本发明涉及植物外泌体样囊泡的分离提取及抗癌药物研究技术领域，更具体地，涉及含有活性药物成分的黄瓜外泌体样囊泡的提取，及该外泌体样囊泡作为抗癌药物的可行性研究。
背景技术：
1.外泌体是一种细胞主动分泌的纳米级囊泡结构，近年来，其作为药物载体的研究十分热门，因其可参与细胞间通讯等多种生物过程。而且，外泌体外部的脂质双分子层能够有效保护内部的活性成分，保障其在到达靶部位前不被分解。此外，脂质双分子层的存在为多种功能分子提供了修饰位点。
2.然而，动物外泌体的获取分离在实际应用中仍然存在一些问题。例如，通过细胞培养的方式获取外泌体存在耗时长，数量有限，成本高等缺陷。而且，肿瘤细胞来源的外泌体，不仅本身有可能促进肿瘤的扩散，而且可能引起机体严重的免疫应答。这大大限制了其在药物载体研究领域的应用。
3.植物外泌体样囊泡同动物外泌体一样含有脂质双分子层结构，能够保护其内部活性成分，而且，植物外泌体样囊泡含有天然的药理活性成分可用于多种疾病的治疗。同时，其分离具有速度快、产量高、成本低等优势。此外，一些研究表明，可食用植物所分泌的外泌体样囊泡不会引起人体的免疫反应。基于上述优点，植物外泌体样囊泡在药物载体中的研究应用具有巨大的潜力。
4.黄瓜是一种日常蔬菜，具有悠久的药用历史，其药用价值在《千金髓方》、《医林集要》等典籍中均有记载，内含多种药理活性成分，如葫芦素、维生素等，具有抗癌、抗炎等药理作用。目前，已有研究从黄瓜中分离获得葫芦素b等活性成分。然而，葫芦素b稳定性差，往往易受温度、湿度等环境因素影响而发生结构变化，从而影响其药理活性。而且，葫芦素b的水溶性低，大大限制了其临床应用。黄瓜外泌体样囊泡具有与外泌体类似的脂质双分子层结构，是一种天然的保护膜，能减少外界环境对其内在成分的影响。此外，脂质双分子层的存在也在一定程度上增加了葫芦素b的水溶性与生物相容性。
5.抗癌活性成分通常需要结合适当的药物递送载体才可更好地发挥其抗癌作用。这往往需要复杂的装载程序。例如将药物与载体单元通过化学合成的方法共价连接，再通过自组装的方式形成药物-载体复合物，这通常需要严格的实验条件与专业的操作人员。近年来，dna自组装技术的发展使得dna纳米结构成为热门的药物载体研究对象，科研工作者仅需将药物与dna孵育即可得到药物-载体复合物。然而dna价格昂贵，设计复杂，体内稳定性差，易被酶解，这在一定程度上限制了dna自组装技术在药物载体上的应用。更为简单的组装方法是将合成的脂质结构与活性药物混合，通过额外的挤压方法制备而成。而黄瓜外泌体样囊泡在无需任何组装的条件下，即可直接高效用于抑制癌细胞的增殖。这是由于其同时含有可作为药物载体的脂质双分子层结构和作为抗癌活性成分的葫芦素b。脂质双分子层作为一种天然的药物载体，能够提高癌细胞对葫芦素b的摄取率，从而达到更好的抗癌效果。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种含有葫芦素b且可作为抗癌药物的黄瓜外泌体样囊泡及其制备方法和应用。
（1）本发明涉及从黄瓜中分离获得外泌体样囊泡，所得的外泌体样囊泡含有葫芦素b抗癌活性成分，且含有能够保护内部活性成分的脂质双分子层，可以有效维持其内部活性成分的稳定性；
（2）本发明所得的黄瓜外泌体样囊泡可显著抑制a549细胞的活性，其最高细胞活性抑制率是葫芦素b标准品的两倍，且用量更少，能够减少高剂量抗癌药物引起的正常细胞毒性和癌细胞耐药性等问题；
（3）本发明所得的黄瓜外泌体样囊泡可抑制多种癌细胞的增殖。
解决技术方案
为实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
步骤a.黄瓜外泌体样囊泡的制备：
（1）通过榨汁机对黄瓜榨汁并经纱布过滤得到滤液；
（2）对所述滤液进行离心并通过除去沉淀得到上清液；
（3）对所述上清液进行超速离心后，用适量pbs重悬沉淀后得到黄瓜外泌体样囊泡。
所述步骤(1)中的榨汁需用预冷pbs或pbs冰块与黄瓜相混合。
所述步骤(2)中的离心分离在5000g下进行10min，10000g下进行35min。
所述步骤(3)中的超速离心分离在30000g下进行30min。
步骤b.黄瓜外泌体样囊泡中活性成分的分析前处理方法：
（1）将权利要求7-10所得的黄瓜外泌体样囊泡进行离心，弃去上清液pbs，获得黄瓜外泌体样囊泡沉淀；
（2）使用适量甲醇重悬黄瓜外泌体样囊泡沉淀得到黄瓜外泌体样囊泡悬液，并超声；
（3）对所述超声后的悬液进行离心，黄瓜外泌体样囊泡沉淀待用，收集上清液；
（4）重复步骤（2）（3）两次，合并3次收集的上清液。
所述步骤（2）（4）中甲醇总量与黄瓜外泌体样囊泡总蛋白的比例为1ml:6mg（使用bca蛋白定量试剂盒测定黄瓜外泌体样囊泡的总蛋白）。
所述步骤（2）中超声参数为500w，15min。
步骤c.高效液相色谱分析黄瓜外泌体样囊泡中活性成分的重要参数：
（1）流动相条件为乙腈-水（45:55）；
（2）柱温为30℃；
（3）检测波长为228nm。
步骤d.葫芦素b与黄瓜外泌体样囊泡用于杀伤多种癌细胞：
（1）将癌细胞悬液均匀加入96孔板中，待细胞贴壁后吸弃培养液；
（2）给药：将葫芦素b标准品与黄瓜外泌体样囊泡分别加入到上述96孔板的不同孔中，反应24h后吸弃；
（3）在上述96孔板中加入mtt溶液，反应4h后吸弃；
（4）在上述96孔板中加入二甲基亚砜（dmso），震摇后用酶标仪测定吸光度，计算细胞存活率。
所述步骤（1）中，细胞悬液浓度为10万个细胞/ml，每孔细胞悬液体积为100μl。
所述步骤（2）中，葫芦素b标准品的给药浓度为0、12.5、25、50、100、200、400、800、1600、3200nm。黄瓜外泌体样囊泡的给药浓度为0、0.078、0.16、0.31、0.62、1.25、2.5、5、10、20nm（此处浓度为黄瓜外泌体样囊泡内葫芦素b的浓度）。
所述步骤（3）中，mtt的浓度为0.5mg/ml，每孔加入的体积为100ul。
所述步骤（4）中，dmso的体积为150μl。检测波长为570nm。
步骤e.利用ros（活性氧）检测试剂盒检测葫芦素b标准品和黄瓜外泌体样囊泡孵育后的a549细胞内ros的产生情况：
（1）将a549细胞悬液均匀加入24孔板中，待细胞贴壁后吸弃培养液；
（2）将荧光探针（dcfh-da）加入到上述24孔板中，孵育1h后吸弃；
（3）在上述24孔板不同孔中分别加入无血清rpmi-1640细胞培养基，rosup（阳性对照品），葫芦素b和黄瓜外泌体样囊泡，孵育15min后吸弃；
（4）在上述24孔板中加入适量无血清rpmi-1640细胞培养基，观察不同组细胞之间的荧光强度。
所述步骤（1）中，a549细胞悬液的浓度为5万个细胞/ml，每孔细胞悬液体积为800μl。
所述步骤（2）中，荧光探针dcfh-da的浓度为10μm。吸弃后需用无血清rpmi-1640细胞培养基清洗3遍。
所述步骤（3）中，rosup的稀释比为1:200，葫芦素b的浓度为500nm，黄瓜外泌体样囊泡的浓度为20nm（此处浓度为黄瓜外泌体样囊泡内葫芦素b的浓度）。
所述步骤（4）中荧光激发波长为488nm。
有益效果
与现有技术相比，本发明优点在于：
（1）本发明从黄瓜中分离出外泌体样囊泡的制备方法操作简便，与动物外泌体相比，产量更高，速度更快，成本更低；
（2）本发明所制备的黄瓜外泌体样囊泡含有葫芦素b抗癌活性成分，且黄瓜外泌体样囊泡本身含有的天然脂质双分子层结构能够在较长时间内维持葫芦素b的稳定性；
（3）该黄瓜外泌体样囊泡同时含有载体与抗癌活性成分，可作为一种天然的抗癌药物直接用于抑制癌细胞的增殖，且作用于a549细胞时，黄瓜外泌体样囊泡的最大细胞活性抑制率（95.1%）是葫芦素b标准品（45.7%）的2倍。
（4）高剂量的抗癌药物容易引起正常细胞的死亡并增加癌细胞的耐药性。而a549细胞毒性实验结果显示，在达到相同细胞活性抑制率时，黄瓜外泌体样囊泡内葫芦素b的浓度远低于葫芦素b标准品的浓度，故黄瓜外泌体样囊泡能够有效解决高剂量葫芦素b标准品引起的正常细胞毒性以及癌细胞耐药性等问题。
附图说明
图1为实施例1分离获得的黄瓜外泌体样囊泡的表征结果图。图中：（a）动态光散射检测黄瓜外泌体样囊泡的粒径分布；（b）透射电子显微镜表征黄瓜外泌体样囊泡的形貌；（c）黄瓜外泌体样囊泡的zeta电位。
图2为实施例2中黄瓜外泌体样囊泡中葫芦素b和葫芦素b标准品的高效液相分析图。
图2-1为实施例2中葫芦素b标准品的线性分析图。
图3为实施例4中葫芦素b标准品与黄瓜外泌体样囊泡使a549细胞产生ros的表征图。荧光显微镜下未经任何药品处理的a549细胞的（a）明场与（b）荧光场图片；经rosup（ros阳性对照品）处理的a549细胞的（c）明场与（d）荧光场图片；经葫芦素b标准品处理的a549细胞的（e）明场与（f）荧光场图片；经黄瓜外泌体样囊泡处理的a549细胞的（g）明场与（h）荧光场图片。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、表征及性能分析方法，以下将结合附图对本发明的实施方式详予说明。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂可以商业购买得到。
实施例1：
本发明的实施例1提供了一种从黄瓜中分离外泌体样囊泡的方法，其制备步骤如下：
（1）通过榨汁机对黄瓜榨汁并经纱布过滤得到滤液；
（2）对所述滤液进行离心并通过除去沉淀得到上清液；
（3）对所述上清液进行超速离心后，用适量pbs重悬沉淀后得到黄瓜外泌体样囊泡。
所述步骤(1)中的榨汁需用预冷pbs或pbs冰块与黄瓜相混合。
所述步骤(2)中的离心分离在5000g下进行10min，10000g下进行35min。
所述步骤(3)中的超速离心分离在30000g下进行30min。
所得黄瓜外泌体样囊泡的表征结果如图1所示，（a）动态光散射检测黄瓜外泌体样囊泡的粒径分布；（b）透射电子显微镜表征黄瓜外泌体样囊泡的形貌；（c）黄瓜外泌体样囊泡的zeta电位。
实施例2：
利用高效液相色谱法对实施例1制得的黄瓜外泌体样囊泡中的活性成分进行分析的过程如下：
（1）将实施例1制得的黄瓜外泌体样囊泡进行离心，弃去上清液pbs，获得黄瓜外泌体样囊泡沉淀；
（2）使用适量甲醇重悬黄瓜外泌体样囊泡沉淀得到黄瓜外泌体样囊泡悬液，并超声；
（3）对所述超声后的悬液进行离心，黄瓜外泌体样囊泡沉淀待用，收集上清液；
（4）重复步骤（2）（3）两次，合并3次收集的上清液。
所述步骤（2）（4）中，甲醇总量与黄瓜外泌体样囊泡总蛋白的比例为1ml:6mg（使用bca蛋白定量试剂盒测定黄瓜外泌体样囊泡的总蛋白）。
所述步骤（2）中，超声参数为500w，15min。
所述步骤（4）中的上清液需用0.22μm滤膜过滤后待用。
以流动相为乙腈-水（45:55），流速为1ml/min，柱温为30℃的条件，对葫芦素b标准品以及黄瓜外泌体样囊泡的超声提取物在228nm处进行分析检测。
黄瓜外泌体样囊泡内的葫芦素b和葫芦素b标准品的高效液相分析图如图2所示；葫芦素b标准品的线性分析图如图2-1所示。
实施例3：
经mtt法验证葫芦素b标准品和黄瓜外泌体样囊泡对癌细胞的细胞毒性作用，具体操作方法如下：
（1）将癌细胞悬液均匀加入96孔板中，待细胞贴壁后吸弃培养液；
（2）给药：将葫芦素b标准品与实施例1制得的黄瓜外泌体样囊泡分别加入到上述96孔板的不同孔中，反应24h后吸弃；
（3）在上述96孔板中加入mtt溶液，反应4h后吸弃；
（4）在上述96孔板中加入二甲基亚砜（dmso），震摇后用酶标仪测定吸光度，计算细胞存活率。
所述步骤（1）中，细胞悬液浓度为10万个细胞/ml，每孔细胞悬液体积为100μl。
所述步骤（2）中，葫芦素b标准品的给药浓度为0、12.5、25、50、100、200、400、800、1600、3200nm。黄瓜外泌体样囊泡的给药浓度为0、0.078、0.16、0.31、0.62、1.25、2.5、5、10、20nm（此处浓度为黄瓜外泌体样囊泡内葫芦素b的浓度）。
所述步骤（3）中，mtt的浓度为0.5mg/ml，每孔加入的体积为100ul。
所述步骤（4）中，dmso的体积为150μl。检测波长为570nm。
如表1所示，第一，相较于葫芦素b标准品，实施例1所制备的黄瓜外泌体样囊泡对a549细胞具有更好的杀伤作用，其最高细胞活性抑制率（95.1%）是葫芦素标准品（45.7%）的2倍，且用量更低；第二，实施例1所制备的黄瓜外泌体样囊泡对多种癌细胞都具有良好的杀伤作用。
表1葫芦素b标准品与黄瓜外泌体样囊泡作为抗癌药物用于肿瘤细胞
的杀伤结果
实施例4：
利用ros检测试剂盒验证葫芦素b标准品和黄瓜外泌体样囊泡使a549细胞产生ros的情况。具体步骤如下：
（1）将a549细胞悬液均匀加入24孔板中，待细胞贴壁后吸弃培养液；
（2）将荧光探针（dcfh-da）加入到上述24孔板中，孵育1h后吸弃；
（3）在上述24孔板不同孔中分别加入无血清rpmi-1640细胞培养基，rosup（阳性对照品），葫芦素b和实施例1制得的黄瓜外泌体样囊泡，孵育15min后吸弃；
（4）在上述24孔板中加入适量无血清rpmi-1640细胞培养基，观察不同组细胞之间的荧光强度。
所述步骤（1）中a549细胞悬液的浓度为5万个细胞/ml，每孔细胞悬液体积为800μl。
所述步骤（2）中荧光探针dcfh-da的浓度为10μm。吸弃后需用无血清rpmi-1640细胞培养基清洗3遍。
所述步骤（3）中rosup的稀释比为1:200，葫芦素b的浓度为500nm，黄瓜外泌体样囊泡的浓度为20nm（此处浓度为黄瓜外泌体样囊泡内葫芦素b的浓度）。
所述步骤（4）中荧光激发波长为488nm。
如图3所示，黄瓜外泌体样囊泡与葫芦素b标准品能够使a549细胞产生ros。荧光显微镜下未经任何药品处理的a549细胞的（a）明场与（b）荧光场图片；经rosup（ros阳性对照品）处理的a549细胞的（c）明场与（d）荧光场图片；经葫芦素b标准品处理的a549细胞的（e）明场与（f）荧光场图片；经黄瓜外泌体样囊泡处理的a549细胞的（g）明场与（h）荧光场图片。
1.一种用于抗癌的黄瓜外泌体样囊泡。
2.根据权利要求1所述的用于抗癌的黄瓜外泌体样囊泡，其特征在于，所述黄瓜外泌体样囊泡由黄瓜中分离出来。
3.根据权利要求1-2任一所述的用于抗癌的黄瓜外泌体样囊泡，其特征在于，所述黄瓜外泌体样囊泡内含有葫芦素b抗癌活性成分。
4.根据权利要求1-3任一所述的用于抗癌的黄瓜外泌体样囊泡，其特征在于，所述黄瓜外泌体样囊泡的粒径为180-350nm。
5.根据权利要求1-4任一所述的用于抗癌的黄瓜外泌体样囊泡，其特征在于，所述黄瓜外泌体样囊泡在制备各种癌细胞的杀伤药物中的应用，其包括a549细胞；hgc27细胞；hepg2细胞；hela细胞；mda-mb-231细胞；4t1细胞。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的药物选自颗粒剂、胶囊剂、软胶囊剂、口服液体制剂、注射剂、经皮给药制剂的任一种。
7.一种用于制备根据权利要求1-4任一项所述的黄瓜外泌体样囊泡的方法，其包括：
（1）通过榨汁机对黄瓜榨汁并经纱布过滤得到滤液；
（2）对所述滤液进行离心并通过除去沉淀得到上清液；
（3）对所述上清液进行超速离心后，用适量pbs重悬沉淀后得到黄瓜外泌体样囊泡。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的榨汁需用预冷pbs或pbs冰块与黄瓜相混合。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的离心分离在5000-10000g之间进行10-35min。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的超速离心分离在30000g下进行30min。
技术总结