本发明属于医药技术领域，涉及溴酚-吡唑啉类化合物的新用途，尤其是溴酚-吡唑啉类化合物在治疗猪冠状病毒疾病中的应用。
背景技术：
猪冠状病毒(pedv、tgev和pdcov等)具有高度的传染性，与腹泻和呕吐等严重疾病有关，并增加了仔猪的死亡率(通常为100％)。它们可在养猪国引起零星暴发(地方性)或大规模流行病，具有发病急、高传染性和高致死率的特征，给亚洲、欧洲和美洲的养猪业造成了严重的经济损失。2010年10月以来，中国也发生了一系列大规模的猪流行性腹泻病毒(pedv)疫情，造成了高达上千亿元的巨大经济损失。
2010年，流行性腹泻(ped)发病率显著升高，经专家采样分析得知，此流行性腹泻病毒为变异毒株，主要是在蝙蝠体内发生了变异，变异后病毒的毒力显著增加。对于猪群而言，流行性腹泻(ped)对哺乳仔猪的危害最为严重，死亡率接近100％。尽管尝试使用疫苗(针对原型pedv株cv777)，但是由于pedv存在多种变异毒株，效果并不明显。例如，从2013年12月至2015年6月收集的腹泻猪粪便或肠道样本中检测到15个新的野外pedv突变体。
猪传染性胃肠炎病毒(tgev)同样是冠状病毒科冠状病毒属的成员，其所引起的传染性胃肠炎的危害性不亚于流行性腹泻(pedv)。1946年首次在美国报道，随后很快传遍世界各地。tge在我国流行形势严峻，在短期内即可引起各种年龄的猪100％发病，常伴随猪流行性腹泻(ped)混合感染，病势依日龄而异，日龄越小，死亡率也愈高，2周龄内的仔猪死亡率高达90％-100％。
目前国际国内市场均尚无针对猪冠状病毒的有效药物上市，除了采用接种疫苗进行提前预防(尚无免疫效果确切的疫苗)，只能采用中药和抗体保守治疗，但由于毒株在不断的变异中，毒力不断增强，呈现出越来越大的杀伤力，中药和抗体治疗效果不佳。
溴酚-吡唑啉类化合物是发明人前期研究开发设计的具有抑制新型冠状病毒活性的化合物，在制备治疗人冠状病毒肺炎的药物中具有广阔的应用前景。因此，溴酚-吡唑啉类化合物是一类极具药用潜力的化合物，进一步发现其新的药用功效将具有十分重要的意义。
技术实现要素：
针对上述现有技术，本发明的目的是提供溴酚-吡唑啉类化合物新的医药用途。本发明研究发现，溴酚-吡唑啉类化合物能够在细胞水平抑制猪冠状病毒(如pedv、tgev等)的复制；在临床试验中能够治疗猪冠状病毒疾病(如ped、tge等)，极大提高染病仔猪的存活率，可用于制备治疗猪冠状病毒疾病的药物。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供溴酚-吡唑啉类化合物在制备治疗猪冠状病毒疾病的药物中的应用。
上述应用中，所述溴酚-吡唑啉类化合物具有如下式i所示的结构通式：
其中：r1、r2、r3、r4、r5分别选自h、f、br、oh、och3中的任一种；
r6选自h、cho、coch3、coch2ch3、coch2ch2ch3、cooch3、cooch2ch3、ph、ch2ph、conh2、csnh2或
r7、r8、r9分别选自h、br、no2、oh、ch3、och3或
r10、r11、r12分别选自h、br、no2、oh、ch3、c2h5、och3、oc2h5、异丙基、异丁基、叔丁基、特戊基中的任一种。
优选的，所述溴酚-吡唑啉类化合物为如下任一所示的化合物：
上述应用中，所述猪冠状病毒疾病是由包括但不限于猪传染性胃肠炎病毒(tgev)、猪流行性腹泻病毒(pedv)、猪呼吸道冠状病毒(prcv)、猪丁型冠状病毒(pdcov)、猪血凝性脑脊髓炎病毒(phev)等猪冠状病毒引起的胃肠炎、腹泻、呼吸道炎症和脑脊髓炎等疾病。
本发明的第二方面，提供一种治疗猪冠状病毒疾病的药物，所述药物以上述有效量的权利要求1中所述的溴酚-吡唑啉类化合物为活性成分。
进一步的，需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体，所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
进一步的，将上述溴酚-吡唑啉类化合物中的一种或两种以上的混合物，与药学上可接受的药物载体混合可制成预防和/或治疗猪冠状病毒疾病的片剂、胶囊剂、口服液、颗粒剂、丸剂或注射剂等。
本发明的第三方面，提供一种治疗由猪冠状病毒感染引起的疾病的方法，包括如下步骤：
给受体动物施用有效量的式i所示的溴酚-吡唑啉类化合物以治疗病毒感染引起的疾病。
本发明的有益效果：
本发明首次研究发现，溴酚-吡唑啉类化合物对猪冠状病毒具有较好的抑制活性，能够抑制猪冠状病毒的复制；临床试验证明，溴酚-吡唑啉类化合物能够治疗由pedv、tgev等引起的猪冠状病毒疾病，极大提高染病仔猪的存活率。
附图说明
图1为本发明实施例提供的化合物1-6在细胞中抑制猪流行性腹泻病毒(pedv)复制的测定结果，评价不同浓度的化合物对病毒rna复制的影响。
图2为本发明实施例提供的化合物4和6在细胞中抑制猪传染性胃肠炎病毒(tgev)复制的测定结果，评价不同浓度的化合物对病毒rna复制的影响。
图3.病猪组织pcr检测。图中泳道1～3分别为病猪组织样品的tgev(传染性胃肠炎病毒)、pedv(流行性腹泻病毒)和pgar(轮状病毒)；m为dnamarker.
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。具体实施例中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分所介绍的，猪冠状病毒疾病给养猪业造成了严重的经济损失，但目前尚无针对猪冠状病毒的有效治疗药物。
冠状病毒(coronaviruses，covs)是一类具有囊膜的单链rna病毒，也是目前已知的基因组最大的rna病毒，在分类上属于套式病毒目(nidovirales)冠状病毒科(coronaviridae)冠状病毒属(coronavirus)。该病毒可以引起动物呼吸道、消化道和神经系统疾病，主要感染人和脊椎动物。
猪冠状病毒类型较多，主要有α冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒(pedv)和猪传染性胃肠炎病毒(tgev)，它们主要引起仔猪腹泻；β冠状病毒属的猪血凝性脑脊髓炎病毒(phev)主要引起仔猪的消化系统或神经系统症状。
针对2019年底爆发的新冠病毒肺炎疫情，发明人研发一种能够高效抑制新型冠状病毒(covid-19)的溴酚-吡唑啉类化合物，其具有治疗冠状病毒肺炎的功效(具体见中国专利申请cn111848516a)。
但由于新型冠状病毒(covid-19)属于人源性冠状病毒，尽管冠状病毒种类繁多，存在广泛，但通常对其天然宿主的受体亲和性最高，对于感染宿主有明显的种属特异性，目前还未发现有人源性冠状病毒和猪冠状病毒相互感染的现象。而且，将从genbank数据库中收集的人新型冠状病毒(sars-cov-2)的基因组序列与猪冠状病毒进行同源性比对发现，猪流行性腹泻病毒(pedv)和猪传染性胃肠炎病毒(tgev)与sars-cov-2的进化关系较远，基因组同源性仅为42.8％-43.5％(参见“新型冠状病毒(sars-cov-2)与常见家养动物冠状病毒的同源性分析”)。
由此可知，猪冠状病毒与人新型冠状病毒的同源性较低，亲缘关系较远，且导致的病症也完全不同。因此，猪冠状病毒和人新型冠状病毒属于两种不同类型的病毒，能够抑制人新型冠状病毒的物质是难以预知其对猪冠状病毒的作用效果的。
为进一步拓展溴酚-吡唑啉类化合物的药用领域，本发明进行了大量的尝试，结果意外的发现，溴酚-吡唑啉类化合物对猪冠状病毒具有较好的抑制活性，能够抑制猪冠状病毒的复制；临床试验证明，溴酚-吡唑啉类化合物能够治疗由pedv、tgev等引起的猪冠状病毒疾病，极大提高染病仔猪的存活率，由此提出了本发明。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
其中：化合物1-6的结构式如下所示：
化合物1-6的制备可以参考中国专利申请(cn111848516a)记载的方法，反应历程如下(以化合物4和6为例)：
实施例1：溴酚-吡唑啉类化合物干扰细胞中的猪流行性腹泻病毒(pedv)复制
本实施例评估了溴酚-吡唑啉类化合物是否可以在临床分离株猪流行性腹泻病毒(pedv)感染的veroe6细胞中阻止猪冠状病毒复制。
具体操作：将预先播种的veroe6细胞(5×104细胞/孔)用不同浓度(2μm、10μm)的待测溴酚-吡唑啉类化合物预处理1h，然后添加猪冠状病毒(pedv，moi为0.05)使其感染2h。然后，除去病毒-化合物的混合物，并用新鲜的含有溴酚-吡唑啉类化合物的培养基进一步培养细胞。24小时后，收集细胞上清液，并对上清液中的vrna进行qrt-pcr分析。以不添加溴酚-吡唑啉类化合物处理作为对照。
实验结果：如图1所示，在猪流行性腹泻病毒(pedv)感染的vero细胞中，10μm和2μm的浓度的化合物都显示出较强的抗病毒作用，其中化合物4抑制猪冠状病毒复制活性最强(图1)。
实施例2：溴酚-吡唑啉类化合物干扰细胞中猪传染性胃肠炎病毒(tgev)复制
本实施例评估了溴酚-吡唑啉类化合物是否可以在临床分离株猪传染性胃肠炎病毒(tgev)感染的veroe6细胞中阻止猪冠状病毒复制。
具体操作：将预先播种的veroe6细胞(5×104细胞/孔)用不同浓度(2μm、10μm)的待测溴酚-吡唑啉类化合物预处理1h，然后添加猪冠状病毒(tgev，moi为0.05)使其感染2h。然后，除去病毒-化合物的混合物，并用新鲜的含有溴酚-吡唑啉类化合物的培养基进一步培养细胞。24小时后，收集细胞上清液，并对上清液中的vrna进行qrt-pcr分析。以不添加溴酚-吡唑啉类化合物处理作为对照。
实验结果：如图2所示，在猪传染性胃肠炎病毒(tgev)感染的vero细胞中，10μm和2μm的浓度的化合物都显示出较强的抗病毒作用，其中化合物4抑制猪冠状病毒复制活性最强(图2)
实施例3：化合物4的治疗猪流行性腹泻病毒感染病猪的临床试验
1、病猪感染病毒pcr检测
通过对2020年11月诸城养猪场的病猪组织进行pcr检测，以确定其感染病毒类型。pcr结果显示(图3)，病猪组织样品中检测到pedv(流行性腹泻病毒)，未测到传染性胃肠炎病毒和轮状病毒。
2、化合物4治疗流行性腹泻病猪的临床试验
选择10日龄内流行性腹泻病猪，随机分为4组，分别为未治疗组、中药治疗组、4号治疗组和lgy抗体治疗组。中药治疗组采用蒲公英、紫花地丁、黄连、板蓝根等组成的复方煎汤灌服，2次/天，连用3天。化合物4给药剂量25mg/只，一日两次，给药方式为葡萄糖溶液冲服。lgy抗体治疗组采用喂服鸡卵抗体(lgy)25mg/只，一日两次。未治疗组、中药治疗组和lgy抗体治疗组，灌服与4号治疗组相同剂量葡萄糖溶液。治疗期间母乳喂养。
3、临床试验结果：
(1)流行性腹泻病猪临床治疗结果
流行性腹泻病猪临床治疗结果见表1，由表1可以看出：化合物4治疗流行性腹泻病猪效果显著，死亡率远低于其他3组，有效率100％。未治疗组，死亡10只，死亡率90.9％；中药治疗组死亡9只，死亡率75％，有效率25％；4号治疗组，死亡0只，死亡率0％，有效率100％；lgy抗体组死亡5只，死亡率83.3％，有效率16.7％。
表1：流行性腹泻临床试验数据汇总
注1：括弧内6 5和6 6表示试验对象分置于两栏，各栏仔猪数目。(8 8 8 11 10 6 8 6 6)表示实验对象置于9栏，各栏仔猪数目。
注2：试验观察72小时，死亡率按试验终点仔猪死亡数目计算，有效率按腹泻评分指数(表2)计算。
(2)流行性腹泻病猪临床治疗腹泻评分
流行性腹泻病猪临床治疗过程中，对未治疗组(6只)、4号治疗组(8只)和lgy抗体治疗组(6只)的病猪腹泻指数进行抽样评分。结果如表2显示，未治疗组的6只病猪在48小时内全部死亡；lgy抗体治疗组的5个病猪在72小时内死亡，1个病猪病情逐渐减轻；4号治疗组的8只病猪，在口服给药后24小时腹泻明显减轻，48小时后大部分康复，72小时后全部康复，治愈率100％。
表2：腹泻评分指数
注：(成型粪便，0；稠状粪便，不成型1；粪水分离，2；水样粪便，3。评分为0或1视为正常；评分为2或3视为腹泻。)
实施例4：利用溴酚-吡唑啉类化合物制备抗病毒制剂或治疗猪冠状病毒疾病的药物
采用上述实施例1-2中的溴酚-吡唑啉类化合物，可以制备成抑制病毒复制的抗病毒制剂，或者作为活性成分与药学上可接受的载体组合制备成药物组合物。
上述的抗病毒制剂或药物组合物中，活性成分可以是单一一种化合物，也可以是上述化合物中任意两种以上的混合物，可根据需要制成任意剂型。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
1.溴酚-吡唑啉类化合物在制备治疗猪冠状病毒疾病的药物中的应用；所述溴酚-吡唑啉类化合物具有如下式i所示的结构通式：
其中：r1、r2、r3、r4、r5分别选自h、f、br、oh、och3中的任一种；
r6选自h、cho、coch3、coch2ch3、coch2ch2ch3、cooch3、cooch2ch3、ph、ch2ph、conh2、csnh2或
r7、r8、r9分别选自h、br、no2、oh、ch3、och3或
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述溴酚-吡唑啉类化合物为如下任一所示的化合物：
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述猪冠状病毒疾病是由猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪呼吸道冠状病毒、猪丁型冠状病毒和/或猪血凝性脑脊髓炎病毒引起的疾病。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述猪冠状病毒疾病包括：猪胃肠炎、腹泻、呼吸道炎症和/或脑脊髓炎。
6.一种治疗猪冠状病毒疾病的药物，其特征在于，所述药物以有效量的权利要求1中所述的溴酚-吡唑啉类化合物为活性成分。
7.根据权利要求6所述的治疗猪冠状病毒疾病的药物，其特征在于，所述药物还包括一种或多种药学上可接受的载体。
8.根据权利要求7所述的治疗猪冠状病毒疾病的药物，其特征在于，所述药学上可接受的载体包括：赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、稀释剂和/或表面活性剂。
9.根据权利要求6-8任一项所述的治疗猪冠状病毒疾病的药物，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、口服液、颗粒剂、丸剂或注射剂。
技术总结