本申请是申请号为202011453321.9、申请日为2020年12月11日、发明名称为“没食子酸及其衍生物和结构类似物在制备抗冠状病毒药物方面的应用”的分案申请。
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种抗冠状病毒的没食子酸组合物及其应用。
背景技术：
冠状病毒在系统分类上属套式病毒目(nidovirales)、冠状病毒科(coronaviridae)、冠状病毒属(coronavirus)。其中，冠状病毒属的病毒是具囊膜(envelope)、基因组为线性单股正链的rna病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。冠状病毒直径约80～120nm，基因组5′端具有甲基化的帽状结构，3′端具有poly(a)尾，基因组全长约27～32kb，是目前已知rna病毒中基因组最大的病毒。冠状病毒仅感染脊椎动物，包括人，目前已知感染人并带来极大疫情的冠状病毒有sars-cov、sars-cov-2、mers-cov、hcov-229e、hcov-nl63、hcov-oc43、hcov-hku1，可引起呼吸道、消化道、肝脏和神经系统产生疾病。人冠状病毒在1965年已被分离出来，但直至目前对它们的认识仍相当有限，冠状病毒的血清型和抗原变异性还不明确。且冠状病毒可以发生重复感染，表明其存在有多种血清型(已知至少有4种)并有抗原的变异，其免疫较困难，尚无特效的预防和治疗药物。
目前仅在实验研究中发现，氮尿嘧啶(αzauracil)及利巴韦林(病毒唑，ribavirin，virazole)，螺金刚烷(spiroadamantane)对冠状病毒有明显的抑制作用(向倩,王睿.冠状病毒感染特点与防治[j].中华医院感染学杂志,2003,013(011):1097-1100.)。
但是上述药物容易出现腹泻、贫血、头晕头痛、虚弱乏力等不良反应，存在一定的安全隐患；而且随着病毒的变异和新毒株的出现，这些化药的抗病毒效果大打折扣，比如2019年底出现的新型冠状病毒2019-ncov，直到目前尚未发现疗效确切的药物。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服现有冠状病毒防治技术的缺陷和不足，提供一种抗冠状病毒药物新选择，即一种抗冠状病毒的没食子酸组合物。发明人经过大量的创造性劳动发现，食子酸及其衍生物和结构类似物具有显著的抗冠状病毒效果，且该类物质广泛存在于多种植物中，来源天然，在食品及生物医药领域有广泛的应用，十分安全，因此在制备开发针对冠状病毒科的抗病毒药物方面具有很好的应用前景。
本发明的目的是提供一种抗冠状病毒的没食子酸组合物。
本发明另一目的是提供所述没食子酸组合物在制备抗冠状病毒科病毒的药物方面的应用。
本发明另一目的是提供一种抗冠状病毒科病毒的药物。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明研究显示，没食子酸及其衍生物和结构类似物对冠状病毒科病毒具有显著的抗病毒作用。
优选地，所述冠状病毒为冠状病毒属病毒。
具体目前已发现证实的所述冠状病毒属病毒包括sars-cov、sars-cov-2(或2019-ncov)、mers-cov、hcov-229e、hcov-nl63、hcov-oc43、hcov-hku1。
另外，本发明验证了几十种已报道的没食子酸衍生物或没食子酸结构类似物，对冠状病毒科病毒具有显著抗病毒作用的，这些没食子酸衍生物或没食子酸结构类似物其共性都含有没食子酰基和糖基，实验结果证明上述化合物对目前已经出现的冠状病毒均有较好的抗病毒效果。相关机理在进一步深入探讨。
因此我们认为优选地，所述没食子酸衍生物为含有没食子酰基和糖基的没食子酸衍生物所述没食子酸及其衍生物和结构类似物含有没食子酰基和糖基。
优选地，所述没食子酸结构类似物为含有没食子酰基和糖基的没食子酸结构类似物。
进一步地，所述没食子酰基为没食子酸上可取代基团被取代后所得；所述糖基为六碳糖上可取代基团被取代后所得。
具体地，所述没食子酸衍生物和结构类似物包括以下物质(如表1所示)：
鞣花酸、(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯、1,2,3,4,6-o-五没食子酰葡萄糖、1,2,3,4,6-5-o-没食子酰基-β-d-葡萄糖、表儿茶素没食子酸酯、槲皮素3-o-(6”-没食子酰基)-β-d-葡萄糖苷、山奈酚3-o-(6”-没食子酰基)-beta-d-吡喃葡萄糖苷、2-o-肉桂酰基-1-o-没食子酰基-β-d-葡萄糖苷、6-o-没食子酰葡萄糖、白藜芦醇-4'-o-β-d-(6”-o-没食子酰)葡萄糖苷、4'-羟基苯基-2-丁酮-4'-o-b-d-(2"-o-桂皮酰-6"-o-没食子酰葡萄糖苷、4'-羟基苯基-2-丁酮-4'-o-b-d-(2-o-没食子酰-6”-o-对羟基桂皮酰)葡萄糖苷、1,3,6-三-o-3,4,5-三羟基苯甲酰-beta-d-葡萄糖、1-没食子酸酰葡萄糖、1,4,6-三-o-没食子酰-beta-d-吡喃葡萄糖、白藜芦醇-4'-o-(6”-没食子酰基)吡喃葡糖苷、1,3,4,6-四-o-没食子酰-beta-d-吡喃葡萄糖、槲皮素3-o-(6”-没食子酰基)-β-d-半乳糖苷、3-o-没食子酰基-β-d-吡喃葡萄糖、1,4-二-o-没食子酰基-β-d-吡喃葡萄糖、1,4,6-三-o-没食子酰基-β-d-吡喃葡萄糖、1,2,6-三-o-没食子酰基-β-d-吡喃葡萄糖、1,2,3,6-四-o-没食子酰基-β-d-吡喃葡萄糖、1,2,4,6-四-o-没食子酰基-β-d-吡喃葡萄糖、6-o-没食子酰基-d-吡喃葡萄糖、3,6-二-o-没食子酰基-d-吡喃葡萄糖、3,4,6-三-o-没食子酰基-d-吡喃葡萄糖、1,3,4-三-o-没食子酰基-6-o-咖啡酰基-β-d-吡喃葡萄糖、1,3-o-二-没食子酰基-6-o-(s)-云实酰基-β-d-吡喃葡萄糖、槲皮素没食子酰葡萄糖苷、没食子酰芍药苷、3,3'-o-二甲基鞣花酸、2,3,8-三-o-甲基鞣花酸、3,4'-o-二甲基鞣花酸、4,4'-o-二甲基鞣花酸、3,3'-二-o-甲基-4-o-(beta-d-吡喃木糖基)鞣花酸、表儿茶素3-o-(3-o-甲基)没食子酸酯、表没食子儿茶素3-o-(3-o-甲基)没食子酸酯、2"-o-没食子酰基金丝桃苷、5-没食子酰基奎宁酸、3-没食子酰基奎宁酸、4-没食子酰基奎宁酸、3-o-没食子酰粘酸、4-o-没食子酰岩白菜素。
表1没食子酸衍生物及具体信息
本发明表1中所提供的仅为化合物其中的一种构体，表1化合物的立体异构体、几何异构体、水合物、溶剂化物或药学上可接受的盐或前药也应在本发明保护范围之内。
本发明的化合物和药学上可接受的盐还包括溶剂化物或水合物的形式。一般来说，溶剂化物或水合物的形式与非溶剂化的或非水合的形式等同，并涵盖在本发明的范围内。本发明中的某些化合物有可能存在多晶体或无定形的形式。总的来说，所有的物理形式具有同等的用途，并且涵盖在本发明的范围内。
本发明的“溶剂化物”是指一个或多个溶剂分子与本发明的化合物所形成的缔合物。形成溶剂化物的溶剂包括，但并不限于，水、异丙醇、乙醇、甲醇、二甲亚砜、乙酸乙酯、乙酸和氨基乙醇。术语“水合物”是指溶剂分子是水所形成的缔合物。
本发明的化合物存在自由形态，或合适的、作为药学上可接受的衍生物。根据本发明，药学上可接受的衍生物包括，但并不限于，药学上可接受的前药，盐，酯，酯类的盐，或能直接或间接地根据患者的需要给药的其他任何加合物或衍生物，本发明其他方面所描述的化合物，其代谢产物或他的残留物。
本发明上述制药应用中，还可添加药学上可接受的辅料、载体、赋形剂、稀释剂、媒介物等，制成不同的药物剂型，如注射剂、口服剂、喷剂、吸入剂等。
为了制备固体组合物如片剂，将主要的活性组分与药物赋形剂(或载体)进行混合以形成固体预配制组合物，其包含本发明的化合物的均匀混合物。当称这些预配制组合物为均匀的时候，它是指活性组分被均匀分散在整个组合物中，以致组合物可以容易地被细分成相同有效的单位剂型如片剂、丸剂以及胶囊剂。
本发明的片剂或丸剂可以被涂布或用其它方式被复合以提供一种具有延长作用优点的剂型，或保护片剂或丸剂免受胃中酸性条件的作用。例如，片剂或丸剂可以包括内剂量和外剂量成分，后者具有在前者之上的外皮的形式。可以用肠溶层来分隔两种成分，其中肠溶层用来阻止在胃中的崩解以及允许内成分完整进入十二指肠或被延迟释放。各种材料可以用于这样的肠溶层或涂层，上述材料包括许多高分子酸以及高分子酸与这样的材料如虫胶、十六烷醇、以及醋酸纤维素的混合物。
用于吸入法或吹入法的组合物包括在药学上可接受的含水溶剂或有机溶剂、或其混合物中的溶液和悬浮液，以及散剂。液体或固体组合物可以包含适宜的药用赋形剂。优选地，通过口服或鼻呼吸途径给予这些组合物以获得局部或全身效应。可以通过使用惰性气体来雾化在优选的药学可接受的溶剂中的组合物。可以直接从雾化装置吸入雾化溶液，或雾化装置可以连接于面罩帐状物、或间歇正压呼吸机。可以由以适当方式递送剂型的装置，优选口服或鼻途径，给予溶液、混悬剂、或散剂组合物。
基于上述研究结果，本发明进一步提供一种抗冠状病毒科病毒的组合物，包含没食子酸、没食子酸衍生物、没食子酸结构类似物中的任意两种或多种。
进一步地，所述组合物还包含唾液酸。
唾液酸来源可以为哺乳动物下颌提取物、燕窝、母乳、牛奶、鸡蛋、奶酪等。哺乳动物可以来源牛、猪等。
优选地，所述没食子酸及其衍生物和结构类似物与唾液酸的质量比为1:(0.01-20)。
更优选地，所述没食子酰及其衍生物和结构类似物与唾液酸的质量比为1:(0.1-15)。
本发明要求保护的化合物或组合物应用于制备抗冠状病毒药物，但不限于，使用本发明的化合物或药物组合物的有效量对患者给药来制备用于预防或治疗冠状病毒引发的疾病，减轻冠状病毒引发的疾病症状或者延缓冠状病毒引发的疾病的发展或发作的药品的用途。
本发明要求保护的化合物或组合物除了对人类治疗有益以外，还可应用于兽医治疗宠物、引进品种的动物和农场的动物，包括哺乳动物，啮齿类动物等等。另外一些动物的实例包括马、狗和猫等。
本发明具有以下有益效果：
本发明研究结果显示，将没食子酸与唾液酸组成组合物，抗冠状病毒效果有更加明显的提高，对包括sars-cov、sars-cov-2、mers-cov、hcov-229e、hcov-nl63、hcov-oc43、hcov-hku1的冠状病毒均具有明显的协同增效作用，而且经过活病毒实验验证疗效确切，在制备抗冠状病毒药物领域中具有广阔的应用前景。而且没食子酸类物质或唾液酸来源天然，广泛存在于多种动植物中，是自然界存在的天然活性化合物，在食品、生物、医药领域有广泛的应用，十分安全，开发药物基础好。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明活性病毒实验均为委托广东省疾控中心进行，微生物材料由广东省疾控中心提供。
实施例1细胞半数感染量(tcid50)的测定
1、实验材料
病毒：2019-ncov；细胞株：人胚胎肾细胞293(hek293细胞)；dmem培养基；96孔培养板。
2、实验步骤
(1)在离心管中用dmem培养基将病毒作连续10倍稀释，从10-1到10-6，冰上孵育1～2小时；
(2)将不同浓度的病毒液加入96孔培养板中，每一稀释度接种一纵排，共8孔，每孔接种100μl，两排加入不含病毒的dmem培养基作正常对照；
(3)将培养的人胚胎肾细胞293(hek293细胞)消化、悬浮、计数，往含有病毒的96孔板中每孔加入100μl细胞悬液，使细胞密度为2～3×105个/ml；
(4)37℃、5％co2的孵箱内培养，观察细胞病变效应(cpe)，到最低的稀释度不再出现病变为止(一般需观察5～7天)，在倒置显微镜下观察细胞病变效应(cpe)，记录细胞病变；
(5)采用reed-muench法，计算细胞半数感染量(tcid50)。
3、实验结果
根据病毒感染hek293细胞引起的细胞病变情况，采用reed-muench法计算得tcid50＝10－4.7/0.1ml。
实施例2对2019-ncov病毒感染hek293细胞活性的影响
1、实验材料：
(1)药物：唾液酸和表1化合物。
(2)其他实验材料
病毒为2019-ncov；细胞株为人胚胎肾细胞293(hek293细胞)；dmem培养基；96孔培养板。
2、实验步骤
(1)取细胞培养液将药物稀释成系列质量浓度(100、33.33、11.11、3.70、1.23、0.41和0.00mg/ml)；
(2)再取50tcid50的2019-ncov病毒液与上述药物溶液等体积中和；
(3)37℃孵育1h后，接种于hek293细胞中，100μl/孔，每一质量浓度4个复孔，同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和阳性对照组，37℃、5％co2培养，观察细胞形态；
(4)48h后，采用mtt法，用酶标仪测定od490值，计算药物半数有效浓度(ec50)。
3、实验结果：
如表2所示，化合物1-45均表现出较高抗病毒活性，其ec50值范围为3～20μg/ml。
表2化合物在已感染2019-ncov病毒人胚胎肾细胞293(hek293细胞)系上的ec50值
实施例3对sars-cov病毒感染hek293细胞活性的影响
1、实验材料：
(1)药物：唾液酸和表1化合物。
(2)其他实验材料
病毒为sars-cov；细胞株为人胚胎肾细胞293(hek293细胞)；dmem培养基；96孔培养板。
2、实验步骤：参考实施例2。
3、实验结果：
如表3所示，化合物1-45均表现出较高抗病毒活性，其ec50值范围为3～18μg/ml。
表3化合物在已感染sars-cov病毒人胚胎肾细胞293(hek293细胞)系上的ec50值
实施例4对mers-cov病毒感染hek293细胞活性的影响
1、实验材料：
(1)药物：唾液酸和表1化合物。
(2)其他实验材料
病毒为mers-cov；细胞株为人胚胎肾细胞293(hek293细胞)；dmem培养基；96孔培养板。
2、实验步骤：参考实施例2。
3、实验结果：
如表4所示，化合物1-45均表现出较高抗病毒活性，其ec50值范围为3～18μg/ml。
表4化合物在已感染mers-cov病毒人胚胎肾细胞293(hek293细胞)系上的ec50值
实施例5对hcov-229e病毒感染hek293细胞活性的影响
1、实验材料：
(1)药物：唾液酸和表1化合物。
(2)其他实验材料
病毒为hcov-229e；细胞株为人胚胎肾细胞293(hek293细胞)；dmem培养基；96孔培养板。
2、实验步骤：参考实施例2。
3、实验结果：
如表5所示，化合物1-45均表现出较高抗病毒活性，其ec50值范围为3～17μg/ml。
表5化合物在已感染hcov-229e病毒人胚胎肾细胞293(hek293细胞)系上的ec50值
实施例6对hcov-nl63病毒感染hek293细胞活性的影响
1、实验材料：
(1)药物：唾液酸和表1化合物。
(2)其他实验材料
病毒为hcov-nl63；细胞株为人胚胎肾细胞293(hek293细胞)；dmem培养基；96孔培养板。
2、实验步骤：参考实施例2。
3、实验结果：
如表6所示，化合物1-45均表现出较高抗病毒活性，其ec50值范围为3～16μg/ml。
表6化合物在已感染hcov-nl63病毒人胚胎肾细胞293(hek293细胞)系上的ec50值
实施例7对hcov-oc43病毒感染hek293细胞活性的影响
1、实验材料：
(1)药物：唾液酸和表1化合物。
(2)其他实验材料
病毒为hcov-oc43；细胞株为人胚胎肾细胞293(hek293细胞)；dmem培养基；96孔培养板。
2、实验步骤：参考实施例2。
3、实验结果：
如表7所示，化合物1-45均表现出较高抗病毒活性，其ec50值范围为3～18μg/ml。
表7化合物在已感染hcov-oc43病毒人胚胎肾细胞293(hek293细胞)系上的ec50值
实施例8对hcov-hku1病毒感染hek293细胞活性的影响
1、实验材料：
(1)药物：唾液酸和表1化合物。
(2)其他实验材料
病毒为hcov-hku1；细胞株为人胚胎肾细胞293(hek293细胞)；dmem培养基；96孔培养板。
2、实验步骤：参考实施例2。
3、实验结果：
如表8所示，化合物1-45均表现出较高抗病毒活性，其ec50值范围为3～17μg/ml。
表8化合物在已感染hcov-hku1病毒人胚胎肾细胞293(hek293细胞)系上的ec50值
实施例9与唾液酸组合物对冠状病毒感染hek293细胞活性的影响
1、实验材料：
(1)药物：表1中化合物1、3、4、5、14、17、18、22、23、24、25、28、29、30、39、40；唾液酸(cas：131-48-6)，化合物与唾液酸的比例均为1:10。
(2)其他实验材料
病毒：sars-cov、sars-cov-2、mers-cov、hcov-229e、hcov-nl63、hcov-oc43、hcov-hku1；细胞株：人胚胎肾细胞293(hek293细胞)；dmem培养基；96孔培养板。
2、实验步骤：参考实施例2。
3、实验结果：
如表9～15所示，化合物与唾液酸的组合均表现出更高的抗病毒活性，显示出明显的协同增效作用，其ec50值范围为2～10μg/ml。
表9组合物在已感染sars-cov冠状病毒人胚胎肾细胞293(hek293细胞)系上的ec50值
表10组合物在已感染sars-cov-2冠状病毒人胚胎肾细胞293(hek293细胞)系上的ec50值
表11组合物在已感染mers-cov冠状病毒人胚胎肾细胞293(hek293细胞)系上的ec50值
表12组合物在已感染hcov-229e冠状病毒人胚胎肾细胞293(hek293细胞)系上的ec50值
表13组合物在已感染hcov-nl63冠状病毒人胚胎肾细胞293(hek293细胞)系上的ec50值
表14组合物在已感染hcov-oc43冠状病毒人胚胎肾细胞293(hek293细胞)系上的ec50值
表15组合物在已感染hcov-hku1冠状病毒人胚胎肾细胞293(hek293细胞)系上的ec50值
实施例10与唾液酸组合物抗冠状病毒感染的协同作用研究
1、实验材料：
(1)药物：表1中化合物1；唾液酸(cas：131-48-6)，化合物与唾液酸的比例均为1:10。
(2)其他实验材料
病毒：sars-cov、sars-cov-2、mers-cov、hcov-229e、hcov-nl63、hcov-oc43、hcov-hku1；细胞株：人胚胎肾细胞293(hek293细胞)；dmem培养基；96孔培养板。
2、实验步骤：
取细胞培养液将药物稀释成系列质量浓度；再取50tcid50的病毒液分别与上述药物溶液等体积中和；37℃孵育1h后，接种于hek293细胞中，100μl/孔，每一质量浓度4个复孔，同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和加药组，37℃、5％co2培养，观察细胞形态；48h后，采用mtt法，用酶标仪测定od490值，同时计算细胞存活率和金正均q值(q<0.85为拮抗作用，0.85≤q<1.15为相加作用，q≥1.15为协同作用)。
3、实验结果：参见表16～22。
由表16～22可见，本发明化合物1与唾液酸组合使用对各病毒的q值均≥1.15，具有明显的协同增效作用。
表16化合物和唾液酸抗sars-cov冠状病毒效果
表17化合物和唾液酸抗sars-cov-2冠状病毒效果
表18化合物和唾液酸抗mers-cov冠状病毒效果
表19化合物和唾液酸抗hcov-229e病毒效果
表20化合物和唾液酸抗hcov-nl63病毒效果
表21化合物和唾液酸抗hcov-oc43病毒效果
表22化合物和唾液酸抗hcov-hku病毒效果
另外本发明还对化合物1和唾液酸的用量配比进行了考察，结果显示，化合物1和唾液酸的质量比控制在1:(0.01-20)范围内较优(更优选为1:(0.1-15)，最优选为1:10)，既能起到较明显的协同增效作用，又能减少用量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
1.一种抗冠状病毒科病毒的没食子酸组合物，其特征在于，所述组合物包括没食子酸和唾液酸。
2.根据权利要求1所述没食子酸组合物，其特征在于，所述没食子酸和唾液酸的质量比为1:(0.01-20)。
3.根据权利要求2所述没食子酸组合物，其特征在于，所述没食子酸和唾液酸的质量比为1:(0.1-15)。
4.根据权利要求3所述没食子酸组合物，其特征在于，所述没食子酸和唾液酸的质量比为1:10。
5.权利要求1～4任一所述没食子酸组合物在制备抗冠状病毒科病毒的药物方面的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述病毒为冠状病毒属病毒。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述冠状病毒属病毒为sars-cov、sars-cov-2、mers-cov、hcov-229e、hcov-nl63、hcov-oc43或hcov-hku1。
8.根据权利要求5～7任一所述应用，其特征在于，所述抗冠状病毒科病毒的药物还添加了药学上可接受的辅料、载体、赋形剂、稀释剂或媒介物。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述药物剂型为注射剂、口服剂、喷剂或吸入剂。
10.一种抗冠状病毒科病毒的药物，其特征在于，包含权利要求1～4任一所述没食子酸组合物。
技术总结