本发明涉及利用胚胎干细胞分泌的外泌体来治疗急性肾损伤以及皮肤损伤的技术手段,属于组织工程与新医药技术领域。
背景技术:
胚胎干细胞是从早期胚胎中分离出来的一类细胞,是一种高度未分化的细胞,具有两个非常重要的特性:它能够在体外培养时无限增殖,具有高度的自我更新和多向分化的潜能。胚胎干细胞可以分化为所有类型的细胞,是基因治疗最为理想的靶细胞。由于这些优良特性,胚胎干细胞被称为“种子细胞”,为临床的组织器官移植提供大量的原料。但是由于胚胎干细胞在医学应用上存在着免疫排斥、伦理道德以及致瘤性等问题,限制了其在临床上的应用。因此,科学家们正在寻找一些其他途径代替胚胎干细胞发挥相关的治疗效果。
细胞外囊泡(extracellularvesicles,evs)是一种由细胞分泌的直径为30-100nm,由磷脂双分子层包裹的物质。evs中富含核酸和蛋白质成分,携带了细胞内的活性物质,是细胞旁分泌的主要形式。细胞外囊泡具有多种功能,主要体现在以下几个方面,细胞外囊泡能够调节细胞的功能,包括细胞的迁移和侵袭能力。另外,evs在免疫反应中也发挥着复杂的作用,不同类型的免疫细胞通过交换evs影响一些适应性和先天免疫性疾病。越来越多的研究表明evs在身体发育和确定组织结构中也发挥着重要作用,介导着细胞与细胞之间的交流。近年来,干细胞分泌的evs越来越多的应用于再生医学领域。
多项研究表明,胚胎干细胞也能分泌细胞外囊泡,并且在多种疾病以及损伤中发挥着重要作用。胚胎干细胞来源的外泌体在治疗心血管疾病方面具有重要的作用,它可以通过传递mir-294促进血管新生和心肌细胞增殖,从而促进心梗后的修复。胚胎干细胞来源的外泌体还能抑制阿霉素和炎症诱导的肌肉细胞的坏死。也有研究发现胚胎干细胞分泌的细胞外囊泡能够促进原代小鼠皮肤成纤维细胞的增殖,并且研究发现胚胎干细胞来源的外泌体还可以改善衰老间充质干细胞的衰老相关表型。因此胚胎干细胞来源的外泌体被认为是胚胎干细胞在细胞治疗中的良好替代物,避免了胚胎干细胞在临床应用中的缺陷,极大的发挥了胚胎干细胞的优良特性。
急性肾损伤(aki)是由缺血再灌注、药物、感染、手术、造影剂等导致的一种临床常见的急危重症,已经成为世界范围内严重的公共卫生问题,并且给中国带来巨大的医疗负担。aki发病率和死亡率较高,存活的患者也会发生不同程度的慢性肾功能损害,容易进展为慢性肾病或终末期肾病。aki是一个复杂的病理学过程,aki的病理生理学机制主要包括微循环受损、炎症、氧化损伤和免疫失调。当机体发生aki后,机体本身也存在一定的损伤修复机制,从疾病进程来看,aki的修复过程分为生理性修复和病理性修复。对于轻微的损伤刺激,机体在早期发生生理性修复,恢复正常的上皮形态和肾脏功能;当损伤因素较重或者持续存在时,急性期各种病理机制引发的炎症级联反应放大,会导致肾脏功能的进行性受损,在这种情况下,机体发生适应性改变,疾病进入慢性期,这一过程称为病理性修复。病理性修复的累积导致纤维化的发生,进展为慢性肾病或终末期肾病(esrd)。所以科学家们尝试通过各种方式促进aki后机体的生理性修复,抑制病理性修复从而恢复肾脏正常的生理功能。
皮肤是包在身体表面,直接同外界环境接触,具有保护、排泄、调节体温和感受外界刺激等作用的一种器官,是人的身体器官中最大的器官。在生活中,有各种原因会造成皮肤损伤,皮肤伤口的形成主要包括外伤以及内伤,外伤包括割伤、针刺、打击等,内伤是指由于开放性骨折造成的皮肤创伤,割伤造成的伤口通常会深及皮下组织。
技术实现要素:
本发明是一种利用胚胎干细胞分泌的外泌体来促进机体损伤修复的技术手段。
本发明是利用胚胎干细胞来源的外泌体治疗缺血再灌注导致的小鼠aki,促进机体生理性修复,抑制病理性修复,从而恢复小鼠肾功能。
本发明是利用胚胎干细胞来源的外泌体治疗小鼠皮肤损伤。
本发明可以有效地治疗小鼠缺血再灌注导致的aki,促进肾脏结构及功能的恢复。
本发明可以有效地促进小鼠皮肤损伤的恢复。
附图说明
图1为外泌体特征的鉴定,该外泌体为胚胎干细胞来源的外泌体。
图2为外泌体治疗缺血再灌注导致的aki小鼠,h&e染色显示外泌体处理对小鼠损伤肾脏结构的恢复有很好的治疗效果。
图3为外泌体治疗缺血再灌注导致的aki小鼠,masson染色显示外泌体处理抑制肾脏的纤维化。
图4为外泌体对小鼠皮肤损伤的治疗效果。
具体实施方式
下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法,所用试剂均可以从商业途径获得。
实施例1,本发明提供一种干细胞来源的外泌体提取及鉴定的方法。
细胞培养基购于hyclone公司;双抗、胰酶等试剂购于gibco公司;细胞培养耗材均购于nest公司。
细胞培养所需血清为去除外泌体的胎牛血清,购于bi公司,处理步骤如下:将胎牛血清置于超速离心管中,配平后,120000g在4℃离心2h,离心后在超净台中取上清,并用0.22μm的针式滤器过滤上清,保存于-80℃冰箱备用。
细胞传代培养、冻存及复苏等细胞生物学实验操作步骤详见《动物细胞培养(第六版)》。
收集含有外泌体的esc条件培养基:当培养于75cm2的细胞培养瓶中的esc处于对数增长期,细胞汇合度达到80%时,吸尽培养基,用pbs洗两次,每个细胞培养瓶中加入10ml配置好的含有10%无外泌体的fbs的完全培养基,继续培养24h后,将培养基收集至50ml离心管中,该培养基为富含外泌体的条件培养基。
超速离心法分离提取外泌体:①将上述步骤获得的条件培养基于4℃,500g离心10min,去除细胞碎片;②将所得上清于4℃,2000g离心10min,去除凋亡小体等大的细胞碎片;③用0.22μm的针式滤器过滤所得上清,去除直径大于200nm的微囊泡;④把过滤后的上清置于超速离心管中,于4℃,120000g离心2h,弃上清,加入适量pbs重悬管底沉淀,于-80℃保存。
通过westernblot检测外泌体标志蛋白alix和cd63(图1)。
1)蛋白样品制备:将超速离心后得到的外泌体沉淀中加入ripa裂解液裂解外泌体,1mlripa裂解液加入10ul蛋白酶抑制剂pmsf。将样品在冰上裂解30min,每5min在涡旋振荡器上震荡,确保充分裂解,半小时后于4℃,12000rpm离心15min,将上清移入新的ep管中;使用bca法测定外泌体蛋白浓度,其余蛋白液中加入5×sds上样缓冲液,在沸水中煮5-10分钟变性,变性完成后将蛋白立即放入液氮中冷激速冻,保存于-80℃冰箱中备用。
2)配胶:将洁净晾干的玻璃板装于制胶架上,使底边吻合严密,用蒸馏水验漏。按照分离胶配方配制10%的分离胶溶液,充分混匀,用移液器加入4.5ml分离胶溶液至玻璃板缝隙中,立即轻柔加入蒸馏水将分离胶液面压平,约30min后分离胶凝固。按照配方配制5%的浓缩胶溶液,加入1.5ml浓缩胶溶液到分离胶的上方,立即插入梳子,待浓缩胶凝固后便可使用。
3)聚丙烯酰胺凝胶电泳:将配好的胶板放置到电泳槽内,注意短玻板向内侧,在两块玻板中间加入1xrunningbuffer,将梳子拔出,按照测定蛋白浓度统一上样量,按照等质量(20ug-50ug)的原则进行蛋白上样,并用1xsds将上样总体积调平至20ul,将蛋白样品加入上样孔中,添加电泳液至电泳槽标记处,盖好电泳槽盖,注意正负极方向一致,浓缩胶用80v电压,待溴酚蓝跑至分离胶时,将电压调至110v,直至溴酚蓝接近玻板底部时停止电泳,整个电泳所用时长为1.5小时。
4)转膜:提前准备好预冷的含有20%甲醇的转膜液(1xtransferbuffer),将转膜夹、海绵及滤纸浸泡于预冷的转膜缓冲液中,小心撬开胶板,把电泳后的聚丙烯酰胺凝胶置于黑色夹板一侧,剪取适宜大小的pvdf膜,置于甲醇中活化60s,放置于胶上,除尽胶与膜之间的气泡,在膜上轻轻地覆盖滤纸和海绵,按照转膜夹负极(黑色)-海绵-滤纸-胶-pvdf膜-滤纸-海绵-转膜夹正极(白色)顺序夹好转膜夹,放置于转膜槽中,添加转膜液,将整个转膜槽放置于装满冰的泡沫盒内,冰浴恒压100v转膜2h。
5)封闭:将转膜完成的pvdf膜取出,置于5%的脱脂牛奶(封闭液)中,水平摇床60rpm室温封闭2h。
6)抗体孵育:①一抗孵育:用封闭液按照说明书稀释一抗(alix,1:2000稀释;cd63,1:2000稀释),吸取2ml一抗置于抗体孵育盒中,对照蛋白marker进行剪膜,将膜置于对应一抗中,4℃孵育过夜;②二抗孵育:将条带置于tbst中,水平摇床上,120rpm清洗3次,每次10min,然后加入对应的二抗,水平摇床60rpm室温孵育2h,孵育完成后用tbst洗3次,每次10min。
7)发光检测:把发光液a、发光液b按1:1比例进行混合配成工作液,通过曝光仪进行曝光。
实施例2,本发明提供建立小鼠缺血再灌注诱导急性肾损伤模型的方法。
1)选取8周龄左右的c57/bl6小鼠,称重,用1.25%阿佛丁(10μg/g)腹腔注射麻醉,剔除背部毛发,并用碘伏、酒精擦拭消毒;
2)于背部脊椎旁0.5cm、肋骨下缘0.5cm处剪开皮肤及肌肉,可见到肾脏,小心分离出左侧肾脏的肾动脉,用非创伤性的微血管夹夹闭肾蒂,可见肾脏由鲜红色变为紫黑色即为夹闭成功,期间用润湿的纱布覆盖窗口,保持肾脏表面湿润;
3)夹闭45min后,移除血管夹,看到肾脏即刻再灌注成功,变为红色;
4)约5min后,向肾皮质中注射100ug介质(pbs、esc-evs);
5)依次逐层缝合腹膜、肌肉、皮肤;
6)将小鼠置于加热垫上复苏,转醒后,放回笼子中。
实施例3,本发明提供小鼠皮肤损伤模型的构建方法。
1)小鼠称重,用1.25%阿佛丁(10μg/g)腹腔注射麻醉小鼠;
2)剔除背部毛发,在小鼠背部剪除全层皮肤及肉膜,暴露肌肉层,造成直径为1cm的圆形皮肤缺损;
3)使用6-0尼龙缝线将环形硅酮夹板(内径:10mm,外径:15mm)固定在适当的位置,以防止伤口收缩,从而限制伤口。
4)将手术后动物随机分为2组:pbs对照组,esc-evs处理组,在皮肤损伤部位给小鼠皮下注射介质。
1.该治疗手段的有效成分为干细胞来源的外泌体,是一种从体外培养的细胞上清中分离提取,携带了供体细胞内多种蛋白质、rna等生物活性分子,并具有损伤治疗功能的细胞旁分泌成分。
2.根据权利要求1所述的外泌体,其特征在于:该外泌体来源于胚胎干细胞。
3.一种递送外泌体并促进急性肾损伤后肾脏功能恢复的技术手段,是用权利要求1所述的外泌体处理缺血再灌注导致的急性肾损伤小鼠,促进肾脏功能以及结构的恢复。
4.根据权利要求3所述的技术手段,其特征在于:所述技术可以通过外泌体促进急性肾损伤后肾脏功能及结构的恢复,包括促进生理性修复,抑制病理性修复机制。
5.一种递送外泌体并促进皮肤损伤后伤口愈合的技术手段,是用权利要求1所述的外泌体处理割伤导致的皮肤外伤,促进皮肤伤口的愈合。
6.根据权利要求5所述的在组织损伤中的应用,其特征在于,组织损伤包括肾脏损伤、皮肤损伤、肝脏损伤、下肢缺血等。
技术总结