意图；图b为rh-nps、ha/rh-nps和cp/ha/rh-nps的zeta电位检测结果；图c为本发明乳铁蛋白大黄酸纳米粒子的透射电子显微镜图和粒径分布；图d为原料大黄素(rh)、乳铁蛋白(lf)、果胶、透明质酸(ha)、空白纳米粒子(空白nps)、实施例1的cp/ha/rh-nps以及空白nps与rh混合物的x射线衍射图；图e为rh、lf、果胶、ha、空白nps以及cp/ha/rh-nps的红外光谱图；图f为ha/rh-nps和cp/ha/rh-nps模拟胃液稳定性结果；图g为37℃条件下，在含有和不含大鼠盲肠内容物的含有1％吐温-80的磷酸盐缓冲液(ph7.4)中，游离rh，ha/rh-nps，cp/ha/rh-nps中rh的体外释放曲线。
由图2可知：cp/ha/rh-nps的平均粒径分布为284.37±2.70nm，ζ电位为-24.9±0.95mv。如前所述，cp/ha/rh-nps具有极高的绝对负ζ电位，表明其具有良好的稳定性，并且还可避免颗粒聚集。另外，cp/ha/rh-nps的ee(％)和le(％)分别为95.08％，6.17％，满足了nps的要求。形态上，cp/ha/rh-npstem图像显示出具有光滑表面的均匀球形(图2c)。
为了确定rh是否已封装在cp/ha/rh-nps中，研究了cp/ha/rh-nps的相应xrd和ftir图谱，其中还包含原料rh，lf，ha，果胶，空白nps以及游离rh和空白nps混合物。如图2d所示，原料rh(游离rh)的代表性xrd衍射图谱显示出许多尖锐的峰，表明它具有结晶性质。相反，lf，ha，果胶，空白nps和cp/ha/rh-nps粉末没有这些代表性的峰，表明在rh及其lf基质之间没有形成结晶络合物。这些结果提供了明确的证据，表明晶体rh已在lf基质中转化为非晶态分子，表明rh已被封装在cp/ha/rh-nps中。如图2e所示，在rh的ftir光谱中，强信号分别出现在1629cm-1、1452cm-1和764cm-1处。前两个峰可归因于苯环中c＝c的骨架振动，后一个峰对应于苯环中c-h的弯曲振动。而在cp/ha/rh-nps中未观察到这三个峰，这表明rh和lf之间可能存在疏水相互作用。在lf光谱中，酰胺i在约1652cm-1处的特征性lf吸收峰是由肽基团的c＝o拉伸振动引起的，而酰胺ii在约1537cm-1处的特征性lf吸收峰是由于nh弯曲而引起的。观察到，lf带正电荷的氨基(-nh3 )的弯曲振动(1537cm-1)和ha带负电荷的coo-(1619cm-1)的静电相互作用使酰胺ii的峰移至更高的波数(1545/1547cm-1)。cp的3431cm-1的峰归属于羟基中的极性带。此外，加入cp后，发现空白nps和cp/ha/rh-nps中3200-3500cm-1的峰形与lf粉末相比较为尖锐，峰移至3431cm-1表示cp和lf可能在np中形成新的氢键和共轭。
nps的胃屏障稳定性是口服nps的基本特征，其保证了nps的完整结构和药理作用。本发明评估了具有低ph值胃酶的模拟胃液中ha/rh-nps和cp/ha/rh-nps的稳定性。如图2f所示，在胃条件下孵育2小时后，ha/rh-nps组出现两个峰，粒径大于350nm，pdi>0.3。同时，ha/rh-nps的tem图像显示出不均匀的形状。然而，在相同条件下，cp/ha/rh-nps的粒径略有增加(341.54±0.88nm)，相应的pdi较低(0.213±0.004)，cp/ha/rh-nps的tem图像显示为均匀球形，表面光滑。因此，有证据表明果胶是一种有前途的保护剂，它可使nps更稳定并防止口服后对胃环境的破坏作用。
从nps连续释放药物是药物递送系统的重要参数。因此，在ph7.4的缓冲液中评估了游离rh，ha/rh-nps和cp/ha/rh-nps的释放曲线。如图2g所示，与游离rh相比，ha/rh-nps和cp/ha/rh-nps释放更慢。特别地，在大约释放4小时时，游离rh几乎完全释放。但是，孵育4小时后，只有约30％的rh从ha/rh-nps中释放出来，而累积的rh的87％在24小时内释放出来。在添加果胶和氯化钙后，可以在cp/ha/rh-np中有效控制rh的缓慢释放，在最初的4小时内，rh仅连续释放约15％，累积rh释放在24小时内仅超过56％。很明显，果胶包裹的cp/ha/rh-nps能够很好地控制rh释放量，定时释放包裹的rh超过24小时。
在肠道菌群的帮助下，果胶钙(cp)层可能被降解，包裹的药物迅速释放到目标部位。因此，还研究了在盲肠含量为5％的缓冲液中cp/ha/rh-nps的释放曲线。与其他组相比，具有盲肠内容缓冲液的cp/ha/rh-nps组中rh累积量的平均百分比高于没有盲肠内容缓冲液的cp/ha/rh-nps组，与没有盲肠内容缓冲液的ha/rh-nps组相比释放速度更慢(图2g)。所有的实验研究表明，cp可以明显降低nps的释放速率。
试验例2、细胞培养及细胞摄取评估
一、试验方法
将caco-2细胞和raw264.7细胞分别在补充有1％链霉素和青霉素(thermofisherscientific，美国)和10％胎牛血清(fbs，thermofisherscientific，billerica，美国)的mem/dmem培养基中培养。对于体外实验，将游离rh溶解在dmso中并稀释1000倍以上。使用不完全培养基(补充0.5％fbs和1％链霉素和青霉素)稀释药物。
细胞摄取是体外纳米药物评估的重要指标。使用流式细胞仪(fcm)(aceanovocytetm，美国圣地亚哥)和共聚焦激光扫描显微镜(clsm)(leicatcssp8sr，weztlar，德国)测量细胞摄取。由于rh没有明显的荧光，因此使用c6代替rh作为荧光探针，其余按照上述制备方法，制备ha/c6-nps、c6-nps。caco-2细胞和raw264.7巨噬细胞均用于细胞摄取评估。
fcm用于定量分析nps的细胞摄取。将caco-2细胞和raw264.7巨噬细胞接种到六孔板中，分别培养12小时直至粘附，然后将不同c6负载的制剂添加到每个孔中，并在37℃下孵育以进行进一步评估。对于不同的c6负载制剂之间的细胞摄取差异，将细胞与ha/c6-nps，c6-nps和游离c6(100ng/mlc6)孵育4小时。为了对ha/c6-nps进行浓度依赖性研究，将细胞与不同c6浓度(6.25、12.5、25、50和100ng/ml)的ha/c6-nps在37℃孵育4小时。为了对ha/c6-nps进行时间依赖性研究，将细胞与ha/c6-nps(c6浓度为100ng/ml)在不同时间点(0.25、0.5、1、2和4h)孵育。为了进行lf受体竞争抑制研究，将游离的lf(2.5mg/ml)无血清培养基添加到六孔板的caco-2细胞中，进行0.5h的预孵育后，加入ha/c6-nps、c6-nps分别再孵育4小时。对于ha受体竞争抑制研究，将游离ha(5mg/ml)无血清培养基添加到带有raw264.7巨噬细胞的六孔板中，进行预孵育0.5h后，加入ha/c6-nps再孵育4h。在所有实验中，未处理的caco-2细胞和raw264.7巨噬细胞均用作对照。
clsm用于定性分析nps的细胞摄取。将caco-2细胞和raw264.7巨噬细胞分别接种到共聚焦培养皿中，培养12小时直至粘附，然后添加不同的c6负载制剂以进行进一步评估。对于不同的c6负载制剂之间的吸收差异，将caco-2细胞和raw264.7巨噬细胞均与ha/c6-nps，c6-nps和游离c6(100ng/mlc6)孵育4小时。同时，将lf预温育的caco-2细胞和ha预温育的raw264.7巨噬细胞与ha/c6-nps和c6-nps以相同浓度的c6(100ng/ml)温育4小时。孵育结束后，将细胞用pbs彻底冲洗，以消除过量的制剂，然后在4％多聚甲醛中固定10分钟，并用hoechst33342染色，以用于以后的clsm成像分析。
二、试验结果
有效的细胞摄取是装载rh的nps的治疗功效的主要要求。为了研究ha/lf功能化的nps的摄取特性，分别使用两个相对细胞raw264.7巨噬细胞和caco-2细胞作为模型。由于rh没有明显的荧光，使用c6作为荧光探针进行跟踪。体外nps释放研究的结果表明，cp/ha/c6-nps的cp层首先被肠道菌群降解，然后释放的ha/c6-nps被细胞吸收。因此，在没有肠道菌群相互作用的情况下，体外摄取分析仅在ha/c6-nps，c6-nps和游离c6组中进行，而没有在cp/ha/c6-nps组中进行。
通过fcm对nps进行定性分析，以确认其吸收效果并评估nps的吸收方式。对于caco-2细胞，如图3a和图3b所示，随着浓度从6.25到100ng/ml和时间从0到4h的增加，ha/c6-nps中c6的荧光强度显着增强，证明ha/c6-nps在caco-2细胞中是浓度依赖性和时间依赖性的。如图3c所示，将caco-2细胞与浓度为100ng/ml的游离c6，c6-nps或ha/c6-nps孵育4小时后，通过fcm测试，c6-nps或ha/c6-nps的荧光强度明显强于游离c6(p<0.01)。但是，c6-nps和ha/c6-nps之间的荧光强度没有显着差异。相反，当暴露于预先与caco-2细胞膜表面受体位点结合的游离lfcaco-2细胞预孵育的c6-nps或ha/c6-nps时，细胞内荧光显着降低(图3d，p<0.01)。这些结果表明lf可促进细胞内吸收治疗剂。此外，在raw264.7巨噬细胞中也观察到相同的浓度依赖性和时间依赖性(图3e，图3f)。不同的是，如图3g所示，分别与游离c6，c6-nps和ha/c6-nps孵育4小时后，ha/c6-nps表现出明显的最高荧光，其次是c6-nps和游离c6(p<0.01)。结果表明ha可增加raw264.7巨噬细胞对ha/c6-nps的吸收。图3h表明，与没有用游离ha预孵育的ha/c6-nps组相比，将raw264.7巨噬细胞预先与游离ha孵育后，ha/c6-nps的荧光强度迅速降低(p<0.01)。所有结果表明，lf或ha的表面功能化可以分别促进caco-2细胞和raw264.7巨噬细胞对nps的细胞摄取效率。
为了进一步定性分析不同制剂对细胞的摄取，在这项研究中还进行了clsm。图像(图4)中绿色荧光的强度间接反映了caco-2细胞和raw264.7巨噬细胞对c6的吸收。同样，将caco-2细胞和raw264.7巨噬细胞与c6浓度为100ng/ml的游离c6，c6-nps或ha/c6-nps孵育4小时，然后使用clsm测量荧光强度。研究表明游离的c6在caco-2细胞中显示弱绿色荧光，而在用c6-nps或ha/c6-nps处理的细胞中检测到较高的c6强度(图4a)，表明lf在caco-2细胞吸收c6的效率中起着重要作用。为了进一步验证lf是否诱导了更高的治疗效果，研究了竞争性细胞摄取。如图4a所示，在培养基中不存在lf的情况下，c6-nps和ha/c6-nps显示适度的绿色荧光。然而，当将lf引入培养基中时，荧光强度急剧下降。这一结果与fcm研究相似，该研究证实c6-nps和ha/c6-nps组中细胞摄取效率的提高均由lf受体介导。另一方面，为了进一步研究ha分子是否可以维持其巨噬细胞靶向能力，定性比较了游离c6，c6-nps和ha/c6-nps与raw264.7巨噬细胞的细胞摄取效率。如图4b所示，游离的c6显示出比c6-nps稍弱的荧光，并且ha/c6-nps在所有参考组中显示出最高的荧光信号。为了确认ha受体介导的ha功能化np的细胞摄取，还检查了raw264.7巨噬细胞在补充了游离ha的培养基中对ha-rh-nps的细胞摄取效率，该游离ha与c6-nps或ha/c6-nps组竞争ha。如图4b所示，在游离ha存在下，ha/c6-nps的细胞摄取显着降低，但是，当在培养基中引入ha时，未观察到c6-nps荧光强度的明显变化。这些结果表明，由于raw264.7巨噬细胞表面的ha受体，ha/c6-nps被内化到细胞中。
总体而言，定性和定性分析均证实lf分子可以维持其caco-2细胞靶向能力，ha分子可以维持其巨噬细胞靶向能力。
试验例3、体内生物分布评估
一、试验方法
通过活体成像系统(perkinelmer,ma,美国)对uc小鼠模型进行nps的体内生物分布评估。在雄性balb/c小鼠中，通过在7天的时间内在其饮用水中向其喂食dss(3％，w/v)，诱导uc小鼠模型。将ir780(一种在780nm处具有最大吸光度的nir染料)替代rh封装在nps(称为ir780-nps，ha/ir780-nps和cp/ha/ir780-nps)中。首先将uc小鼠随机分为四组(每组n＝6)，并分别给各组口服一次相同剂量(剂量为1.5mg/kg)游离的ir780，ir780-nps，ha/ir780-nps或cp/ha/ir780-nps。口服后，在四个不同的时间点(3、6、12和24小时)对小鼠进行成像。在给药后的最后一个终点，对小鼠实施安乐死，将小肠和远端结肠分离，无需清洗即可立即检测荧光。
为了描述nps的结肠靶向潜力，健康和dss诱导的uc小鼠接受单次口服相同剂量(剂量为2mg/kg)的游离c6，c6-nps，ha/c6-nps和cp/ha/c6-nps。使用clsm定性研究结肠炎组织中不同组的c6的积累。在给药后24小时，通过安乐死处死所有小鼠。在黑暗的环境中收集小鼠的结肠。随后，将组织包埋在最佳切割温度化合物中，切片，然后用hoechst33342进一步染色，以通过clsm检测c6的积累。
二、试验结果
治疗剂在发炎的结肠组织中的选择性积累对于口服给药治疗uc至关重要。为了评估靶向炎性结肠组织的nps的功效，采用了ivis和共聚焦显微镜。评价由dss诱导的uc小鼠，并在口服后的每个时间点通过体内成像系统拍摄荧光图像并进行统计学分析。如图5a和图5b所示，管饲3h或6h后，整个nps组的平均荧光强度没有显着差异。12小时后，cp/ha/ir780-nps的平均荧光强度最强，其次是ha/ir780-nps，ir780-nps和游离ir780，差异有统计学意义(p<0.01)，而这些差异持续到24小时终点。此外，在胃内给药后24小时，收集结肠和小肠，所得的荧光图像和直方图如图5c和图5d所示，ir780-nps和ha/ir780-nps组的强度显着高于游离ir780和cp/ha/ir780-nps(p<0.01)，这表明ir780-nps和ha/ir780-nps中未受保护和暴露的lf可以通过lf配体靶向小肠。然而，在cp/ha/ir780-nps组中，小肠周围的荧光强度较弱，在结肠附近则最高(p<0.01)，这表明在cp/ha/ir780-nps表面的cp可以成功避免正常小肠周围的lf过早暴露，并借助肠道菌群消化至cp进一步在结肠病变周围进一步释放ha/ir780-nps，然后通过暴露的lf靶向结肠。因此，cp层有助于lf对结肠病变的特定目标能力。
观察被靶结肠组织吸收的nps可直接反映递送状态和靶向能力。因此，通过冷冻切片技术和clsm，使用负载c6的nps评估cp/ha/c6-nps在发炎结肠中的特定部位药物递送功效。如图5e所示，在cp/ha/c6-nps治疗组的结肠炎组织切片中可见明显的绿色荧光，表明nps可以在口服给药后有效地积聚在结肠炎组织中。ha/c6-nps治疗组的绿色荧光信号比c6-nps治疗组的绿色荧光信号强得多，表明ha可以增强结肠炎组织中nps的积累。
综上所述，离体发光图像表明cp/ha/ir780-nps可能在结肠发炎区域积聚并保持较长时间。说明本发明纳米粒子可以有效的靶向结肠发炎区域。
试验例4、体内治疗评估
一、试验方法
用dss诱导的uc小鼠模型进行体内治疗评价。将小鼠随机分为六组(每组n＝6)：(1)正常组，(2)模型组，(3)游离rh组，(4)rh-nps组，(5)ha/rh-nps组，(6)cp/ha/rh-nps组。从造模后的第3天到第10天，以25mg/kg的rh(每单位体重剂量)对小鼠进行治疗(口服)。在整个治疗期间，每天评估体重，可见的粪便稠度和粪便出血的变化。疾病活动指数(dai)定义为体重减轻(0-4分)，粪便稠度状态(0-4分)和粪便出血(0-4分)的总和(分数越低，小鼠越健康)。在终点第十天，将小鼠麻醉并安乐死，然后收集结肠和主要器官(心脏，肝脏，脾脏，肺和肾脏)。将器官和结肠固定在4％福尔马林中，包埋在石蜡中，切成薄片(5μm)，并进行h&e染色。使用包括兔抗claudin-1和兔抗zo-1在内的免疫组化试剂盒，通过免疫组化对福尔马林固定石蜡包埋的结肠切片进行免疫组织化学染色，以检测claudin-1和zo-1。随后，通过化学显色反应显示样品中claudin-1和zo-1的表达水平。结肠中的il-1β，il-6，inos和tnf-α细胞因子根据制造商的说明使用市售elisa试剂盒进行评估。进行蛋白质印迹分析以检测结肠蛋白claudin-1，zo-1，myd88，tlr4和nf-κbp65的表达水平。收集结肠样品，并使用放射免疫沉淀分析(ripa)裂解缓冲液匀浆。然后将针对claudin-1，zo-1，myd88，tlr4和nf-κbp65的一抗在4℃下孵育过夜。β-肌动蛋白和gapdh抗体用作内部对照，以确定蛋白质的均等负载。用imagej软件分析获得的化学发光信号。
二、试验结果
1、nps对dss诱发的小鼠结肠炎严重程度的影响
dss诱导的uc小鼠模型是一种易于生成且高度可重复的模型，类似于人类uc(例如体重减轻，血便和腹泻)。因此，本研究使用dss诱导的uc小鼠评估cp/ha/rh-nps的体内治疗效果。
随着图6a体重的变化，用cp/ha/rh-nps治疗的小鼠与原始体重几乎相同，只是略有变化，而其他四种药物治疗组则显示出不同程度的体重减轻。在图6b中观察到关于dai分数的类似差异。从第6天到第10天，cp/ha/rh-nps组的dai得分低于其他四组。特别是，经cp/ha/rh-nps处理的小鼠的dai得分在终点为0.67±1.03，与健康正常小鼠的dai得分相似。
在最终点处去除小鼠的结肠，然后拍照并测量。如图6c和图6d所示，cp/ha/rh-nps组的结肠长度明显长于游离rh，rh-nps和ha/rh-nps组的结肠长度(**p<0.01)，这表明cp/ha/rh-nps对dss治疗中观察到的典型结肠缩短具有良好的改善作用。此外，脾脏是人体免疫系统的重要器官，脾脏重量的增加被用作炎症严重程度的标志。如图6e所示，经cp/ha/rh-nps治疗的小鼠(平均脾脏重量为102.2±4.9mg)表现出比经ha/rh-nps(平均脾脏重量为平均脾脏重量为)或rh-nps(平均脾脏重量为149.4±4.0mg)治疗的小鼠更低的平均脾脏重量，表明cp/ha/rh-nps对结肠炎的改善作用更大。为了评估cp/ha/rh-nps对实验性结肠炎的炎症浸润的影响，测定了结肠组织中的mpo活性和组织病理学变化。mpo活性是嗜中性粒细胞浸润的标志物。如图6f所示，cp/ha/rh-nps组在所有治疗组中均表现出最低的结肠mpo活性，与模型组相比有显着差异(p<0.01)。此外，如图6g所示，dss组与正常组相比显示出炎症的证据，如结肠上皮的破坏、各种炎性细胞的浸润和粘液分泌杯状细胞的消耗所表明的。相对于dss组，rh-nps和cp/ha/rh-nps组中的小鼠隐窝更为完整，这表明rh-nps和cp/ha/rh-nps均能改善结肠炎症的体征和症状。重要的是，治疗后所有小鼠组的主要器官切片均未显示损害的组织病理学证据(图7)，表明cp/ha/rh-nps具有出色的生物相容性和低毒性。
2、nps通过抑制tlr4相关的nf-κb信号通路的抗炎作用
伴随发炎结肠区域中性粒细胞的浸润，巨噬细胞的活化导致促炎性细胞因子分泌，包括被识别为与炎症程度相关的关键指标的inos和细胞因子(例如，il-1β，inos，tnf-α和il-6)。因此，使用elisa试剂盒评估了cp/ha/rh-nps对小鼠结肠的治疗功效。如图8a所示，与健康组相比，dss组il-1β，inos，tnf-α和il-6的水平显着增加(p＜0.01)。同时，cp/ha/rh-nps抑制il-1β，inos，tnf-α和il-6的表达比其他治疗组更显著，这表明cp/ha/rh-nps载体是rh传递到发炎的结肠以增强uc的疗效的最佳的高效途径。
tlr4信号传导途径是一个通常被称为经典途径，涉及一系列蛋白质和细胞因子，介导炎症反应，并在uc的发病机理中起关键作用。然而，没有证据表明rh可以通过tlr4/nf-κb信号通路治疗uc。因此，基于dss诱导的与tlr4引起的结肠缩短相关的nf-κb活化，研究rh在该途径中的功效，并通过使用westernblotting分析评估典型蛋白(例如tlr4，myd88和nf-κb)进一步研究nps。如图8b所示，与正常组相比，模型组结肠组织中的tlr4，myd88和nf-κbp65总蛋白表达显着增加(p＜0.01)。然而，与其他组相比，cp/ha/rh-nps显着降低了这三种蛋白的表达(*p<0.05；**p<0.01)。总而言之，ha/rh-nps和cp/ha/rh-nps对tlr4/nf-κb信号通路具有良好的抑制作用，而cp/ha/rh-nps的抑制效果显著优于ha/rh-nps。
3、nps治疗可保护uc小鼠的结肠屏障
紧密连接蛋白的减少会增加肠的通透性，并导致结肠屏障功能障碍。通过tjs蛋白(包括zo-1和claudin-1)连接在一起的肠上皮细胞可阻止离子和小分子自由通过两个上皮细胞之间的空间。分别通过westernblotting和免疫组织化学方法检测zo-1和claudin-1的表达。如图9a所示，免疫组化染色中，正常组和cp/ha/rh-nps组的zo-1和claudin-1的免疫反应性强于模型组。同时，与模型组，游离rh，rh-nps组相比，cp/ha/rh-nps组中zo-1和claudin-1的平均面积密度显着增加(p<0.01，图9b)。此外，在图9c中也可以找到相同的结果，cp/ha/rh-nps组中zo-1和claudin-1的表达明显高于游离rh，rh-nps组(p<0.01)。结果表明，cp/ha/rh-nps组可有效保护uc小鼠的肠屏障，效果优于rh-nps组和游离rh。
综上，本发明研究了一种具有cp包被和ha修饰的nps(cp/ha/rh-nps)的递送系统，其具有双重靶向能力，可用于uc的口服治疗。cp/ha/rh-nps具有良好的可控粒径，狭窄的粒径分布，带负电荷的表面。该纳米结构是专门针对rh在抗炎和结肠损伤修复中的药理作用而设计的。cp/ha/rh-nps从外到内可以分为三层，分别是cp，ha和lf：
(1)cp层：根据体外对胃稳定性和释放曲线评价的研究结果，在cp的帮助下，cp/ha/rh-nps表现出良好的胃稳定性，并在含有丰富的肠道菌群的大鼠盲肠刺激下进行了rh的控制释放。重要的是，在体内靶向递送研究中，结果表明cp/ha/ir780-nps表面的cp可以帮助lf不在正常肠段周围提前进行lf暴露，而进一步集中暴露并靶向结肠病变。，即赋予了cp/ha/rh-nps结肠靶向能力。
(2)ha层：ha修饰的纳米颗粒可以通过cd44介导的内吞途径靶向巨噬细胞，从而增加巨噬细胞的摄取率，这在定性和定量分析的吸收评估研究中得到了证实。此外，该巨噬细胞靶设计可通过tlr4/myd88/nf-κb途径有效促进rh的抗炎作用，具有体内抗uc治疗效果。
(3)lf层：lf作为一种常见的纳米载体，具有丰富的来源和良好的载药能力，对rh的包封效率高(95.08％)。此外，这项研究证实了lf可以提高细胞摄取率，并可以增强大黄酸的修复作用。
与其他口服ndds相比，本发明乳铁蛋白大黄酸纳米粒子还具有两个优点：首先，nps中的所有纳米材料，例如cp，lf和ha，都是食品级的，并且对环境无害，并且其毒性远低于其他合成化学纳米材料。而且，纳米颗粒的制备方法相对简单并且易于按比例放大，并且药物和聚合物相对便宜并且可大量获得。其次，研究发现rh可以抑制tnf-α，il-6，il-1β和inos等促炎性细胞因子的表达水平，并改善dss诱导的小鼠结肠炎，并首先证实rh的抗炎作用是通过本研究中的tlr4/myd88/nf-κb途径。本发明使用纳米技术增强了uc治疗中rh的靶向能力和药理作用，提供了一种活性抗uc天然化合物rh，并设计了专门用于rh应用临床治疗的环保纳米载体。
综上，本发明提供了一种载药物的双重靶向药物递送纳米粒子，该纳米粒子生物相容性良好，稳定性良好，可口服给药，并且具有良好靶向能力。其中，本发明主要提供了一种载大黄酸的双重靶向药物递送纳米粒子，该纳米粒子除生物相容性良好，稳定性良好，可口服给药外，并且具有良好的结肠病变炎症和结肠损伤靶向能力。该纳米粒子口服给药时在胃和小肠中保持稳定性，释放药物慢，靶向到结肠病变部位后持续释放药物，治疗结肠炎，特别是溃疡性结肠炎效果良好。该纳米粒子的治疗效果优于单独使用大黄酸，以及其他结构的载大黄酸纳米粒子，具有良好的应用前景。
1.一种载药物的乳铁蛋白纳米粒子，其特征在于：它是具有三层结构的纳米粒；该三层结构从外到内分别是果胶层、透明质酸层、载药物的乳铁蛋白层。
2.根据权利要求1所述的载药物的乳铁蛋白纳米粒子，其特征在于：所述果胶层为钙离子交联后的果胶层。
3.根据权利要求1或2所述的载药物的乳铁蛋白纳米粒子，其特征在于：它是由如下重量配比的原料制备而成：乳铁蛋白50～100份，药物1～10份，透明质酸10～50份，果胶10～50份，氯化钙10～50份；
优选地，它是由如下重量配比的原料制备而成：乳铁蛋白50～60份，药物5～10份，透明质酸10～20份，果胶10～20份，氯化钙10～20份；
更优选地，它是由如下重量配比的原料制备而成：乳铁蛋白50份，药物5份，透明质酸20份，果胶10份，氯化钙10份。
4.根据权利要求3所述的载药物的乳铁蛋白纳米粒子，其特征在于：所述药物为大黄酸、姜黄素、绿原酸、大黄素或栀子苷；
优选地，所述药物为大黄酸。
5.根据权利要求4所述的载药物的乳铁蛋白纳米粒子，其特征在于：所述载药物的乳铁蛋白纳米粒子的制备方法包括如下步骤：
(1)将乳铁蛋白溶于水相，药物溶于油相，然后将水相和油相混合，得载药物的乳铁蛋白；
(2)将透明质酸加入载药物的乳铁蛋白中，使ha粘附在载药物的乳铁蛋白表面，得具有透明质酸的载药物的乳铁蛋白；
(3)在步骤(2)中加入果胶，然后加入氯化钙进行交联反应，离心，收集沉淀，即得。
6.根据权利要求5所述的载药物的乳铁蛋白纳米粒子，其特征在于：
步骤(1)中，所述水相为去离子水；
和/或，步骤(1)中，所述乳铁蛋白与水相的质量体积比为(1～10)mg：(1～10)ml；
和/或，步骤(1)中，所述油相为dmso；
和/或，步骤(1)中，所述药物与油相的的质量体积比为(1～10)mg：(1～10)ml；
和/或，步骤(1)中，所述将水相和油相混合后超声处理，然后透析、过滤；
和/或，步骤(2)中，所述将透明质酸加入载药物的乳铁蛋白中后室温下摇动2～5小时；
和/或，步骤(3)中，所述交联反应时间为2～5小时；
优选地，
步骤(1)中，所述乳铁蛋白与水相的质量体积比为5mg：2ml；
和/或，步骤(1)中，所述药物与油相的的质量体积比为5mg：1ml；
和/或，步骤(1)中，所述超声处理为以50％的振幅功率超声处理形成乳液。
7.一种制备权利要求1～6任一项所述的载药物的乳铁蛋白纳米粒子的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
(1)将乳铁蛋白溶于水相，药物溶于油相，然后将水相和油相混合，得载药物的乳铁蛋白；
(2)将透明质酸加入载药物的乳铁蛋白中，使ha粘附在载药物的乳铁蛋白表面，得具有透明质酸的载药物的乳铁蛋白；
(3)在步骤(2)中加入果胶，然后加入氯化钙进行交联反应，离心，收集沉淀，即得。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：
步骤(1)中，所述水相为去离子水；
和/或，步骤(1)中，所述乳铁蛋白与水相的质量体积比为(1～10)mg：(1～10)ml；
和/或，步骤(1)中，所述油相为dmso；
和/或，步骤(1)中，所述药物与油相的的质量体积比为(1～10)mg：(1～10)ml；
和/或，步骤(1)中，所述将水相和油相混合后超声处理，然后透析、过滤；
和/或，步骤(2)中，所述将透明质酸加入载药物的乳铁蛋白中后室温下摇动2～5小时；
和/或，步骤(3)中，所述交联反应时间为2～5小时；
优选地，
步骤(1)中，所述乳铁蛋白与水相的质量体积比为5mg：2ml；
和/或，步骤(1)中，所述药物与油相的的质量体积比为5mg：1ml；
和/或，步骤(1)中，所述超声处理为以50％的振幅功率超声处理形成乳液。
9.权利要求1～6任一项所述的载药物的乳铁蛋白纳米粒子在制备抗炎药物中的用途；所述载药物的乳铁蛋白纳米粒子中药物为大黄酸。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述药物为治疗结肠炎的药物；
优选地，所述药物为治疗溃疡性结肠炎的药物。
技术总结