本发明申请为申请日2015年12月25日，申请号为：2015110008485，名称为“牛磺酸螯合钙在制备经皮吸收制剂中的应用”的发明专利申请的分案申请。本发明涉及一种用于经皮吸收并治疗皮肤病症或全身系统补钙的牛磺酸螯合钙，具有优异的经皮吸收效果，可以快速经皮补充皮肤所需的钙离子和牛磺酸，具有调节机体表皮细胞内外钙离子浓度、修复皮肤屏障功能的作用。同时，由于其在水溶液中的稳定性远远优于其它蛋白质类的氨基酸的特性，使得其更加适合制备含水的外用制剂，如涂抹剂、膏霜剂、搽剂、喷剂、凝胶剂等。其特别适用于制备成药物外用制剂、医疗卫生制剂、保健品外用制剂、化妆品，可用于治疗因皮肤缺钙引起的各种皮肤病症、皮肤屏障受损后的修复、皮肤的日常护理和保养。
背景技术：
人体中钙存在状态有两种，分别为离子态的钙和结合态的钙。结合态的钙主要存在于骨骼、牙齿中，以构成人体支架维持正常的活动，这类钙不具有生理活性；离子型钙是具有生理活性的钙，是维持人体细胞正常生理活动状态所必须的，主要存在于血液、细胞外液、细胞中和皮肤等软组织结构中。
人体皮肤系统缺钙现象是普遍存在的，也是比较严重的，人体皮肤缺钙会引发多种皮肤病、皮肤屏障作用差、易感染起炎症、易损且破损后愈合周期长、皮肤干燥、敏感、水油平衡失调、加速皮肤老化、环境耐受性弱等各种皮肤问题，特别是面部肌肤处于裸露状态，受强紫外线、污染、辐射等不良环境的影响，更容易引起各种不良的皮肤状态。人体皮肤系统长期处于缺钙状态主要有以下两个方面的原因：
1、人体经口服补充的钙优先用于骨骼、牙齿等不具生理活性的结合钙的需求；
人体中的钙长期处于动态流失状态，目前人体补钙的途径有两种，一种是通过口服的方式补钙，主要有各种补钙制剂为口服钙片类和口服液类；一种是通过静脉注射的方式补钙，但通过静脉注射的方式危险性大，必须是专业医师方可进行，所以目前通用的摄入钙方式只有口服补钙一种。
人体处于缺钙的状态时，经口服补充的钙剂优先用于骨骼、牙齿等所需的结合钙的补充，这时所补充的钙已经失去了生理活性，并不能补充或者只能极少量补充离子钙，但这对于调节机体的生理活性是不足的，所以在人体缺钙的情况下通过血液循环向表皮层输送钙离子来保持表皮层钙离子的平衡稳态是非常困难的。
口服钙剂难吸收、吸收率低、受影响因素多而复杂，这主要是胃肠道的复杂环境所引起的。口服补充的钙剂是通过胃肠道来消化吸收的，胃部环境属于强酸性环境，ph值在0.8～3.6之间变化，小肠环境属于弱碱性，ph值在7.2～8.0之间变化，这种酸碱环境的变化对于钙离子的吸收是不利的，如钙离子易在碱性的肠道环境中形成胶稠状氢氧化钙沉淀，使钙离子难以被人体吸收，同时，这种胶稠状物可粘附在肠壁上，进一步影响其他营养元素的吸收。特别是口服钙易受胃肠道中的阴离子污染而生成不溶性的钙，导致钙离子的吸收率大幅降低，例如摄取的食物中含有的植酸、草酸、碱性磷酸盐、脂肪、膳食纤维中的糖醛酸残基、核苷酸、尿酸等都可与钙离子反应生成不溶或难溶的草酸钙、植酸钙、碱性磷酸钙、尿酸钙盐等，不但干扰钙离子的吸收，还会引起钙在组织中沉淀成为钙化灶，在器官内不断沉积形成结石，影响身体健康。
2、人体表皮系统不存在血液循环系统，具有生理活性的钙离子输送难；
人体主要通过血液循环系统向人体各系统各部位输送所吸收的营养物质，但是在表皮系统中不存在血液系统，其营养物质的输送主要通过组织液传输，但其传输量和传输效率非常低，同时由于前述的口服钙离子优先用于结合钙的需求，所以通过口服给表皮系统补充其所需的离子钙是很困难的，具有生理活性的离子钙对维持人体表皮系统的稳态健康是非常重要的，人体表皮系统是机体抵御脱水、损伤、感染、抗病菌的第一道防线，正常的离子钙浓度是维持人体表皮屏障系统稳定、破损后修复的最主要因素，当钙离子缺乏或紊乱时会导致表皮屏障遭受破坏，进而引发各种皮肤问题甚至病变，所以维持表皮系统正常的钙离子浓度对于表皮屏障保持稳定或破损后的修复是非常重要的。所以直接补充易于经皮吸收的具有生理活性的离子钙特别是维持表皮系统钙平衡是具有非常重要的意义的。
3、目前市场上缺乏可外用的靶向补钙剂；
目前市场上的各种补钙剂均为口服制剂，包括各种钙片和口服液，这主要是针对胃肠道特殊的消化系统开发的，胃肠道的ph值在0.8～3.6之间，属于强酸环境，同时还存在各种菌类、有机酸、阴离子对钙离子存在污染变成难溶物不被人体吸收，而人体表皮正常的ph值范围在5.2～6.5之间，属于弱酸性环境，所以一般用于经胃肠道消化吸收的口服钙剂难于经皮吸收。同时，一般口服钙剂多选用无机钙、离子型的有机酸钙如氯化钙、碳酸钙、乳酸钙、丙酸钙、柠檬酸钙、葡萄糖酸钙等，这些钙剂均为离子态，同时有的钙盐还存在溶解性差的问题，在经皮吸收领域，难溶性的化合物和离子型的化合物是非常难吸收的。
同时目前尚无学者研究钙的经皮吸收问题，所以研究有利于经皮吸收的补钙剂是非常有必要的，也是非常具有创新性的研究课题，经皮吸收补钙的方式可以实现直接向机体补充具有生理活性的离子型钙，特别是可以实现优先向不存在血液循环系统表皮系统靶向补钙，且吸收效率高，而且不受胃肠道特殊而复杂的环境的影响，能够解决钙离子易受阴离子污染而导致吸收利用率低的问题。
技术实现要素：
鉴于口服补钙的方式存在的上述问题，特别是优先补充人体表皮和其他软组织系统所需的生理活性的离子钙所面临的困难，本发明在于提供一种新的补钙途径，以易于经皮吸收的牛磺酸螯合钙为补钙剂，通过经皮吸收的方式直接向人体表皮系统和血液等其他软组织进行靶向补钙，解决皮肤表皮系统和其他软组织系统补钙难的问题。
本发明的一个目的是以经皮吸收途径为一种新的补钙方式，用以补充人体所需的钙，特别是可以优先补充人体维持正常生理活动所需的具有生理活性的离子型钙和及时补充不存在血液循环的机体表皮系统所需要的钙，并增加机体表皮系统中钙含量的储备。
本发明的另一个目的是研究并选择一种或者一类经皮吸收性能较好的含钙化合物，以提高钙的经皮吸收效果，达到较好的钙剂补充效果。
一般情况下，含钙化合物有离子型化合物、配位化合物，大多数属于难溶物质，例如氢氧化钙、碳酸钙、草酸钙等，离子型的含钙化合物在溶解后其中的钙以钙离子的形式存在，但是由于经皮吸收主要是通过细胞膜的“胞吞”作用来吸收物质的，细胞膜的脂性结构对所吸收的物质具有选择性，类似于“相似相溶”原理，所以离子型的物质通常是很难实现经皮给药的，只有脂溶性的物质或者即能溶于水也能溶于脂类溶剂的双亲性物质才能实现较好效果的经皮吸收，但是这些类物质必须满足的另一个条件是分子量要适宜，不能过大。配位化合物属于非离子型化合物，其溶解后的钙以非离子的形式存在，其经皮吸收效果要优于离子型化合物。
在含钙的配位化合物中，氨基酸类螯合钙相对于其他含钙化合物来说具有较好的经皮吸收效果，这可能是因为氨基酸中含有的氨基和羧基所致，其中的含氮氨基和皮肤中的卵磷脂构成比较相似，而且其中所含有的羧基成分属于亲水性基团，这就构成了氨基酸具有一定的双亲性能，同时钙离子作为中心离子通过配位键与氨基酸螯合呈分子状态，解决了离子态的钙难于吸收的问题，而且氨基酸螯合钙经皮吸收时还可以借助氨基酸通道增强其吸收效果，同时分子量也较小，非常符合经皮吸收对物质的选择性要求，提高钙的经皮吸收利用效果。
本发明的实验研究人员发现，牛磺酸在各类氨基酸中更适合作为制备可经皮吸收的螯合钙，特别是对于补充皮肤系统所需的钙是非常有利的，同时，向人体皮肤补充牛磺酸也是有必要的，目前也无学者研究将牛磺酸螯合钙用于皮肤补钙。
牛磺酸螯合钙可用于经皮补钙，这主要有以下原因：
1、牛磺酸对钙离子的双向调节作用
在生物学作用中，最关键的就是抑制性作用。因为生物抑制性的特点就是维持系统的稳定，对机体偏离稳态的生物过程的调节，对偏离稳态所导致的损伤所表现出的保护或有序修复。可以说，抑制性作用涵盖了调节性作用、维持性作用、稳定性作用和保护性作用。
生物抑制是实现生物调节与调控作用的重要因素，机体的正常状态是处在负反馈调节的状态下，或者说机体正常情况是处在保持稳定的状态。例如，脑内的心血管活动中枢通过交感神经和迷走神经控制心脏和血管的活动，使动脉血压维持在一定的水平。再如许多内分泌细胞也是受到各种负反馈机制的调控，使其活动能够维持在一定的水平等等。
在负反馈调节机制中，所谓系统稳定维持在某个水平，也可以将其视为系统维持在某一个“调定点”，于是，所谓的负反馈调控就是系统在扰动后，又稳定的接近原来的“调定点”。系统具有负反馈调节机制的关键，是它对系统偏离具有抑制的作用，所以，抑制作用成为系统具有负反馈调节的重要因素。同样对于生物系统生物抑制是实现生物调节与调控的重要因素。
大量学者进行的生物体内、体外细胞的研究实验表明，牛磺酸对于钙离子的浓度分布具有调节作用，可以维持钙离子的浓度的稳定，对细胞的许多依赖于钙离子的生理病理现象具有明显的调节作用，能抑制各种原因引起的胞内钙离子超负荷，保护细胞。它能增加高亲和力钙离子转运系统转运钙离子的量和速度，低钙离子时促进钙离子的内流，高钙离子时减少钙离子的内流和增加钙离子与细胞的亲和力，以降低游离钙离子水平，拮抗钙离子超载的细胞保护作用，稳态调节细胞内钙离子。这有利于皮肤表皮层的钙离子浓度梯度的形成和稳定，保障皮肤表皮屏障系统的正常形成，避免因缺钙和钙过量引起的各种皮肤病症。
2、牛磺酸的结构特性对经皮吸收的影响
牛磺酸是一种具有双亲特性的天然物质，本身结构中带正电的氨基和带负电的磺酸基都是亲水基，其中亲油的疏水基则是其中的碳氢链。牛磺酸作为天然的双亲性物质，其与皮肤的细胞膜脂质结构性质相似，类似物质之间的“相似相溶”原理，与皮肤细胞之间产生优异的亲和性能，分子中的氨基、磺酸基都可提高细胞膜上的离子与水的结合，使其快速经皮吸收；其次，牛磺酸的这种双亲结构，使其在机体的生化反应中，能大大降低溶液的表面张力及反应活化能，从而大大提高反应活性，它甚至能改变反应物的表面组成与结构，对于由脂类组成的细胞膜具有稳定和保护作用，维持膜的通透性；此外，牛磺酸作为天然的双亲性物质，可改善细胞及细胞膜的生化与生物力学的环境，从而促进机体的生化反应。
3、人体皮肤缺少牛磺酸
人体皮肤中同样也缺少牛磺酸，人体中含有一定量的牛磺酸，主要通过食物摄取，自身也可以合成，但是量很少，这是由于人体中牛磺酸的合成需要半胱氨酸作为原料，而人体中半胱氨酸少且合成牛磺酸所必需的酶活性较低所造成的。人体中牛磺酸主要分布在兴奋性较高的组织如神经系统、肌肉组织及淋巴和血小板中。尽管它在机体各组织中的分布有所不同，但是在血液、免疫、生殖、皮肤以及视觉功能等系统中都离不开牛磺酸。
目前人体基本都通过口服的方式摄取牛磺酸后主要通过血液循环系统输送至全身各个器官，而表皮系统中不存在血液循环系统，所以通过口服摄取的牛磺酸输送到表皮系统的量是非常少的，特别是食物中的牛磺酸的含量较少，摄取不足更会引起表皮细胞中的牛磺酸的含量不足，所以经皮吸收后直接给皮肤补充牛磺酸是非常有必要的。
4、牛磺酸非蛋白氨基酸
牛磺酸是一种非蛋白质氨基酸，其被机体吸收后不参与蛋白质的合成，可以有效保持其在皮肤各细胞组织中的含量，起到调节作用。
5、牛磺酸其他生理特性
1）牛磺酸对机体免疫能力的调节作用
牛磺酸对机体免疫功能有重要的影响。牛磺酸参与维持机体的免疫功能，对免疫功能的正常发挥可起到调节作用。具体表现为：无抗原性；可恢复并提高免疫球蛋白的水平从而增强免疫功能；具有免疫抑制作用，可减弱白细胞介素导致的内皮细胞的毒性；牛磺酸可有效抑制组织中的炎性因素；可促进异位性皮炎患者γ-干扰素的分泌，使th1/th2比值升高，调节th1/th2的失衡，从而可治疗异位性皮炎；可提高红细胞清除血液中免疫复合物的功能，从而增强红细胞的免疫调节功能。
2）牛磺酸对生长的调控作用
牛磺酸虽然不是生长因子，但是却能发挥类似生长因子的调控作用，例如能促进细胞增殖分化、可调节生长激素，促进机体的生长发育；对损伤有保护作用，可促进损伤的有序修复，包括可使受损的神经元再生、视网膜光化学损伤以及其它组织的修复、再生等。所以，将牛磺酸称之为非特异性生长因子，或调节生长因子。
3）牛磺酸对生长因子、细胞因子、基因等重要活性成分的表达都具有明显的调控作用。
4）抗氧化性能
作为抗氧化物质，阻止氧自由基过氧化过程，保护神经细胞膜的完整性。
本发明研究人员发现，有学者研究牛磺酸对钙调节作用的，有学者研究钙对皮肤重要性的，但目前没有发现有学者研究牛磺酸螯合钙的经皮吸收效果和用牛磺酸螯合钙以经皮给药的形式直接向皮肤补充钙和牛磺酸达到调节作用的，而牛磺酸螯合钙经皮吸收后被解离成为牛磺酸根和钙离子，这可以向机体同时补充牛磺酸和钙离子，特别是能够优先快速、有效补充皮肤系统中所需的牛磺酸和离子型的钙，提高皮肤系统对牛磺酸的利用率，这是非常重要的也是有必要的。
本发明的研究人员还发现，牛磺酸螯合钙相比于其他氨基酸螯合钙被用于经皮吸收还有最重要的一点是其在含水溶液中具有非常优异的稳定性。一般的氨基酸螯合钙在常温下的长期稳定性较差，特别是在水溶液体系中的稳定性在几个月到半年左右，不适于制备含水的制剂，比如外用的涂抹剂、喷剂、搽剂、乳液、凝胶剂等，而牛磺酸螯合钙在50℃高温条件下、常温条件下、定温条件下都具有优异的长期稳定性，所以其更适合作为不同类型的外用制剂的制备。
本发明中可用于经皮吸收的牛磺酸螯合钙的中心离子钙的来源可以为无机钙盐如氯化钙、碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、硅酸钙等，也可以是非螯合型有机钙盐如乳酸钙、丙酸钙、柠檬酸钙、葡萄糖酸钙等，还可以为氧化钙、氢氧化钙，优选为氯化钙、碳酸钙、乳酸钙、丙酸钙、柠檬酸钙、氧化钙、氢氧化钙，可以来源于矿物质中的钙，也可以为生物来源如动物体的骨骼等。
本发明中上述用于经皮吸收的牛磺酸螯合钙，其中螯合体（配位体）牛磺酸与中心离子钙的螯合比为1:1～4:1之间，优选牛磺酸与钙离子的螯合比为1:1与2:1，更优选为2:1。这种螯合比与不同牛磺酸的投料配比方式有关，牛磺酸与钙离子的螯合比为1:1与2:1的牛磺酸螯合钙结构相对比较稳定，分子量也比较小，更容易经皮吸收，这也可能是由于牛磺酸螯合钙分子中牛磺酸的数量不同对膜结构的影响不同所引起的。
本发明上述用于经皮吸收的牛磺酸螯合钙的特点之一是其特殊的经皮吸收利用的方式，牛磺酸螯合钙在以分子状态被整体吸收进入细胞后，可以在细胞液的作用下重新解离成具有生理活性的离子型的钙和牛磺酸，离子型的钙可以进入细胞中的钙库储存起来或者通过相关钙通道进入机体循环系统被加以利用，牛磺酸可以按照机体需求被机体加以重新利用，所以牛磺酸螯合钙既可以解决钙的经皮吸收问题，也能增强其吸收后的利用效率。
本发明中上述用于经皮吸收的牛磺酸螯合钙的目的之一是提高的吸收利用率，解决通过传统口服补钙时存在的不易吸收、易受胃肠道环境影响、钙离子易受阴离子污染而形成不/难溶性钙盐或化合物、易受年龄等生理因素影响、肝脏首过效应、肠胃灭活、用药个体差异大等引起的其吸收利用率低的问题。
本发明的特点之一是解决了一般的无机钙、有机酸钙等在经皮吸收上的缺陷。无机钙和有机酸钙为离子型化合物，其在溶解状态时，钙是以离子态存在的，难于经皮吸收，而溶解下牛磺酸和钙以螯合整体状态存在的牛磺酸螯合钙，能够以整体形式被吸收。
本发明的特点之一是解决了通过传统口服补钙的方式难以补充无血液循环系统的表皮层所需钙的难题。一般情况下经口服的方式摄取的钙剂优先被用于补充骨骼、牙齿所需的结合钙，特别是在人体中钙缺乏的时候通过口服的方式补充皮肤表皮系统等软组织所需的离子钙是困难的。牛磺酸螯合钙具有能够在细胞液的作用下重新解离成牛磺酸和钙离子分别被利用的特性，同时经本发明实验人员研究发现牛磺酸螯合钙具有的分子量小、氨基酸中的类脂结构特别适用于经皮收，达到向皮肤表皮系统靶向补充钙的效果，解决表皮层缺钙的问题。
本发明的特点之一是可通过经皮吸收的方式补充表皮系统所需的钙，同时还可以优先增加表皮系统、其他软组织系统的细胞中的“钙库”中的钙含量的储存，提高细胞中“钙库”的钙储存量，当表皮层的钙离子流失时，钙库中的钙能够被释放出来，有助于缓解表皮层中的钙离子流失。
本发明的特点之一是还可以通过经皮吸收的方式补充人体所需的结合钙，即非生理活性钙。当经皮吸收的钙进入血液循环系统时，可以被机体利用以补充骨骼、牙齿等所需进而形成结合钙。
本发明的另一目的是研究促透剂对牛磺酸螯合钙的促透效果。对于用于经皮吸收的药物有效成分来说，除了药物本身的特性是否适合用于经皮吸收以外，还可以通过添加促透剂的方式促进药物吸收，提高药物有效吸收的速率，这主要是通过改变肌肤屏障的微观结构、降低表皮细胞之间的致密程度、增强药物的溶解性来增加药物有效成分的渗透性。上述可用于牛磺酸螯合钙的促透剂主要包括以下几类：表面活性剂类如吐温、聚氧乙烯烷基酚、十二烷基三甲基溴化胺、十二烷基磺酸钠等；有机溶剂类如乙醇、二甲基亚砜、肉豆蔻酸异丙酯等；有机酸和脂肪醇类如油酸、亚油酸、月桂醇等；香精油及萜烯类化合物如薄荷醇、各种植物精油和挥发油、樟脑、柠檬烯、桉树脑等；氮酮（azone）及其同系物如月桂氮卓酮等；聚合物类如聚乙二醇和聚二甲基硅氧烷的嵌段共聚物等；吸水保湿类如角质保湿剂尿素、吡咯酮类衍生物；多元醇类如丙二醇、戊二醇、丙三醇、丁二醇等结构中含有2～8个碳原子的短链醇；其它氨基酸类和多糖类如谷氨酸、赖氨酸、亮氨酸、脯氨酸、海藻糖、透明质酸等，且牛磺酸本身也可以作为牛磺酸螯合钙的促透剂，可选取以上所述各种促透剂中的一种或多种作为牛磺酸螯合钙的促透体系。当牛磺酸螯合钙用于经皮吸收时，其中上述促透剂的添加总量占药物制剂的质量百分比小于65%，优选为小于40%，进一步优选为小于30%，更进一步优选为小于15%。
本发明的另一目的是当牛磺酸螯合钙用于化妆品类产品时，其中的促透剂不能对皮肤有刺激作用、不能对皮肤的表皮屏障系统有破坏作用、安全性要优，要选择上述促透剂中的香精油及萜烯类化合物如薄荷醇、各种植物精油和挥发油、樟脑、柠檬烯、桉树脑等；氮酮（azone）及其同系物如月桂氮卓酮等；聚合物类如聚乙二醇和聚二甲基硅氧烷的嵌段共聚物等；吸水保湿类如角质保湿剂尿素、吡咯酮类衍生物；多元醇类如丙二醇、戊二醇、丙三醇、丁二醇等结构中含有2～8个碳原子的短链醇；其它牛磺酸类和多糖类如谷氨酸、赖氨酸、亮氨酸、脯氨酸、牛磺酸、海藻糖、透明质酸等各种促透剂中的一种或多种作为牛磺酸螯合钙用于化妆品时的促透体系。以上所选可用于含牛磺酸螯合钙的化妆品的促透剂，具有对牛磺酸螯合钙的促进吸收的作用，同时还可以作为肌肤的营养物质如各种氨基酸、各种植物精油，或者能够作为肌肤的保湿剂如海藻糖和透明质酸等多糖类物质、多元醇类物质。其中上述促透剂的添加总量占产品的质量百分比小于65%，优选为小于40%，进一步优选为小于30%，更进一步优选为小于15%。
本发明的另一个特点是，在各种外用制剂产品中应用时，牛磺酸螯合钙的添加量的重量百分比范围小于60%，优选为小于40%，更优选为小于20%，更进一步优选为小于10%。
本发明的特点之一是可以将牛磺酸螯合钙制备成不同的外用制剂的剂型，包括喷雾剂、膏霜剂、贴膏剂、涂抹剂、凝胶剂等。
本发明的特点之一是可以制备含有牛磺酸螯合钙的外用药物制剂，可通过经皮给药的方式治疗由钙的缺乏或紊乱引起的皮肤疾病。
本发明的特点之一是可以制备含有牛磺酸螯合钙的外用医疗卫生制剂。
本发明的特点之一是可以制备含有牛磺酸螯合钙的医疗器械外用制剂。
本发明的特点之一是可以制备含有牛磺酸螯合钙的化妆品，可以为喷雾、水乳剂、膏霜剂、贴膜等，以加快表皮修复，增强表皮屏障功能，改善皮肤纹理、干燥、皱纹、弹性、敏感等肌肤问题。
本发明的特点之一是可以制备含有牛磺酸螯合钙的保健品外用制剂。
本发明中上述用于经皮吸收的牛磺酸螯合钙，在外用透皮制剂产品的添加量的重量百分比小于60%，优选为小于40%，更优选为小于20%，更进一步优选为小于10%。
本发明所涉及经皮吸收补钙的方式能够最大程度优先补充机体所需的生理活性的离子型钙，特别是这种通过经皮吸收补充钙的方式能够直接快速实现向不存在血液循环系统的表皮系统补充钙剂，解决了经口服补充的钙剂被首先用于骨骼形成而变为非生理活性结合钙而导致具有生理活性的离子钙不足的问题，同时牛磺酸具有调控机体细胞内外钙离子浓度的作用，即高浓度时抑制钙离子浓度，低浓度时促进，可调节皮肤细胞中的钙不足和钙过剩的问题，是细胞内外钙离子平衡的一种重要的调节方式，本发明中可经皮吸收的牛磺酸螯合钙的作用可用于外用药物制剂、医疗卫生材料、外用保健品制剂、化妆品的制备。
具体实施方式
本发明人员列举了以下实施方式，以加深对本发明的理解。
实施例1
1、牛磺酸螯合钙的制备：实验中以牛磺酸为配位体，任意选择氯化钙、碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、硅酸钙、乳酸钙、丙酸钙、柠檬酸钙、葡萄糖酸钙中的一种作为提供中心离子钙的钙源制备氨基酸螯合钙，以做进一步实验研究，具体如下：
1）称取45g的牛磺酸，用150ml去离子水溶解在三口烧瓶中，水浴加热至80℃恒温，至谷氨酸完全溶解；
2）称取20g乳酸钙，完全溶解于足量的水中，调节ph至7.8；
3）将2）中配制好的乳酸钙溶液逐滴慢慢加入到1）中的牛磺酸溶液中，边加入乳酸钙溶液边轻轻搅拌，搅拌过程中保持恒温状态；
4）加完乳酸钙溶液后，反应约60min，反应完毕；
5）过滤去杂质，滤液可直接备用或将滤液蒸发至牛磺酸螯合钙析出，并干燥后粉碎备用。
2、牛磺酸螯合钙定性检测
由于牛磺酸螯合钙的水溶液中钙并不是以离子形态存在，所以可以通过检测反应后所得到的物质中是否存在游离的钙离子和游离的氨基酸根可以确定是否有氨基酸螯合钙生成，对氨基酸螯合钙的生成进行定性检测。本实验主要是通过二硫腙试剂与游离金属钙离子的显色反应或者茚三酮试剂与牛磺酸根的显色反应来比较反应前后的变化确定是否生成牛磺酸螯合钙。
具体实验如下：
实验定性检测用试剂：二硫腙试剂、茚三酮试剂、硫化钠。
1）牛磺酸螯合钙的纯化：此实验主要是排除上述制得的牛磺酸螯合钙产品中的未反应的钙离子与牛磺酸的影响。
游离钙离子去除：称取少量前述制备的牛磺酸螯合钙的样品，加入适量的无水乙醇，进行充分搅拌，后静置一段时间进行沉淀，过滤，取少量滤液中加入几滴二硫腙试剂，观察滤液是否变色，若变色则按照上述办法对牛磺酸螯合钙继续进行洗涤纯化，直到加入二硫腙试剂后滤液不变色为止，以确定金属钙离子被完全除净；
游离牛磺酸去除：取已除去游离钙离子的牛磺酸螯合钙少许溶于水中，加入几滴茚三酮试剂，加热至溶液沸腾，若颜色溶液颜色变为蓝紫色，则样品中还存在游离的牛磺酸，继续以无水乙醇为纯化剂进行纯化，直到受加热的溶液颜色不变为蓝紫色为止，以确定游离的牛磺酸被完全除净。
2）牛磺酸螯合钙的定性检测：此实验主要是确定反应产物为牛磺酸螯合钙。
取上述1）中纯化的牛磺酸螯合钙样品溶解于水中，取溶液三份，分别编号为1、2、3号样品，其中1号溶液中加入定量二硫腙试剂，溶液颜色不变，说明样品中不含游离的钙离子；2号样品中加入几滴茚三酮试剂，加热至溶液沸腾3min，溶液的颜色不变，说明样品中不含游离的牛磺酸；3号样品中加入过量的硫化钠，搅拌均匀，静置一段时间，有白色沉淀产生，这说明硫离子置换出了处于螯合态的钙离子，生成了更加稳定的金属硫化物硫化钙，静置一段时间进行沉淀过滤，得到滤液，向滤液中加入几滴茚三酮试剂，加热至溶液沸腾3min，溶液的颜色变为蓝紫色，说明存在游离的牛磺酸，这是硫离子夺取产物牛磺酸螯合钙中的钙离子后置换出了游离的牛磺酸所致，所以上述1中制备的产物为牛磺酸螯合钙。
实施例2
本实验以牛磺酸为配位体，任意选择氯化钙、碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、硅酸钙、乳酸钙、丙酸钙、柠檬酸钙、葡萄糖酸钙中的一种作为提供中心离子钙的钙源，制备具有不同螯合比的牛磺酸螯合钙。
1、制备螯合比为牛磺酸：钙=2:1的牛磺酸螯合钙
1）称取45g的牛磺酸，用150ml去离子水溶解在三口烧瓶中，水浴加热至80℃恒温，至牛磺酸完全溶解；
2）称取20g乳酸钙，完全溶解于足量的水中，调节ph至7.8；
3）将2）中配制好的乳酸钙溶液逐滴慢慢加入到1）中的牛磺酸溶液中，边加入乳酸钙溶液边轻轻搅拌，搅拌过程中保持恒温状态；
4）加完乳酸钙溶液后，反应约60min，反应完毕；
5）过滤去杂质，滤液可直接备用或将滤液蒸发至牛磺酸螯合钙析出，并干燥后粉碎备用。
2、制备螯合比为牛磺酸：钙=1:1的牛磺酸螯合钙
1）称取40g乳酸钙于反应器中，完全溶解于足量的水中，调节ph值至7.8，恒温水浴加热至80℃恒温；
2）称取40g牛磺酸，用150ml去离子水完全溶解，水浴加热至80℃；
3）将2）中配制好的牛磺酸溶液逐滴慢慢加入到1）中的乳酸钙溶液中，边加入乳酸钙溶液边搅拌，搅拌过程中保持恒温状态；
4）添加完牛磺酸溶液后，继续反应60min，反应完毕；
5）过滤去杂质，滤液可直接备用或将滤液蒸发至牛磺酸螯合钙析出，并干燥后粉碎备用。
实施例3
牛磺酸螯合钙水溶液稳定性考察：本实验以实施例1中制备的牛磺酸螯合钙为原料，并选择谷氨酸螯合钙为作为比较对象，比较牛磺酸螯合钙与其它氨基酸螯合钙的水溶液的稳定性，要在制备的水溶液中添加防腐剂，实验结果如下所示：
表、牛磺酸螯合钙-谷氨酸螯合钙在不同条件下的水溶液的稳定性
从以上试验结果可以看出：牛磺酸螯合钙的水溶液的稳定性要优于谷氨酸螯合钙，对于外用液体制剂来说，这种稳定性是十分必要的，说明其更适用于制备外用含水制剂，如喷剂、凝胶剂、涂抹剂、搽剂等。
实施例4
本实验比较了牛磺酸螯合钙和其他氨基酸钙、无机钙、有机酸钙的经皮吸收效果，试验中用离体小鼠皮，所用接收液为0.9%的氯化钠水溶液，试验时间为10h。试验中选择的牛磺酸螯合钙为实施例1中配制的牛磺酸螯合钙，其他氨基酸类螯合钙中选择谷氨酸螯合钙、无机钙为氯化钙，有机酸钙为葡萄糖酸钙，具体试验方法为将牛磺酸螯合钙、谷氨酸钙、氯化钙、葡萄糖酸钙配制成浓度相同的溶液，取小鼠皮的有效测试面积为直径d=1.5cm的圆形规格，取体积相同的三种溶液均匀涂抹于小鼠皮表面，以franz扩散池透皮测试仪测试并比较牛磺酸螯合钙、谷氨酸螯合钙、氯化钙、葡萄糖酸钙的经皮吸收效果，具体测试结果如下表1所示：
表1、三种钙剂10h累积透皮量
通过比较牛磺酸螯合钙、谷氨酸螯合钙、无机氯化钙、葡萄糖酸钙水溶液的经皮吸收效果，说明了牛磺酸螯合钙较其他的钙制剂具有良好的经皮吸收性能，特别是在初始阶段牛磺酸螯合钙的经皮吸收量大于谷氨酸螯合钙，且远大于氯化钙和葡萄糖酸钙，而在6h内的吸收总量也高于谷氨酸螯合钙，且远高于氯化钙和葡萄糖酸钙。
实施例5
本实验以实施例1中制备的牛磺酸螯合钙为试验样品，比较了不同浓度的牛磺酸螯合钙溶液对透皮效果的影响。试验中用离体小鼠皮，所用接收液为0.9%的氯化钠水溶液，试验时间为6h。将牛磺酸螯合钙配制成不同质量浓度的溶液，取小鼠皮的有效测试面积为直径d=1.5cm的圆形规格，取体积相同的各浓度的牛磺酸螯合钙溶液均匀涂抹于小鼠皮表面，以franz扩散池透皮测试仪测试并比较，具体结果如下表2所示：
表2、不同浓度牛磺酸螯合钙透皮效果
从上表可以看出，比较了牛磺酸螯合钙的浓度为0.5%、1%、1.5%、2%时的经皮吸收性能，牛磺酸螯合钙的经皮吸收性能与其浓度有关，当牛磺酸螯合钙的浓度增大时，其经皮吸收性能增大，特别是能够增加其在起始阶段的经皮吸收效果，在起始1h内，浓度为2%的牛磺酸螯合钙的经皮吸收量约为浓度为0.5%时的9倍，约为浓度为1%时的4倍，这对于其在化妆品中的应用是非常重要的。同时，浓度为2%时在6h内的吸收率达到75%，远高于浓度为0.5%时的37%，浓度为2%时6h内的总吸收量为0.5%时的10倍以上。
实施例6
ph值对牛磺酸螯合钙经皮吸收效果的影响：本实验以实施例1中制备的牛磺酸螯合钙为试验用样品，通过比较不同ph值体系环境下牛磺酸螯合钙的经皮吸收效果，具体实验如下：试验中牛磺酸螯合钙溶液的ph值模拟人体肌肤的ph值变化范围，测试ph值分别为5.5、7.0、8.5时牛磺酸螯合钙的经皮吸收效果，其中透皮性能的测试方法与前述实施例中的方法相同，试验时间为6h，测试结果如下表所示：
表、不同ph对牛磺酸螯合钙的透皮效果的影响
从上述测试结果来看，不同的ph值环境对牛磺酸螯合钙的透皮效果有一定的影响，ph值为5.5和8.5时牛磺酸螯合钙的透皮效果要比ph为7.0时稍好一些。
实施例7
本实验以实施例3中制备的不同螯合比的牛磺酸螯合钙为试验样品，比较了不同螯合比的牛磺酸螯合钙的透皮效果，透皮测试方法与前述各实施例中的方法相同，试验时间为6h，试验结果如下表所示：
表、螯合比对牛磺酸螯合钙的透皮效果的影响
从以上实验结果可以看出，牛磺酸螯合钙的的螯合比为2:1时的透皮效果要优于1:1。
实施例8
牛磺酸螯合钙对离体角质细胞增殖效果的影响：本实验以实施例1中制备的牛磺酸螯合钙为试验样品，通过考察牛磺酸螯合钙对离体角质细胞增殖效果的影响来说明牛磺酸螯合钙对皮肤屏障作用恢复的影响。试验中以小鼠外移皮肤进行表皮屏障修复实验，使用一定浓度的牛磺酸螯合钙溶液处理，另设一组空白对照组，进行平行比较试验，并通过免疫荧光的方法追踪表皮角质细胞，考察24小时后在重建表皮中处于增殖过程中的角质细胞的变化情况。实验中观察并比较了一定浓度的牛磺酸螯合钙、谷氨酸螯合钙、氯化钙、葡萄糖酸钙对于在重建表皮的过程中处于增殖过程中的角质细胞的变化情况，说明牛磺酸螯合钙在表皮屏障修复过程中对角质细胞的增殖作用，具体结果见下表：
表、不同钙剂在24h内对表皮屏障修复过程中对角质细胞的增殖作用
从以上试验结果可以看出，牛磺酸螯合钙对角质细胞增殖作用的影响最大，这可以说明牛磺酸螯合钙对皮肤表皮屏障功能的恢复性能要优于不加牛磺酸螯合钙和其他氨基酸螯合钙和非氨基酸钙组。
实施例9
本实验以实施例1中制备的牛磺酸螯合钙为试验样品，通过设计空白组、比较对照组实验，考察了牛磺酸螯合钙对表皮角质层屏障恢复效果的影响，直观地了解了牛磺酸螯合钙对表皮屏障恢复的影响，试验中通过小鼠外移皮肤进行表皮屏障修复实验，使用牛磺酸螯合钙喷剂对表皮进行3次/天的处理，实验过程中对表皮层进行trichrom-masson染色，观察其表皮厚度的变化情况，实验结果见下表：
表、不同钙剂在6d内对表皮角质层的修复作用
通过以上实验结果可以看出，使用牛磺酸螯合钙6天后，其表皮层的厚度明显增加，要优于不加牛磺酸螯合钙的空白组和其它钙剂的对照组，说明牛磺酸螯合钙在表皮屏障修复过程中有着更好的作用。
实施例10
本实验以实施例1中制备的牛磺酸螯合钙、谷氨酸螯合钙、氯化钙、葡萄糖酸钙为原料，分别制备成一定浓度的谷氨酸螯合钙、谷氨酸螯合钙、氯化钙、葡萄糖酸钙水溶液，进行人体皮肤实施物理性破坏后分用配制的以上各种钙剂进行涂抹，与空白样进行对比，考察不同钙剂对破损皮肤的修复效果，具体试验方法如下所述：
人体表皮破坏试验：以健康人体前臂内侧作为试验部位，用胶带进行物理性反复撕拉15次造成皮肤表皮损伤破坏，将试验组分为四组，分别为空白组、牛磺酸螯合钙、谷氨酸螯合钙组、氯化钙组、葡萄糖酸钙组进行表皮损伤恢复实验，具体实验结果如下：
由以上实验结果可以看出，含钙试验组对破损皮肤的修复效果要优于空白组，含钙组样品对破损肌肤的修复效果为牛磺酸螯合钙最优，谷氨酸螯合钙次之，葡萄糖酸钙略优于氯化钙。
实施例11
以实施例1中制备的牛磺酸螯合钙为原料，制备成只含牛磺酸螯合钙的喷剂，进行了志愿者测试，试验中设置空白组（纯水）、对照组、试验组，考察牛磺酸螯合钙对皮肤的改善调节效果，并与其它氨基酸钙（试验中选谷氨酸钙）、无机钙、有机酸钙进行比较。测试部位为面部，测试时间为两周，受试志愿者共有40名，其中20名为干性敏感肌肤，20名为油性肌肤，受试期间未进行其他治疗方式，禁用其它护肤品。采用visia测试仪测试受试者面部肌肤的变化情况，包括皮肤的含水量变化、弹性值、皮脂量、面部ph值变化、面部细菌生长变化、皮肤光泽度、紧致效果、毛孔改变、抗敏效果、不同类型肌肤适应性等，综合评价谷氨酸螯合钙对面部肌肤的修复调节作用。visia测试仪和soft5.5皮肤性质测试的各项指标如下：
1）水分：皮肤水分值高低可用于衡量皮肤的干燥程度，同时也是反映皮肤屏障功能的重要指标之一；水分测试值越高，表明补水效果非常好；
2）皮脂：表示皮肤油脂分泌能力，测试结果值越高，表明油分含量过高；
3）弹性：测试结果值越高，表明皮肤弹性越好；
4）酸碱值：一般情况下油性肌肤的ph值较低，这是由于分泌的油脂中含有游离的脂肪酸的缘故；
5）皱纹：反应脸部的干纹、细纹、静态纹等状况，皱纹一般与皮肤弹性降低有密切关系；
6）纹理：反映皮肤的平滑度以及饱满感，健康的角质层的“峰”和“谷”差异越小，皮肤饱满感越好，角质层的锁水、保湿能力越强；
7）紫质：油性皮肤所关注的检测项之一，对控制皮肤炎症、控油效果具有重要意义，主要检测毛囊口的各种细菌如痤疮丙酸杆菌、马拉色菌等的代谢产物，其检测结果越低，说明毛囊口处的以上细菌越少，产品的抑菌效果明显。
1、干性肌肤应用试验效果：将干性肌肤类型的20名志愿者随机分为4组，每组5人，分别为空白组、牛磺酸螯合钙组、谷氨酸螯合钙组、氯化钙组、葡萄糖酸钙组，进行效果对比试验，本实验结果如下表所示：
表、不同钙剂对干性肌肤的修复效果
1、油性肌肤应用试验效果：将油性肌肤类型的20名志愿者随机分为4组，每组5人，分别为空白组、牛磺酸螯合钙组、谷氨酸螯合钙组、氯化钙组、葡萄糖酸钙组，进行效果对比试验，本实验结果如下表所示：
表、不同钙剂对油性肌肤的修复效果
由以上试验结果可以看出，与空白组相比较，含钙组对皮肤修复效果要优于空白组，在四种不同钙剂的试验组中，含牛磺酸螯合钙组要明显优于谷氨酸螯合钙、氯化钙组和葡萄糖酸钙组，其对于油性肌肤和干性肌肤都是适应的。
实施例12
本实验以小鼠为实验对象，分为两组，其中一组为经口服喂食实施例1中制备的牛磺酸螯合钙，另外一组通过经皮给药的方式向皮肤补充牛磺酸螯合钙，采用原子吸收分光光度法分别测试并比较两种补钙途径在不同时间段时表皮系统中钙的含量。
表、不同补钙方式对表皮中钙含量变化的影响
从以上试验结果可以看出，口服补钙的方式对于补充表皮中的钙是很困难的，经皮给药的方式能够快速有效提高表皮中的含钙量，解决表皮系统缺钙的问题。
以上所述是体现本发明研究过程及结果的实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
1.一种医疗器械外用制剂，其特征在于：经皮吸收制剂在制备用于治疗或预防皮肤缺钙和钙紊乱所引起疾病的药物制剂中的应用是所述医疗器械外用制剂，所述经皮吸收制剂的活性成分为牛磺酸螯合钙，重量百分含量小于60%，以及包含质量百分比小于65%的促透剂，所述的经皮吸收制剂不含有维生素d。
2.根据权利要求1所述的医疗器械外用制剂，其特征在于：所述牛磺酸螯合钙，其中钙离子为螯合体中心离子，牛磺酸为螯合体，上述氨基酸螯合钙中牛磺酸与钙离子的螯合比为1:1～4:1之间。
3.根据权利要求2所述的医疗器械外用制剂，其特征在于：所述牛磺酸螯合钙的分子量范围在100～1500之间。
4.根据权利要求3所述的医疗器械外用制剂，其特征在于：所述牛磺酸螯合钙的分子量范围在100～800之间。
5.根据权利要求4所述的医疗器械外用制剂，其特征在于：所述牛磺酸螯合钙的分子量范围在100～650之间。
6.根据权利要求1所述的医疗器械外用制剂，其特征在于：其中牛磺酸与钙离子的螯合比为1:1与2:1。
7.根据权利要求6所述的医疗器械外用制剂，其特征在于：其中牛磺酸与钙离子的螯合比为2:1。
8.根据权利要求所述1的医疗器械外用制剂，其特征在于：牛磺酸螯合钙添加量范围以重量百分比计小于60%。
9.根据权利要求8所述的医疗器械外用制剂，其特征在于：牛磺酸螯合钙添加量范围以重量百分比计小于30%。
10.根据权利要求1-9所述的医疗器械外用制剂，其特征在于：所述促透剂包括表面活性剂类、有机溶剂类、有机酸和脂肪醇类、精油及萜烯类化合物、氮酮、聚合物类、多元醇类、氨基酸类和多糖类、肽类中的一种或多种组成促透体系。
技术总结