本发明涉及带有阳离子基团的抗氧化剂组合物以及这些组合物的用途。
背景技术：
线粒体功能障碍是很多疾病产生的原因，而氧化应激又是引起线粒体功能障碍的主要原因，大量自由基、活性氧造成线粒体膜脂质过氧化、蛋白质硝化，损伤线粒体dna、线粒体膜结构和电子传递链酶复合物，使氧化磷酸化减弱或不能进行，atp产生迅速减少，触发进一步的线粒体损伤。因此，抗氧化剂被认为能够有效改善线粒体功能障碍。然而，剂被认为能够有效改善线粒体功能障碍。然而，基于线粒体的双层膜结构，使得大多数药物不能穿过其双层膜到达线粒体内部发挥作用，人们开始研究线粒体靶向抗氧化剂来治疗相关疾病。
现有技术如申请号2004800241553公开了用作靶向线粒体的抗氧化剂的线粒体醌衍生物，该方法涉及明涉及药物学可接受的两亲性抗氧化化合物、所述化合物的组合物和剂型、以及依赖于所述化合物的方法和应用。包含的化合物都是线粒体醌衍生物，为甲氧基苯基烷基三苯基磷或甲氧基二氧代环己二烯基烷基三苯基磷衍生物；这些化合物、组合物、剂型、应用和方法可有效于治疗与氧化应激相关的疾病或症状。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种复合型抗氧化剂的线粒体靶向的抗氧剂组合物，具有优异的抗氧化效果。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种复合型抗氧剂，由双(4-羟基-3-甲苯基)硫醚改性β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯制备所得。
本发明采用β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯(抗氧化剂1076)作为主抗氧剂，双(4-羟基-3-甲苯基)硫醚与其部分酚羟基发生缩合发应，以接枝到β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯的苯环上，同时双(4-羟基-3-甲苯基)硫醚含有较多的羟基，与β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯可形成氢键，在4-二甲氨基吡啶的催化作用下，生成结构稳定的复合型抗氧剂，该氧化剂一方面具有一定的空间位阻，对酚羟基起到一定程度上的保护作用，以发挥其优异的抗氧化作用；另一方面双(4-羟基-3-甲苯基)硫醚的引入，增加了β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯共轭体系电子云密度，提高了复合型抗氧化剂中苯氧自由基的稳定性，使其更容易提供质子，捕获自由基，起到抗氧化的目的；除此之外，该复合型抗氧剂能阻止或延缓其他物质产生的自由基，分解过氧化物，使其形成离子型物质，阻止自由基的进一步生成，以起到抗氧化的作用。
优选地，β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯和双(4-羟基-3-甲苯基)硫醚在4-二甲氨基吡啶中进行反应。
优选地，β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯的重量为0.05～0.3份，双(4-羟基-3-甲苯基)硫醚为0.01～0.04份。
优选地，4-二甲氨基吡啶用量占β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯和双(4-羟基-3-甲苯基)硫醚总重量的1～3％。
一种线粒体靶向的抗氧剂组合物，其包括：复合型抗氧剂与烷基二甲基苄基铵盐。
优选地，线粒体靶向的抗氧剂组合物具有如下结构式：
其中r为连接基团，r1为烷基，x为复合型抗氧剂，z为阴离子。
优选地，r1为十二烷基、十四烷基或十八烷基。
优选地，r为苄基，能一定程度上增加共轭电子云密度，提高了复合型抗氧化剂中苯氧自由基的稳定性，达到优异抗氧化的作用。
优选地，z为氯离子或溴离子。
优选地，按重量份计，复合型抗氧化剂为0.1～0.5份，烷基二甲基苄基铵盐为0.2～1份。
优选地，线粒体靶向的抗氧剂组合物在制备用于治疗非酒精性脂肪肝、心血管疾病、线粒体氧化应激以及多发性硬化症药物中的用途。
本发明采用烷基二甲基苄基铵盐与复合型抗氧剂通过酰化反应形成线粒体靶向的抗氧剂组合物，该线粒体靶向的抗氧剂组合物含有铵根离子，与其连接的官能团有一定的吸电子效应，使其亲电性有一定的提高，可进入到线粒体内膜中，依赖线粒体的膜电势实现线粒体靶向，使其有效的集中在靶点，高效地消除辐射导致的线粒体产生的活性氧；另一方面该线粒体靶向的抗氧剂组合物具有一定的细胞渗透性，使抗氧化剂组合物在线粒体内膜中浓集至上千倍，对线粒体疾病有很好的治疗效果，可制备用于治疗非酒精性脂肪肝、心血管疾病、线粒体氧化应激以及多发性硬化症药物，也可应用在辐射防护领域。
为了进一步提高线粒体靶向的抗氧化剂组合物的抗氧化作用，采取的优选措施还包含：
在制备复合型抗氧剂时，加入赤藓糖醇，其添加量为β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯和双(4-羟基-3-甲苯基)硫醚总重量的0.01～0.04％，其含有较多的羟基可与复合抗氧剂中羧基发生酯化反应，生成酯基，在一定程度上增加复合抗氧化的电子云密度，提高复合型抗氧化剂的自由基稳定性，进一步提高抗氧剂捕获自由基的能力，达到有效抗氧化的目的；同时添加赤藓糖醇的复合抗氧剂与线粒体靶向烷基二甲基苄基铵盐结合，对其空间位阻有一定的增大，因此对其与线粒体内膜的靶向作用几乎无影响。
本发明由于采用复合型氧化剂与烷基二甲基苄基铵盐结合形成线粒体靶向的抗氧化剂组合物，因而具有如下有益效果：线粒体靶向的抗氧化剂组合物能产生稳定的苯氧自由基，能阻止或延缓其他物质产生的自由基，且有效的集中在线粒体靶点，高效地消除辐射导致的线粒体产生的活性氧和自由基，起到优异的抗氧化效果，用于治疗非酒精性脂肪肝、心血管疾病、线粒体氧化应激以及多发性硬化症，也可应用在辐射防护领域。因此，本发明是一种复合型抗氧化剂的线粒体靶向的抗氧剂组合物，具有优异的抗氧化效果。
附图说明
图1为抗氧剂1076与实施例1复合型抗氧化剂的红外光谱图；
图2为线粒体靶向的抗氧化剂组合物在溶剂中浓度变化曲线；
图3为线粒体靶向的抗氧化剂组合物的dpph清除率图；
图4为线粒体靶向的抗氧化剂组合物抑制脂质过氧化的ic50值。
具体实施方式
本实施例所使用的β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯为市购，外观为白色粉末，纯度＞98％；双(4-羟基-3-甲苯基)硫醚为市购，外观为白色粉末；4-二甲氨基吡啶为市购，外观为白色晶体，纯度≥99％；烷基二甲基苄基铵盐为十二烷基二甲基苄基氯化铵或十四烷基二甲基苄基溴化铵或铵或十八烷基二甲基苄基溴化铵为市购，无色液体；
s1：一种复合型抗氧化剂的制备，按重量份计，称取0.05～0.3份β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯、0.01～0.04份双(4-羟基-3-甲苯基)硫醚与占总重量1～3％的4-二甲氨基吡啶置于四口烧瓶中，并加入50～80ml无水乙醇溶解，然后放入45～55℃的恒温磁力搅拌水浴中，打开冷凝水，通入氮气保护，反应1～3h，停止反应，冷却至室温，即得到复合型抗氧化剂。
s2：线粒体靶向的抗氧化剂组合物的制备，将上述得到的0.1～0.5份复合型抗氧化剂与0.2～1份烷基二甲基苄基铵盐置于60～65℃氩气下的密封kimax管内搅拌20～22h，使其混合均匀；将残余物溶于少量0.5～1ml二氯甲烷或二溴甲烷中，并倒入5～9ml乙醚中以产生沉淀，在沉淀沉降后倒出上清液，并用5～10ml去离子水洗涤残余物，然后将残余物溶于5～10ml乙醇并真空除去溶剂。将残余物再次溶于0.5～1ml二氯甲烷中，用5～9ml乙醚稀释并除去溶剂，将残余物置于真空系统中放置20～24h，得到线粒体靶向的抗氧化剂组合物。
以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：
实施例1
一种线粒体靶向的抗氧化剂组合物，其制备方法包括以下步骤：
s1：一种复合型抗氧化剂的制备，按重量份计，称取0.08份β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯、0.03份双(4-羟基-3-甲苯基)硫醚与占总重量2％的4-二甲氨基吡啶置于四口烧瓶中，并加入60ml无水乙醇溶解，然后放入45℃的恒温磁力搅拌水浴中，打开冷凝水，通入氮气保护，反应1h，停止反应，冷却至室温，即得到复合型抗氧化剂。
s2：线粒体靶向的抗氧化剂组合物的制备，将上述得到的0.2份复合型抗氧化剂与0.7份十四烷基二甲基苄基氯化铵置于63℃氩气下的密封kimax管内搅拌20h，使其混合均匀；将残余物溶于少量0.5ml二氯甲烷中，并倒入8ml乙醚中以产生沉淀，在沉淀沉降后倒出上清液，并用5ml去离子水洗涤残余物，然后将残余物溶于7ml乙醇并真空除去溶剂。将残余物再次溶于0.5ml二氯甲烷中，用6ml乙醚稀释并除去溶剂，将残余物置于真空系统中放置22h，得到线粒体靶向的抗氧化剂组合物。
实施例2
一种线粒体靶向的抗氧化剂组合物，其制备方法包括以下步骤：
s1：一种复合型抗氧化剂的制备，按重量份计，称取0.15份β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯、0.04份双(4-羟基-3-甲苯基)硫醚与占总重量2％的4-二甲氨基吡啶置于四口烧瓶中，并加入60ml无水乙醇溶解，然后放入50℃的恒温磁力搅拌水浴中，打开冷凝水，通入氮气保护，反应2h，停止反应，冷却至室温，即得到复合型抗氧化剂。
s2：线粒体靶向的抗氧化剂组合物的制备，将上述得到的0.5份复合型抗氧化剂与0.9份十二烷基二甲基苄基氯化铵置于65℃氩气下的密封kimax管内搅拌22h，使其混合均匀；将残余物溶于少量0.8ml二氯甲烷中，并倒入9ml乙醚中以产生沉淀，在沉淀沉降后倒出上清液，并用7ml去离子水洗涤残余物，然后将残余物溶于5ml乙醇并真空除去溶剂。将残余物再次溶于0.8ml二氯甲烷中，用7ml乙醚稀释并除去溶剂，将残余物置于真空系统中放置20h，得到线粒体靶向的抗氧化剂组合物。
实施例3
一种线粒体靶向的抗氧化剂组合物，其制备方法包括以下步骤：
s1：一种复合型抗氧化剂的制备，按重量份计，称取0.17份β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯、0.02份双(4-羟基-3-甲苯基)硫醚与占总重量3％的4-二甲氨基吡啶置于四口烧瓶中，并加入70ml无水乙醇溶解，然后放入55℃的恒温磁力搅拌水浴中，打开冷凝水，通入氮气保护，反应2h，停止反应，冷却至室温，即得到复合型抗氧化剂。
s2：线粒体靶向的抗氧化剂组合物的制备，将上述得到的0.1份复合型抗氧化剂与0.5份十四烷基二甲基苄基溴化铵置于62℃氩气下的密封kimax管内搅拌21h，使其混合均匀；将残余物溶于少量0.4ml二溴甲烷中，并倒入5ml乙醚中以产生沉淀，在沉淀沉降后倒出上清液，并用10ml去离子水洗涤残余物，然后将残余物溶于9ml乙醇并真空除去溶剂。将残余物再次溶于0.7ml二溴甲烷中，用6ml乙醚稀释并除去溶剂，将残余物置于真空系统中放置24h，得到线粒体靶向的抗氧化剂组合物。
实施例4
一种线粒体靶向的抗氧化剂组合物，与实施例1不同的是，步骤s1中β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯的添加量为0.25份。
实施例5
一种线粒体靶向的抗氧化剂组合物，与实施例1不同的是，步骤s1中双(4-羟基-3-甲苯基)硫醚的添加量为0.01份。
实施例6
一种线粒体靶向的抗氧化剂组合物，与实施例1不同的是，步骤s1中按重量份计，称取0.08份β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯、0.03份双(4-羟基-3-甲苯基)硫醚、占β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯和双(4-羟基-3-甲苯基)硫醚总重量0.02％的赤藓糖醇与2％的4-二甲氨基吡啶置于四口烧瓶中，并加入60ml无水乙醇溶解，然后放入45℃的恒温磁力搅拌水浴中，打开冷凝水，通入氮气保护，反应1h，停止反应，冷却至室温，即得到复合型抗氧化剂。
实施例7
一种线粒体靶向的抗氧化剂组合物，与实施例6不同的是，赤藓糖醇的添加量为β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯和双(4-羟基-3-甲苯基)硫醚总重量的0.01％。
实施例8
一种线粒体靶向的抗氧化剂组合物，与实施例6不同的是，赤藓糖醇的添加量为β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯和双(4-羟基-3-甲苯基)硫醚总重量的0.03％。
对比例1
一种线粒体靶向的抗氧化剂组合物，与实施例1不同的是，步骤s1中不添加β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯。
对比例2
一种线粒体靶向的抗氧化剂组合物，与实施例1不同的是，步骤s1中不添加双(4-羟基-3-甲苯基)硫醚。
对比例3
一种线粒体靶向的抗氧化剂组合物，与实施例1不同的是，步骤s2中将十四烷基二甲基苄基氯化铵替换为三苯基膦氢溴酸盐。
试验例1
1.抗氧剂1076与实施例1复合型抗氧化剂的红外光谱图
采用nexus型号(nicolet公司)红外光谱仪，smartcollector专用反射附件进行测试，omnic软件操作kbr为参比基质，扫描叠加64次，每个样品取适量均匀涂抹于kbr载片上，自然干燥，测定波长范围为450～4000cm-1。
图1为抗氧剂1076与实施例1复合型抗氧化剂的红外光谱图。从图1可以看出，抗氧化剂1076即β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯的红外谱图与复合型抗氧化剂红外谱图的位移有一定的区别；已知在抗氧化剂1076红外谱图中，3640.9cm-1为羟基的伸缩振动峰，在2958.3cm-1和1434.8处碳氢键的伸缩振动峰；在1735.6cm-1处为羰基的伸缩振动峰；在复合型抗氧化剂谱图中可知，在3654.2cm-1处为酚羟基的伸缩振动峰，相比于抗氧化剂1076有一定的加强，且峰变宽；在3349.7cm-1为羟基缔合键的伸缩振动峰；在2897.5cm-1处为碳氢键的伸缩振动峰；在1756.4cm-1处为羰基的伸缩振动；在1334.4cm-1处为酯基的伸缩振动峰；在998.7cm-1处为苯环上c-h面的弯曲振动峰；在786.8cm-1处为硫碳单键的伸缩振动峰；由此可知，双(4-羟基-3-甲苯基)硫醚接枝到β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯得到了稳定的复合型抗氧化剂。
2.线粒体靶向的抗氧化剂组合物的稳定性
采用高效液相色谱(hplc)测定在复合型抗氧化剂在溶剂中的稳定性。将1mg复合型抗氧化剂溶于0.1mol50％的甲醇溶液中，将5ml溶液并置于玻璃瓶中，空气或氮气吹扫，密封并放置储存，于第0、2、4、8、16天收集等分试样(0.25ml)并用hplc测定浓度。
图2为线粒体靶向的抗氧化剂组合物在溶剂中浓度变化曲线。从图2可以看出，实施例1与实施例6的稳定性较好，在甲醇溶液中放置16天，浓度仍能达到95％以上，且实施例6的稳定性稍好于实施例1，可能是在制备复合型抗氧化剂时添加赤藓糖醇，能与β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯和双(4-羟基-3-甲苯基)硫醚发生化学反应，得到结构稳定的复合型抗氧化剂，提高了复合型抗氧化剂的稳定性。对比实施例1与对比例1-3，实施例1的稳定性远高于对比例1-3，这说明同时添加β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯和双(4-羟基-3-甲苯基)硫醚能够提高复合型抗氧化剂的稳定性，且使用β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯作为线粒体靶向载体与复合型抗氧剂结合相比于三苯基膦氢溴酸盐有更好的稳定性。
3.线粒体靶向的抗氧化剂组合物清除自由基能力的测定
取一定量的dpph，用无水乙醇配制成0.04mg/ml的dpph溶液。分别取2ml浓度2mg/ml的样品溶液，加入2mldpph溶液，混合均匀，室温放置30min后，5000r/min离心10min。取上清液于517nm处测吸光值。用vc作为阳性对照，清除率越大，抗氧化能力越强。样品对dpph自由基的清除率用以下公式计算：
dpph清除率＝1-(a1-a2)/a0×100％
其中：
a0—2ml无水乙醇 2mldpph溶液的吸光值；
a1—2ml样品溶液 2mldpph溶液的吸光值；
a2—2ml样品溶液 2mldpph溶液的吸光值。
图3为线粒体靶向的抗氧化剂组合物的dpph清除率图。从图3可以看出，实施例1-5的dpph清除率均大于82.5％，且实施例6-8的dpph清除率大于87％，且实施例6的dpph清除率高于实施例1，这说明在复合型抗氧剂中添加赤藓糖醇，在一定程度上增加复合抗氧化的电子云密度，提高抗氧剂捕获自由基的能力，进一步增强抗氧化的效果；对比实施例1与对比例1-3，实施例1的dpph清除率远高于对比例1-3，这说明同时添加β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯和双(4-羟基-3-甲苯基)硫醚能够提高复合型抗氧化剂的抗氧化性，且相比于三苯基膦氢溴酸盐，使用β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯作为线粒体靶向载体与复合型抗氧剂结合能更高效地集中到线粒体内膜，起到更好的抗氧化效果。
4.线粒体靶向的抗氧化剂组合物抑制脂质过氧化ic50值的测定
利用大鼠大脑匀浆进行测试，将大鼠大脑匀浆在含不同线粒体靶向的抗氧化剂组合物的条件下温育并用tbars试验定量在温育过程中发生的氧化损伤，由此测定出抑制氧化损伤50％所述的线粒体靶向的抗氧化剂组合物的浓度。在大鼠大脑匀浆中测定抑制脂质过养化的ic50值，该值为在2～3个大脑制备物上测定值的平均值。
图4为线粒体靶向的抗氧化剂组合物抑制脂质过氧化的ic50值。从图4可以看出，实施例1-5的ic50值低于160nm即可抑制50％的氧化损害，实施例6-8的ic50值低于144nm，实施例6抑制50％的氧化损害所需线粒体靶向的抗氧化剂组合物的浓度低于实施例1，这说明在复合型抗氧剂中添加赤藓糖醇，提高了抗氧剂捕获自由基的能力，进一步提高抗氧化剂的抗氧化性；对比实施例1与对比例1-3，实施例1的ic50值远低于对比例1-3，这说明同时添加β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯和双(4-羟基-3-甲苯基)硫醚能够极大地提高复合型抗氧化剂的抗氧化性，且相比于三苯基膦氢溴酸盐，使用β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯作为线粒体靶向载体与复合型抗氧剂结合能更高效地集中到线粒体内膜，起到更好的抗氧化效果。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案、也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
1.一种复合型抗氧剂，由双(4-羟基-3-甲苯基)硫醚改性β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯制备所得。
2.根据权利要求1所述的一种复合型抗氧剂，其特征是：所述β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯和双(4-羟基-3-甲苯基)硫醚在4-二甲氨基吡啶中进行反应。
3.根据权利要求1所述的一种复合型抗氧剂，其特征是：按重量份计，所述β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯为0.05～0.3份，双(4-羟基-3-甲苯基)硫醚为0.01～0.04份。
4.根据权利要求3所述的一种复合型抗氧剂，其特征是：所述4-二甲氨基吡啶用量占β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸正十八碳醇酯和双(4-羟基-3-甲苯基)硫醚总重量的1～3％。
5.一种线粒体靶向的抗氧剂组合物，其包括：如权利要求1所述的复合型抗氧剂与烷基二甲基苄基铵盐。
6.根据权利要求5所述的线粒体靶向的抗氧剂组合物，其特征是：所述组合物具有如下结构式：
其中r为连接基团，r1为烷基，x为复合型抗氧剂，z为阴离子。
7.根据权利要求6所述的线粒体靶向的抗氧剂组合物，其特征是：所述r1为十二烷基、十四烷基或十八烷基。
8.根据权利要求6所述的线粒体靶向的抗氧剂组合物，其特征是：所述r为苄基。
9.根据权利要求6所述的线粒体靶向的抗氧剂组合物，其特征是：所述z为氯离子或溴离子。
10.权利要求5-9任一项所述的抗氧剂组合物在制备用于治疗非酒精性脂肪肝、心血管疾病、线粒体氧化应激以及多发性硬化症药物中的用途。
技术总结