本发明属于中医药学领域，具体涉及中药颗粒剂，本发明颗粒剂可用于治疗慢性阻塞性肺疾病稳定期，适用于咳嗽，喘息，气短、动则加重，乏力，易感冒；慢性阻塞性肺疾病稳定期见上述证候者。本发明还涉及制备所述中药颗粒剂的方法。
背景技术：
慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)，它是一种使气道逐渐阻塞的破坏性肺部疾病，常见的慢性支气管炎和肺气肿多属于此病范畴。慢阻肺通常由吸烟或长期处于烟雾或灰尘污染空气环境中所引起。慢阻肺的症状包括咳嗽，咳痰和呼吸短促等。很多患有慢阻肺的人并不知道他们患有此病。因为早期症状不明显，仅有肺功能的下降。当症状出现时，一些人只认为是人体衰老的自然进程，并未给予足够的重视，导致病情进一步加重。据世界卫生组织估计，慢阻肺在全球疾病死亡原因当中，次于心脏病、脑血管病和急性肺部感染，与艾滋病一起并列第4位。我国最新的流行病学调查显示我国40岁以上中老年群体慢阻肺的发病率达8.2％，其中男性的发病率高于女性，但近年来，随着女性吸烟率的增加，女性患者的发病率亦呈逐年上升趋势。慢阻肺患者约占呼吸科日常门诊量的50％左右。冬季、流感季节就诊人数还会增加。近年来慢阻肺的诊出率逐年攀升，我国慢阻肺患者已经超约1亿，成为仅次于高血压、糖尿病的中国第三大常见慢性病。
我国新制定的“慢阻肺诊治指南”对慢阻肺患者病情分为急性加重期和稳定期两个阶段。对于慢阻肺的治疗，目前医学上尚未发现可以彻底改变长期肺功能低下的方法。因此治疗该病的一个关键目标是减少其发作，因为病情反复发作与患者健康状况恶化、病情加重和死亡率增加密切相关。减少发作，就需要对慢阻肺早期阶段或在病情稳定期坚持进行积极治疗。
目前临床对慢性阻塞性肺疾病特别是稳定期的治疗，主要以西药为主，主要药物为支气管舒张剂、糖皮质激素、祛痰剂等，由于需要长期应用，毒副作用大，费用昂贵，社会和经济负担大，并且不能避免患者的反复感染，导致疾病缠绵难愈，病情进行性加重，最终形成肺心病，患者生活质量下降,甚至危及生命。近年来中医药治疗慢阻肺已受到广泛的重视，其安全性和有效性已得到临床认可，中医药介入慢阻肺防治已成近年研究热点。通过中医的辨证施治，从整体上标本兼治，不仅有效缓解患者慢性咳嗽、咯痰、呼吸困难等症状，并且提高了患者的免疫力，增强了患者的抗病能力，减少了病情的复发与加重，从而延缓并阻止了病情的发展，促进了患者机体的恢复，从根本上提高了患者的生存质量。因此有效的治疗慢阻肺稳定期的中成药对于该病患者的长期预后具有重要的临床意义。
技术实现要素：
现代医学对慢阻肺尚无有效的根治办法，只能改善症状和减少并发症，长期使用西药不良反应多，如心律失常、增加心血管事件及肺炎发生率。中医药治疗慢阻肺具有鲜明的特色和优势，不仅可以改善免疫失衡，提高肺功能，还可以通过调节气血阴阳，改善临床症状，减少急性发作次数，延缓病情发展，促进患者机体恢复，从根本上提高患者的生存质量。
慢阻肺多属于中医学“肺胀”、“喘病”等范畴，从病因病机方面分析，慢阻肺病变首先在肺，继则影响脾、肾，后期病及于心。病机演变多经由肺气虚、脾气虚、肾气虚、心气虚等不同阶段而逐渐加重，痰瘀互结，虚实夹杂。外邪从口鼻、皮毛入侵，多首先犯肺，导致肺气宣降失常，肺气上逆，发为咳，病久肺虚，气失所主而喘；肺病及脾，气津失布则痰饮内蕴，痰气搏结，壅塞气道，则咳喘咯痰、胸中胀满、憋闷如塞；肾气衰惫，肾阳衰微，则气不化水，水邪泛溢则肿。同时，肺辅心行血，肺虚治节失职，日久心失调节，心气渐虚，无力推动血脉，血行不利则面如烟熏，唇舌紫暗，舌下脉络曲张；瘀滞肺脉则肺气壅塞更甚，造成气虚血滞，血滞气郁恶性循环。
《慢性阻塞性肺疾病中医证候诊断标准(2011版)》将慢阻肺的证候分为基础证和临床常见证。基础证有9种，即寒饮证、痰热证、痰湿证、血瘀证、肺气虚证、肺阴虚证、脾气虚证、肾气虚证、肾阴虚证，基础证可单独出现，但常常以复合形式出现。常见证候包括虚证类(肺气虚证、肺脾气虚证、肺肾气虚证、肺肾气阴两虚证)、实证类(风寒袭肺证、外寒内饮证、痰热壅肺证、痰浊阻肺证、痰蒙神窍证)、兼证类(血瘀证)等3类10个证候。值得注意的是，稳定期以虚症为主常兼血瘀、痰浊。因此本病总属本虚标实，以肺气虚损为本，以瘀血、痰、热为标，本病总由肺气虚损，气不行血，以致瘀血内停，或肺气不足，气不布津，聚而成痰。日久痰瘀互结，瘀久化热，内舍肺络以使痰、瘀、热三者相互并见，错杂为患。内客于肺，肺失宣降而发为本病。
慢性阻塞性肺病稳定期常规治疗均以补虚为主，例如对于肺脾两虚的患者，常重用党参、黄芪、白术、淮山药、茯苓等健脾益肺药，通过健脾气充肺气；对于肺肾两虚的患者，常重用人参、熟地黄、山茱萸、山药等健脾补肾药，通过培本固元补肺纳肾。常规治疗方法的缺陷在于：以虚症为主的病例中，如果不注意解决标实证，常常会影响补虚的效果。慢阻肺稳定期的标实证属于正气虚弱，布化失常，以致产生痰饮、瘀血等实邪，如果只补不清，或重补轻清，则会有闭门留寇之虞，导致病情缠绵不愈。因只补不清会导致诸多不适，滋阴药会导致纳差、脘腹胀满、腹泻等不适；补气补阳药物会导致肺气宣降不行，气停滞在上焦，气有余便是火，所以会出现上焦热证。此外还有一类患者先天禀赋不足，体质不佳，平素只能进食清淡之品，稍进食多一点肉类、蛋类，甚至鸡汤、几枚大枣都会出现燥热、口干等不适。发病时参、芪之品一用即各种热证丛生，稍进滋腻之品，立刻出现纳食差、胸闷、腕腹胀满，此类病人一旦发病只能顺势调理。清代陈士铎著《本草新编》曰：“然往往有愈补愈虚者，乃虚不受补，非虚不可补也。故补之法亦宜变。补中而增消导之品，补内而用制伏之法，不必全补而补之，更佳也。”本发明汲古求新，通过患者的症状特点及病因病机的演变规律，克服常规治疗方法的缺陷，对慢阻肺稳定期的辨治论治进行组方创新，发明了本颗粒剂。
本发明颗粒剂的特点是独创祛痰瘀化滞“角药”---蜜麻黄、黄芩、蜜紫菀，该“角药”是本发明组方的主要组成部分，本发明采用“清热降气化滞法”作为治疗的基本治法，采用标本兼治方法，将祛痰化瘀与益气养阴并重的原则。在宣肺平喘、消痰止咳、清热解毒等方面效果显著，优于目前常用中药组方。
本发明通过以下三个方面来实现：(1)组方中同时使用蜜麻黄和蜜紫菀，通过改变药材的炮制方法增强宣肺平喘、润肺下气、消痰止咳作用，同时降低了药材的毒性。(2)使用“角药”---蜜麻黄、黄芩、蜜紫菀，该“角药”为本发明组方的主要组成部分，借鉴六味地黄丸的三补三泻的组方方式，将补虚与祛痰热并重。为达到“清热降气化滞”的疗效，调整“角药”---蜜麻黄、黄芩、蜜紫菀的用量，使本颗粒剂适合慢阻肺稳定期患者长期服药调补。(3)研究黄芩在不同提取方式下的黄芩苷的含量，从而确定最佳提取方式，使组方中黄芩苷的含量提高接近80％，确保了产品的疗效。下面对本发明颗粒的上述三个特点逐条说明：
本发明颗粒剂中同时使用了蜜麻黄和蜜紫菀，麻黄经中药蜜炙法炮制后为蜜麻黄，紫菀经中药蜜炙法炮制后为蜜紫菀。蜜炙法的目的是消除或减低药物的毒性，并且适当地改善药物性能。古代文献中的蜜炙法是将药物涂蜜后，用微火炙干。现行的蜜炙法近于古代的蜜水拌炒法。《医学校正入门》指出：“蜜炙性温，健脾胃和中，补三焦元气。”中药蜜炙通常具有增强润肺止咳、缓和药性、矫味和消除副作用等作用。具体到麻黄和紫菀两味药材，其蜜炙前后的功效变化如下：
麻黄的功效(蜜炙前)：本品含麻黄碱,伪麻黄碱等多种生物碱及挥发油。生用发汗作用甚强,对体虚患者不宜用。故在临床上,常常将其用热水洗,随即捶成绒,习称麻黄绒,从而缓和了作用,适用于老人、幼儿及体虚风寒感冒。生麻黄辛温，善于宣通肺气，发散表邪，适用于寒实肺闭之症，多用于风寒表实证。
蜜麻黄的炮制方法及功效(蜜炙后)：麻黄去除木质茎、残根及杂质，切10-15mm段。将炼蜜加适量(约2-3倍量)沸水稀释后，加入麻黄段中拌匀，闷透，置炒制容器内，用文火炒至不粘手，取出，放凉。每100kg麻黄用炼蜜20kg。麻黄经温蜜渗入和文火炒制,从而使其发汗作用的挥发油含量减少了二分之一,止咳平喘作用的麻黄碱含量却减少甚微。蜜麻黄性温偏润，辛散发汗作用缓和，长于降逆平喘，为宣肺平喘降逆的要药及首选用药，多用于表证较轻，而肺气雍闭，咳嗽气喘较重的患者。故在临床上对表证已解而喘咳未愈的体虚患者,须用蜜麻黄而不宜用生麻黄。
紫菀的功效(蜜炙前)：紫菀生品以散寒、降气化痰力胜，能泻肺气之雍滞。多用于风寒咳嗽，痰饮喘咳，小便癃闭。
蜜紫菀的炮制方法及功效(蜜炙后)：紫菀去除杂质，用适量饮用水冲洗干净，切10-15mm段。将炼蜜加适量(约2-3倍量)沸水稀释后，加入紫菀段中拌匀，闷透，置炒制容器内，用文火炒至不粘手，取出，放凉。每100kg紫菀段用炼蜜25kg。紫菀经温蜜渗入和文火炒制后则转泻为润，以润肺止咳力胜，故蜜紫菀多用于肺虚久咳或肺虚咳血。
慢性阻塞性肺疾病病程绵长，患者多为老人，病情迁延不愈致肺虚久咳患者，不宜用生麻黄和生紫菀，蜜炙麻黄可以减小毒性和不良反应，中医临床用药实际为“解表生用，平喘蜜炙”，蜜麻黄服用后发汗作用减弱，而平喘作用更加突出。本发明颗粒剂同时使用蜜麻黄和蜜紫菀，避免耗气伤津，同时增强平喘之力。
本发明颗粒剂借鉴六味地黄丸的三补三泄2组“角药”的组方方式，采用“清热降气化滞法”作为治疗的基本治法，使用“角药”---蜜麻黄、黄芩、蜜紫菀，该“角药”为本颗粒剂组方的主要组成部分，麻黄辛微苦温、宣肺解表平喘；黄芩味苦性寒，善清上焦肺火为长，擅长清肺平喘；蜜紫菀辛苦温、润肺下气化痰止咳。蜜麻黄与黄芩配伍，一宣一降，相反相成，使气机升降出入恢复正常，蜜麻黄开宣肺气以平喘，黄芩清泄肺热，蜜麻黄得黄芩，宣肺平喘而不助热；黄芩得蜜麻黄，清解肺热而又不凉遏；蜜麻黄与蜜紫菀配伍，一升一降，蜜紫菀温引经入肺，宣降肺气，辛凉透邪，疏泄肺郁壅滞，化痰止咳，降逆平喘。三药合用，一清一散，一降一升，调理气机，和调内外，以使清者升，浊者降，达到“清热降气化滞”的目的。
本病在重视其“痰挟瘀血”之性，治血瘀必治痰，痰化血易行，因此本发明组方的核心在于“清热降气化滞”，其是通过整体调整“角药”---蜜麻黄、黄芩、蜜紫菀的用量来实现的，按照《中国药典》规定，麻黄用量为2-10g，黄芩用量为3-10g,紫菀用量为5-10g,本颗粒发明人在采用蜜炙药材的基础上使用了非常规用量，处方中蜜麻黄用量增加为10-12g，黄芩用量增加为16-20g,蜜紫菀用量增加为18-20g。通过“清热降气化滞”祛瘀化痰平喘从而达到治疗血瘀，从整体上标本兼治，不仅有效缓解患者慢性咳嗽、咯痰、呼吸困难等症状，通过调节气血阴阳提高了患者的免疫力，增强了患者的抗病能力，减少了病情的复发与加重，从而延缓并阻止了病情的发展，促进了患者机体的恢复，从根本上提高了患者的生存质量。
在实施例6中，发明人对黄芩不同提取方法中的黄芩苷含量进行了研究，发现黄芩的投料方式对有效成分黄芩苷有显著影响，从而确定最佳提取方式，使组方中黄芩苷的含量提高接近80％，确保了产品的疗效。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种用于治疗稳定期慢阻肺的中药颗粒剂，其特征在于：按重量份数计包括如下原料药材：党参200份，熟地黄200份，当归200份，山萸肉200份，蜜麻黄100-120份，黄芩160-200份，陈皮100份，蜜紫菀180-200份，赤芍200份，甘草40-80份，并包括如下重量份数的辅料：乳糖25-69份，淀粉12-35份，麦芽糊精12-35份，聚维酮k303-10份。
上述中药颗粒剂，进一步地，包括如下重量份数的原料：党参200份，熟地黄200份，当归200份，山萸肉200份，蜜麻黄100份，黄芩176份，陈皮100份，蜜紫菀200份，赤芍200份，甘草76份，并包括如下重量份数的辅料：乳糖25-45份，淀粉12-23份，麦芽糊精12-23份，聚维酮k303-8份。
一种制备本发明中药颗粒剂的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
(1)除黄芩外，将其他药材置提取设备内，加8-10倍量水加热。
(2)待温度达到80-100℃，投入黄芩，回流提取1-2小时，过滤得第一滤液。
(3)药渣加8-10倍量水回流提取1-2小时，过滤得第二滤液。
(4)药渣加8-10倍量水回流提取1-2小时，过滤得第三滤液。
(5)合并上述滤液，浓缩滤液，进一步浓缩至相对密度为1.20-1.30(60℃)，减压干燥，粉碎，过筛后得中药提取细粉。
(6)中药提取细粉与适量辅料混合均匀，采用沸腾制粒机喷入粘合剂溶液，制成颗粒。
上述中药颗粒剂的制备方法，进一步地，该方法包括如下步骤：
(1)除黄芩外，将其他药材置提取设备内，加8倍量水加热。
(2)待温度达到80℃，投入黄芩，回流提取1小时，过滤得第一滤液。
(3)药渣加8倍量水回流提取1小时，过滤得第二滤液。
(4)药渣加8倍量水回流提取1小时，过滤得第三滤液。
(5)合并上述滤液，浓缩滤液，进一步浓缩至相对密度为1.25-1.30(60℃)，减压干燥，粉碎，过筛后得中药提取细粉。
(6)中药提取细粉与适量辅料混合均匀，采用沸腾制粒机喷入粘合剂溶液，制成颗粒。
上述中药颗粒剂用于治疗慢性阻塞性肺疾病稳定期，适用于咳嗽，喘息，气短、动则加重，乏力，易感冒；慢性阻塞性肺疾病稳定期见上述证候者。也适用于慢性阻塞性肺疾病稳定期见上述证候兼具糖尿病患者。
经动物实验研究表明，本发明所提供的一种用于治疗慢性阻塞性肺疾病稳定期的中药颗粒剂，在宣肺平喘、消痰止咳、清热解毒等方面效果显著，优于目前常用药。
本发明颗粒剂动物实验采用了慢阻肺大鼠模型，目前对于慢阻肺的发病机制，多认为其发生发展与肺部对有害颗粒和气体所产生的炎症反应有关。吸烟和反复不断的气道感染是慢阻肺发生发展的主要原因。本实验采用气道内滴入香烟烟雾提取物(ces)和脂多糖(lps)方法建立慢阻肺的大鼠模型，是符合慢阻肺发生发展的病理生理状况的，其研究结果是具有代表性的。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明所述的补肺颗粒对copd大鼠气道阻力的影响折线图；
图2为本发明所述的补肺颗粒对copd大鼠肺动态顺应性的影响折线图。
具体实施方式
上文已从一般方面概述了本发明，下面将结合实施例进一步详细描述本发明。
需要说明的是，除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
本发明中使用的术语“党参(codonopsisradix)”为桔梗科植物党参codonopsispilosμla(franch.)nannf.、素花党参codonopsispilosμlanannf.var.modesta(nannf.)l.t.shen或川党参codonopsistangshenoliv.的干燥根。秋季采挖，洗净，晒干。应符合现行版《中国药典》“党参”项下的质量要求。
本发明中使用的术语“熟地黄(rehmanniaeradixpraeparata)”为生地黄的炮制加工品。取生地黄，照《中国药典》蒸法蒸至黑润，取出，晒至约八成干时，切厚片或块，干燥，即得。应符合现行版《中国药典》“熟地黄”项下的质量要求。
本发明中使用的术语“山茱萸(cornifructus)”为山茱萸科植物山茱萸cornμsofficinalissieb.etzucc.的干燥成熟果肉。秋末冬初果皮变红时采收果实，用文火烘或置沸水中略烫后，及时除去果核，干燥。山萸肉为山茱萸除去杂质和残留果核的炮制加工品。应符合现行版《中国药典》“山萸肉”项下的质量要求。
本发明中使用的术语“麻黄(ephedraeherba)”为麻黄科植物草麻黄ephedrasinicastapf、中麻黄ephedraintermediaschrenketc.a.mey.或木贼麻黄ephedraequisetinabge.的干燥草质茎。秋季采割绿色的草质茎，晒干。蜜麻黄为麻黄的炮制加工品。取麻黄段，照蜜炙法(《中华人民共和国药典》2010年版一部附录ⅱd)炒至不粘手。每100kg麻黄，用炼蜜20kg。本品形如麻黄段。表面深黄色，微有光泽，略具黏性。有蜜香气，味甜。应符合现行版《中国药典》“蜜麻黄”项下的质量要求。
本发明中使用的术语“当归(angelicaesinensisradix)”为伞形科植物当归angelicasinensis(oliv.)diels的干燥根。秋末采挖，除去须根和泥沙，待水分稍蒸发后，捆成小把，上棚，用烟火慢慢熏干。应符合现行版《中国药典》“当归”项下的质量要求。
本发明中使用的术语“赤芍(paeoniaeradixrubra)”为毛莨科植物芍药paeonialactiflorapall.或川赤芍paeoniaveitchiilynch的干燥根。春、秋二季采挖，除去根茎、须根及泥沙，晒干。应符合现行版《中国药典》“赤芍”项下的质量要求。
本发明中使用的术语“黄芩(scutellariaeradix)”为唇形科植物黄芩scutellariabaicalensisgeorgi的干燥根。春、秋二季采挖，除去须根和泥沙，晒后撞去粗皮，晒干。应符合现行版《中国药典》“黄芩”项下的质量要求。
本发明中使用的术语“陈皮(citrireticulataepericarpium)”为芸香科植物橘citrusreticulatablanco及其栽培变种的干燥成熟果皮。药材分为“陈皮”和“广陈皮”。采摘成熟果实，剥取果皮，晒干或低温干燥。应符合现行版《中国药典》“陈皮”项下的质量要求。
本发明中使用的术语“紫菀(radixetrhizomaasteris)”为菊科植物紫菀astertataricusl.f.的干燥根及根茎。春、秋二季采挖，除去有节的根茎(习称“母根”)和泥沙，编成辫状晒干，或直接晒干。蜜紫菀为紫菀的炮制加工品。取紫菀片(段)，照蜜炙法(《中国药典》2010年版一部附录ⅱd)炒至不粘手。形如紫菀片(段)，表面棕褐色或紫棕色。有蜜香气，味甜。应符合现行版《中国药典》“蜜紫菀”项下的质量要求。
本发明中使用的术语“甘草(glycyrrhizaeradixetrhizoma)”本品为豆科植物甘草glycyrrhizauralensisfisch.、胀果甘草glycyrrhizainflatabat.或光果甘草glycyrrhizaglabral.的干燥根和根茎。春，秋二季采挖，除去须根，晒干。应符合现行版《中国药典》“甘草”项下的质量要求。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明：
实施例1
本发明中药颗粒剂的制备：
配方组成：
党参20kg、熟地黄20kg、山萸肉20kg、蜜麻黄10kg、当归20kg、赤芍20kg、黄芩17.6kg、陈皮10kg、蜜紫菀20kg、甘草7.6kg，以上十味，除去黄芩，其他九味药置提取设备内，加8倍量水加热至80℃，投入黄芩，回流提取1小时，过滤得第一提取液，药渣加8倍量水回流提取1小时，过滤得第二提取液，药渣加8倍量水回流提取1小时，过滤得第三提取液，合并三次提取液，减压浓缩至密度为1.25-1.30(60℃)，减压干燥粉碎过筛后得到中药提取细粉，加入乳糖36kg、淀粉18kg、麦芽糊精18kg，充分混合均匀，用聚维酮k304kg配置粘合剂，采用沸腾制粒机制成颗粒并干燥，即本发明的中药颗粒剂。
实施例2
本发明中药颗粒剂的制备：
配方组成：
党参20kg、熟地黄20kg、山萸肉20kg、蜜麻黄11kg、当归20kg、赤芍20kg、黄芩19kg、陈皮10kg、蜜紫菀19kg、甘草6.2kg，以上十味，除去黄芩，其他九味药置提取设备内，加10倍量水加热至80℃，投入黄芩，回流提取2小时，过滤得第一提取液，药渣加10倍量水回流提取2小时，过滤得第二提取液，药渣加10倍量水回流提取2小时，过滤得第三提取液，合并三次提取液，减压浓缩至密度为1.20-1.30(60℃)，减压干燥粉碎过筛后得到中药提取细粉，加入乳糖25kg、淀粉23kg、麦芽糊精12kg，充分混合均匀，用聚维酮k308kg配置粘合剂，采用沸腾制粒机制成颗粒并干燥，即本发明的中药颗粒剂。
实施例3
本发明中药颗粒剂的制备：
配方组成：
党参20kg、熟地黄20kg、山萸肉20kg、蜜麻黄12kg、当归20kg、赤芍20kg、黄芩20kg、陈皮10kg、蜜紫菀18kg、甘草5.2kg，以上十味，除去黄芩，其他九味药置提取设备内，加8倍量水加热至80℃，投入黄芩，回流提取1小时，过滤得第一提取液，药渣加8倍量水回流提取1小时，过滤得第二提取液，药渣加8倍量水回流提取1小时，过滤得第三提取液，合并三次提取液，减压浓缩至密度为1.25-1.30(60℃)，减压干燥粉碎过筛后得到中药提取细粉，加入乳糖45kg、淀粉12kg、麦芽糊精23kg，充分混合均匀，用聚维酮k303kg配置粘合剂，采用沸腾制粒机制成颗粒并干燥，即本发明的中药颗粒剂。
实施例4本发明中药颗粒剂中黄芩苷的含量测定方法
采用如下条件的hplc方法测定了本发明颗粒剂中黄芩苷的含量
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-甲酸(49:51:0.1)为流动相；检测波长为280nm；柱温30℃。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于5000。
对照品溶液的制备：取黄芩苷对照品适量，精密称定，加50％乙醇制成每1ml中含50μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取本品，研细，混匀，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50％乙醇50ml，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液5μl、供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品每袋含黄芩以黄芩苷(c21h18o11)计，不得少于67.2mg。
实施例5.本发明中药颗粒剂中马钱苷的含量测定方法
采用如下条件的hplc方法测定了本发明颗粒剂中马钱苷的含量
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-甲醇-水-甲酸(10:1:89:0.1)为流动相；检测波长为236nm；柱温30℃。理论板数按马钱苷峰计算应不低于8000。
对照品溶液的制备：取马钱苷对照品适量，精密称定，加水制成每1ml中含10μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取本品，研细，混匀，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加水50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品每袋含山萸肉以马钱苷(c17h26o10)计，不得少于5.76mg。
实施例6.本发明中药颗粒的中药材提取方法对提取物组成的影响
为确定本发明的中药颗粒中的中药材提取方法对提取物成分的含量的影响，发明人开展了如下实验研究。
研究方法：用以下五种方法进行样品制备：(1)全方165g药材加1320ml70％乙醇回流提取1h；(2)全方165g药材加入1320ml水回流提取1h；(3)除黄芩外九味药材加入1320ml水，加热至60℃投入黄芩，回流提取1h；(4)除黄芩外九味药材加入1320ml水，加热至80℃投入黄芩，回流提取1h；(5)除黄芩外九味药材加入1320ml水，加热至100℃投入黄芩，回流提取1h。样品制备结束后进行分析测黄芩苷的含量。
实验结果：如表1所示，黄芩的投料方式对有效成分黄芩苷有显著影响，80℃投料黄芩苷的含量最高，因此在本发明的提取工艺中，采用黄芩80℃投料方式。
表1.黄芩不同投料方式对有效成分的含量影响
实施例7.本发明的中药颗粒剂药效学试验研究结果
(一)实验材料
1.受试药
本发明中药颗粒(代号：zj060)，批号201102，含量2.83g生药/g粉，由天津中新药业研究中心提供。
2.对照药
根据不同试验选择了不同的阳性药物
醋酸地塞米松片：浙江仙琚制药股份有限公司，批号：110562。
止咳糖浆：批号20120227，天津医科大学总医院。
硫酸特布他林片：批号0904056，阿斯利康制药有限公司。
鲜竹沥：批号110809，四川省通园制药有限公司。
吲哚美辛：批号101206，厦门中药厂有限公司提供。
3.试剂
香烟：marlboro，usa。软红，焦油量：12mg、烟碱量：0.9mg；
脂多糖(lps，esherichiacolio111：b4)，美国sigma公司；
mch(methacholinechloride，氯化乙酰甲胆碱)，东京化成工业株式会社；
大鼠tnf-αelisa试剂盒，批号1111281，上海西唐生物科技有限公司；
大鼠il-8elisa试剂盒，批号1112182，上海西唐生物科技有限公司；
大鼠timp-1elisa试剂盒，批号1112052，上海西唐生物科技有限公司；
大鼠mmp-9elisa试剂盒，批号1111261，上海西唐生物科技有限公司；
mpo(髓过氧化物酶)测试盒，批号20111220，南京建成生物工程研究所；
兔来源的mmp-9多克隆抗体：美国abcam公司，ab76003；抗兔免疫组化检测试剂盒：基因科技上海有限公司。
4.仪器
酶标仪：bio-radxmark全波长酶标仪、奥地利日升公司生产；
olympusbx51/bx52系统显微镜(日本olympus公司)；
蔡氏切片机，德国microm公司；
zmn-6802型病理组织漂烘处理仪；
光学显微镜：bx51型，ch21型，olympus公司，日本；
medlab-u/4c501h生物信号采集处理系统，南京美易公司；
呼吸流量换能器：hx200，北京新航兴业科贸有限公司；
百瑞压缩雾化吸入机：pariboyn085，德国百瑞有限公司。
yls-8a多功能诱咳引喘仪：济南益延科技发展有限公司。
g>2000型电子天平，美国双杰兄弟(集团)有限公司。
pl203型电子天平，d＝0.001g，max＝210g，梅特勒托利多仪器(上海)有限公司生产。
mls-3750高压锅，日本三洋电子有限公司。
5.实验动物
5.1大鼠(慢性阻塞性肺疾病试验)
种属：sd大鼠，体重范围：♀146.3±6.6g，♂150.4±6.1g，动物数量：210只，性别：雌雄各半，级别：清洁级(gradeii)。
5.2小鼠(腹腔毛细血管通透性试验)
种属：km种小鼠，体重范围：18－20g，动物数量：120只，性别：雄性，级别：spf级。
5.3大鼠(棉球肉芽肿试验)
种属：sd种大鼠，体重范围：180－200g，动物数量：60只，性别：雄性，级别：spf级。
5.4大鼠(优球蛋白溶解时间试验)
种属：sd种大鼠，体重范围：180－200g，动物数量：50只，性别：雌雄各半，级别：spf级。
5.5小鼠(止咳作用)
种属：km种小鼠，体重范围：18－20g，动物数量：50只，性别：雌雄各半，级别：spf级。
5.6豚鼠(平喘作用)
种属：hartley种豚鼠。体重范围：150－200g，动物数量：50只，性别：雌雄各半，级别：spf级。
所有动物饲养及实验均按《实验动物饲养及使用指南》(浙江大学实验动物中心、天津市新药安全评价研究中心)进行。
6.给药途径、方法、剂量、频率和用药期限以及选择理由
给药途径：灌胃给药(ig)
给药途径选择理由：本供试品临床给药途径为口服，为保持和临床给药途径一致，采用灌胃给药方式进行研究。
给药体积：小鼠20ml/kg、大鼠10ml/kg。
剂量设计及理由：该药临床用量为33g生药/人/天，人体重以70kg计算，按体表面积折算小鼠(20g计)等效剂量为5.54g生药/kg；大鼠(200g计)等效剂量为2.76g生药/kg，同时根据预实验结果，慢性阻塞性肺疾病试验剂量设计为16.3、5.4、1.8g生药/kg，其余试验设计剂量为：12、4、1.33g生药/kg。
7.数据处理：
采用spss13.0forwindows进行统计学分析，计量资料以
(二)试验方法及结果
1、本发明中药颗粒对香烟烟雾提取物(cse)和脂多糖(lps)诱导的大鼠慢阻肺的治疗作用研究
《慢性阻塞性肺疾病诊断、处理和预防全球策略(2011年修订版)》对慢阻肺的新定义是：慢性阻塞性肺疾病是一种可以预防和可以治疗的常见疾病，其特征是持续存在的气流受限。气流受限呈进行性发展，伴有气道和肺对有害颗粒或气体所致慢性炎症反应的增加。本研究为了观察本发明中药颗粒对慢阻肺的治疗作用，建立了由香烟烟雾提取物(cse)和脂多糖(lps)气道内滴入引起的大鼠慢阻肺模型，观察了本发明中药颗粒对慢阻肺大鼠气道肺部炎症反应、气道粘液高分泌、肺气肿和肺功能的影响。
1.1动物模型制备
1.1.1取大鼠210只。♀♂各半，体重♀146.3±6.6g，♂150.4±6.1g。
1.1.2模型的制备：
(1)香烟烟雾提取物制备方法：
香烟烟雾提取物的提取方法：取万宝路香烟去掉过滤嘴，插入叼烟器，点燃香烟，通过三个负压瓶，经真空泵负压抽滤器吸烟。吸取的烟雾通到三个含25ml生理盐水的100ml瓶中，连续吸烟20-15支，吸烟完成后合并三瓶生理盐水溶液75ml，用0.8μm滤纸过滤，称为香烟烟雾提取物(cse)，呈橙色-褐棕色。
(2)造模：
香烟烟雾提取物(cse)：用量分二个阶段：第1个月20支/75ml，即3.75ml/支。第2个月起至最后结束15支/75ml，即5ml/支。
脂多糖(lps)：用生理盐水配制成1mg·ml-1溶液。
气管滴入cse和lps：模型组及各给药组大鼠，用耳镜插入大鼠喉口，以静脉套管针向气管内滴入cse200μl或lps200μl，每滴2次cse滴1次lps，依此循环，每周滴注2次，持续12周。12周时取雌雄各3只，做病理检测，确定模型形成后开始给药，给药4周。留正常对照组备用。
1.1.3三个月模型病理检测结果
造模12周时取雌雄各3只，做病理检测。目的是检测造模3个月时是否有肺气肿形成，以判断慢阻肺的形成情况。
造模3个月慢阻肺大鼠肺泡结构改变
3个月模型检测结果：模型组病理炎症明显，肺泡数减少，说明有肺气肿形成。
1.1.4三个月模型体重和动物数
造模3个月时，大鼠体重♀308.0±25.5g，♂504.6±37.3g；造模期间大鼠死亡11只，死亡率5.23％；给药大鼠数♂95只♀97只，分成5组(不含正常对照组)。
1.2动物分组及给药
1.2.1动物分组
大鼠分为6组：①正常对照组；②模型组；③本发明中药颗粒16.3g·kg-1组为高剂量组；④本发明中药颗粒5.4g·kg-1组为中剂量组；⑤本发明中药颗粒1.8g·kg-1组为低剂量组；⑥地塞米松(dxm)0.1mg·kg-1组。
1.2.2给药
本发明中药颗粒各给药组及地塞米松组大鼠给予相应剂量药物灌胃治疗，正常对照组及模型组给予生理盐水灌胃，每日1次，连续4周。
1.3指标测定
1.3.1大鼠肺功能测定
大鼠用乌拉坦麻醉，行气管插管，处仰卧位，用已连接水检压计和换能器的钝针头于胸廓右外侧第4-5肋间、沿肋骨上缘刺入胸膜腔，连接胸导管。可见导管连接的水检压计水柱随动物呼吸运动而上下波动，并通过差压换能器测定胸内压与气道内压的压力差，即跨肺压，以记录跨肺压的变化。将动物置于密闭的自制身体容积描记器内，并通过气管插管引伸于体积描记箱外。体积描记箱留有侧孔，并接上压力换能器，所有待测管道接通完毕，最后盖上体积描记器的盖子，并使其完全密闭即可描记随动物呼吸而引起密闭体积描记箱内容积的变化，即为潮气量。通出体积描记箱外的气管插管接一t型管，t型管一端内置有数根毛细管通气，动物自主呼吸时造成气管内与外界大气压之间压力差，另一端接换能器测定气道内压的变化，通过压力换能器即可记录流速。潮气量、跨肺压、气道流速均通过换能器输入计算机，麻醉大鼠稳定5min后，用medlab生物信号采集处理系统记录仪，导出基础潮气量(vt)、气道流速
计算公式：
1.3.2支气管肺泡灌洗液细胞计数
股动脉放血处死大鼠，分离气管及主支气管，在近气管分叉处结扎左侧主支气管，然后进行气管插管，用10ml生理盐水进行支气管肺泡灌洗，灌洗分2次进行，回收支气管肺泡灌洗液(balf)。balf4℃，1000r·min-1离心10min，沉淀用ns0.5ml混匀，取细胞混悬液进行细胞计数。
1.3.3肺组织病理学检查
取未灌洗的左肺组织经4％甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，切片，行苏木精-伊红染色(he)和阿尔辛蓝-过碘酸雪夫染色(ab-pas),并测定以下指标：
1.3.3.1肺泡平均直径
肺平均内衬间隔(lm)是计数通过显微镜视野中央“十”字交叉线的肺间隔数(ns)，测出十字线的总长度(l)，以l/ns即得lm，其数值反映肺泡平均直径。测量时避开支气管及血管。每张切片测8个视野，求平均值。
1.3.3.2平均肺泡数(man)
计数每个视野内的肺泡数，除此视野的面积，即得man，其数值反应肺泡密度。测量时避开支气管及血管。每张切片测8个视野，求平均值。
1.3.3.3肺组织炎症程度：
he染色切片中，根据炎症和上皮脱落程度将炎症分为“-、 、 、 ”四级。“-”即未见明显炎症细胞浸润；“ ”主支气管周围有不等量的炎症细胞浸润，炎症细胞以淋巴细胞、中性粒细胞为主，也有少量的单核细胞及嗜酸性粒细胞。各级细支气管周围有少量或无炎症细胞浸润，支气管腔内无脓细胞；“ ”主支气管及各级细支气管周围均有大量淋巴细胞、中性粒细胞浸润，也有不等量的单核细胞及嗜酸性粒细胞浸润。部分细支气管腔内充满脓细胞。“ ”界于“ ”和“ ”之间。
1.3.4肺组织匀浆tnf-α、il-1β、timp-1、mmp-9、muc5ac含量测定
肺组织匀浆：取肺组织制成10﹪匀浆，4℃3000r·min-1离心10min取上清，于-20℃保存以做elisa用。
采用双抗体夹心酶联免疫吸附法，严格按照elisa试剂盒说明书进行。
1.3.5肺组织匀浆mpo测定
按试剂盒说明书的方法制备组织匀浆及操作，460nm比色，测定吸光度。按照以下公式计算mpo活力：
mpo单位/克湿片(u·g-1)＝(测定管od值-对照管od值)/11.3×取样量(g)
1.3.6肺组织mmp-9表达
肺组织mmp-9的免疫组化染色：取左肺组织固定于4％甲醛中12-24h，常规石蜡包埋、切片。mmp-9的免疫组化操作步骤按说明书进行。
免疫组织化学照片：肺组织中mmp-9主要表达于单核巨噬细胞,中性粒细胞，气道上皮细胞和ⅱ型肺泡上皮细胞等，mmp-9阳性表达为细胞浆内出现棕黄色或黄色颗粒。
1.4本发明中药颗粒对慢阻肺大鼠肺功能气道阻力(raw)和肺动态顺应性(cdyn)的影响
模型组大鼠的基础raw和cdyn值与正常对照组比较无差异，本发明中药颗粒各组与模型组比较亦无差异。说明正常对照组和慢阻肺大鼠肺功能raw和cdyn基础值是相近的，本发明中药颗粒对肺功能raw和cdyn基础值没有影响。
慢阻肺大鼠气道对mch的敏感性观察：在mch0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16、32、64mg·ml-1浓度分别雾化吸入后，表1和表2可见：
①无论正常对照组、模型组和本发明中药颗粒各组用mch雾化后大鼠raw增高，而cdyn降低。表现为raw随mch剂量增大反应增高，cdyn随mch剂量增大反应降低。
②慢阻肺模型组大鼠raw与正常对照组比较，无显著性差异，本发明中药颗粒高剂量组、中剂量组和低剂量组与模型组比较，也无显著性差异(表1和图1)，说明慢阻肺大鼠的肺功能raw值改变不明显，本发明中药颗粒对肺功能raw值也没有影响。
③慢阻肺大鼠模型组cdyn与正常对照组比较，在mch2mg·ml-1开始至mch64mg·ml-1cdyn值有显著降低，本发明中药颗粒高剂量组和中剂量组与模型组比较明显改善肺功能cdyn值，使大鼠cdyn值升高(表2和图2)，说明慢阻肺大鼠的肺功能cdyn值发生了改变，本发明中药颗粒可改善肺功能cdyn值。
④raw值代表大气道的活动，cdyn值代表小气道的活动，这表明本发明中药颗粒对慢阻肺大鼠肺功能小气道气流受限有一定的改善作用。
表1本发明中药颗粒对慢阻肺大鼠肺功能气道阻力的影响
表2本发明中药颗粒对慢阻肺大鼠肺功能动态肺顺应性的影响
与正常对照组比较：#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001；与模型组比较：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001
1.5本发明中药颗粒对慢阻肺大鼠气道和肺部炎症的影响
1.5.1本发明中药颗粒对慢阻肺大鼠支气管肺泡灌洗液中白细胞总数的影响
模型组支气管肺泡灌洗液(balf)中白细胞总数较正常对照组明显增多，本发明中药颗粒组与模型组比较balf中白细胞总数减少，本发明中药颗粒高剂量组与模型组比较有显著性差异，说明本发明中药颗粒对慢阻肺大鼠的气道内炎症细胞的浸润有抑制作用(表3)。
表3本发明中药颗粒对慢阻肺大鼠balf中白细胞总数的影响
与正常对照组比较：#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001；与模型组比较：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001
1.5.2本发明中药颗粒对慢阻肺大鼠肺组织病理学炎症的影响
光镜下可见模型组大鼠肺病理炎症细胞明显浸润，炎症以支气管周围及血管周围为主，炎症细胞包括淋巴细胞和中性粒细胞等。模型组肺组织病理炎症程度比正常对照组严重。本发明中药颗粒组炎症细胞浸润减少，肺组织病理炎症程度明显减轻(表4)，本发明中药颗粒高剂量组可明显减轻慢阻肺大鼠肺部病理炎症反应(p<0.05)。
表4.本发明中药颗粒对慢阻肺大鼠肺组织病理炎症的影响
与正常对照组比较#p＜0.05，##p<0.01；与模型组比较*p＜0.05
(u检验：若u<1.96，则p>0.05；若1.96<u<2.58，则p<0.05；若u>2.58，则p<0.01)
实验结果：正常对照组：正常肺组织无炎症、无肺泡扩张；
模型组：支气管上皮明显脱落，肺部炎症细胞大量浸润，有明显细支气管炎，肺间质炎；
本发明中药颗粒组：细支气管炎和肺间质炎减轻，炎症细胞浸润减少；
dxm组：炎症较轻。
1.5.3本发明中药颗粒对慢阻肺大鼠肺组织炎症细胞因子tnf-α、il-8含量的影响
模型组大鼠肺组织匀浆中tnf-α和il-8含量比正常对照组明显增高；本发明中药颗粒各组较模型组均明显降低，表明本发明中药颗粒有抑制慢阻肺大鼠肺组织炎症细胞因子tnf-α和il-8升高的作用(表5)。
表5.本发明中药颗粒对慢阻肺大鼠肺组织中tnf-α和il-1β表达的影响
与正常对照组比较：#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001；与模型组比较：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001
1.5.4本发明中药颗粒对慢阻肺大鼠肺组织mpo含量的影响
模型组大鼠肺组织匀浆中髓过氧化物酶(mpo)含量比正常对照组明显增多，本发明中药颗粒高剂量组与模型组比较明显减少(表6)，mpo是中性粒细胞活性的标志物，mpo活性的测定均可代表细胞浸润情况，因此，表明本发明中药颗粒高剂量组有抑制炎症作用。
表6本发明中药颗粒对慢阻肺大鼠肺组织mpo含量的影响
与正常对照组比较：#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001；与模型组比较：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001
1.6本发明中药颗粒对慢阻肺大鼠气道粘液高分泌的影响
1.6.1本发明中药颗粒对慢阻肺大鼠支气管杯状细胞化生的影响
ab-pas染色观察：正常对照组大鼠支气管杯状细胞间隔分布，细支气管未见明显的杯状细胞分布或分布甚少；模型组与正常对照组相比，支气管、细支气管杯状细胞化生明显。本发明中药颗粒组较模型组阳性杯状细胞明显减少，提示本发明中药颗粒对慢阻肺大鼠杯状细胞化生有抑制作用。
实验结果：对照组：无阳性杯状细胞；
模型组：杯状细胞化生明显；
本发明中药颗粒组：杯状细胞化生减轻；
dxm组：杯状细胞化生减轻。
1.6.2本发明中药颗粒对慢阻肺大鼠肺组织粘蛋白5ac含量的影响
模型组肺组织中粘蛋白5ac(muc5ac)含量比正常对照组明显增高，本发明中药颗粒高剂量组较模型组降低，表明本发明中药颗粒可降低慢阻肺大鼠肺组织muc5ac的含量(表7)。
表7本发明中药颗粒对慢阻肺大鼠肺组织中muc5ac含量的影响
与正常对照组比较：#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001；与模型组比较：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001
1.7本发明中药颗粒对慢阻肺大鼠肺气肿的影响
1.7.1本发明中药颗粒对慢阻肺大鼠肺泡结构改变的影响
光镜下可见正常对照组肺泡未见扩张，结构正常；模型组大鼠肺泡大小不等，肺泡结构紊乱，肺泡管、肺泡囊和肺泡明显扩张，肺泡壁变薄，并有不同程度的撕裂，融合成肺大泡，与正常对照组比较，lm(肺平均内衬间隔，反映肺泡平均直径)明显增大，man(平均肺泡数)明显减少；本发明中药颗粒组与模型组比较均能使lm明显减小，man显著增多，肺泡破坏减少(表8)。可见，本发明中药颗粒能减少慢阻肺大鼠肺泡破坏，具有一定的肺泡保护作用。
表8本发明中药颗粒对慢阻肺大鼠肺泡结构改变的影响
与正常对照组比较：#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001；与模型组比较：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001
实验结果：正常对照组：正常肺组织无肺泡扩张；
模型组：肺泡大小不等，肺泡结构紊乱，肺泡管、肺泡囊和肺泡明显扩张，肺泡壁变薄，并有不同程度的撕裂，融合成肺大泡；
本发明中药颗粒组：肺泡破坏减少；
dxm组：肺泡破坏减少。
1.7.2本发明中药颗粒对慢阻肺大鼠肺组织mmp-9和timp-1含量的影响
模型组肺组织中mmp-9和timp-1含量比正常对照组明显增高，说明慢阻肺大鼠模型组mmp-9的含量增高，其天然抑制物timp-1的含量也有增高。本发明中药颗粒高剂量组肺组织中mmp-9和timp-1含量比模型组明显降低(表9)，可见本发明中药颗粒降低了mmp-9的含量，随着mmp-9含量的降低，其抑制物timp-1的含量也降低了，这表明本发明中药颗粒不仅能显著降低肺组织mmp-9的含量增高，还降低了timp-1的含量，提示本发明中药颗粒对慢阻肺大鼠肺组织mmp-9和timp-1的升高有抑制作用。
表9本发明中药颗粒对慢阻肺大鼠肺组织中timp-1和mmp-9含量的影响
与正常对照组比较：#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001；与模型组比较：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001
1.7.3本发明中药颗粒对慢阻肺大鼠肺组织mmp-9免疫组化的影响
mmp-9免疫组化的光镜下观察，支气管上皮细胞在各组间均有表达；对照组肺泡组织中可见少量mmp-9表达，模型组mmp-9表达增多，炎症细胞如巨噬细胞、中性粒细胞强阳性表达呈棕黄色，肺泡上皮细胞呈弱阳性表达呈黄色，本发明中药颗粒组mmp-9表达较模型组弱。说明慢阻肺大鼠肺组织mmp-9有高表达；本发明中药颗粒对慢阻肺大鼠肺组织mmp-9的高表达有抑制作用。
实验结果：支气管上皮细胞在各组间均有表达：
正常对照组肺泡组织中可见少量mmp-9表达；
模型组mmp-9表达增多，炎症细胞如巨噬细胞、中性粒细胞强阳性表达呈棕黄色，肺泡上皮细胞呈弱阳性表达呈黄色；
本发明中药颗粒组mmp-9表达较模型组弱；
dxm组mmp-9表达较模型组弱。
1.8讨论与总结
1.8.1关于慢阻肺大鼠模型
目前对慢阻肺的发病机制尚不完全清楚，认为其发生发展多与肺部对有害颗粒和气体所产生的炎症反应有关。吸烟和反复不断的气道感染是慢阻肺发生发展的主要原因。吸烟引起慢阻肺的机制是由于烟草中的有害物质引起肺部炎症和肺组织破坏，并损害肺正常的防御和修复机制，导致组织破坏进一步加重，不能进行正常修复。肺组织的损害包括粘液高分泌、气道狭窄及纤维化、肺实质破坏(肺气肿)、血管系统改变等。这些病理学改变反过来又可以导致气流受限和其他病理生理学改变。
本实验采用气道内滴入cse和lps方法建立慢阻肺的大鼠模型，符合慢阻肺发生发展的病理生理状况。香烟烟雾提取物中含有焦油和尼古丁。焦油是卷烟烟气中主要有害成分。尼古丁(烟碱)是一种液态生物碱，与空气接触氧化后转变为棕褐色，并散发烟草所具有的特殊气味，它也是烟草中的主要毒性物质，在吸烟引起的许多疾病中起到了重要作用。研究发现，尼古丁对小鼠的半数致死量(ld50)为54.42mg/kg，是烟焦油的ld50的十倍。脂多糖(lps)是一种细菌内毒素，在环境中普遍存在，它可刺激单核巨噬细胞、上皮细胞及中性粒细胞等合成释放一系列前炎症因子和炎症因子，如：肿瘤坏死因子a(tnf-a)、白细胞介素8(il-8)等，介导气道和肺组织的炎症反应，lps能促进很多导致肺气肿改变的病理学机制，如氧化应激，蛋白酶与抗蛋白酶失衡及凋亡等。本实验用cse和lps造模4个月，形成了以肺功能cdyn值改变的小气道气流受限、肺部炎症反应、气道粘液高分泌和肺气肿，符合慢阻肺的肺气肿和气流受限的改变。
1.8.2肺功能
动物肺功能的测定对确定模型是否出现气流受限具有重要的意义。气道阻力(raw)主要指气体通过呼吸道遇到的摩擦阻力，反映大气道的活动。气道阻力在一特定的时间里等于跨肺压(p)对气道流速(v)的比率，支气管收缩时，气道阻力就增大。肺动态顺应性(dynamiccompliance，cdyn)，是测定肺的弹力阻力，反映小气道的活动。肺动态顺应性与呼吸频率的快慢有关，如肺气肿时，呼吸加快，肺动态顺应性就降低。当肺纤维化、肺不张、肺水肿、肺表面活性物质减少，或肺、气道任一部位阻塞时，也均可使肺顺应性降低，而气道阻力增加。本实验中我们通过测定大鼠基础raw及cdyn值后发现，模型组大鼠的基础raw值和cdyn值与正常对照组比较无差异，mch雾化吸入后，随着浓度增加气道阻力反应增高，但模型组与正常对照组比较，无显著性差异，本发明中药颗粒与模型组比较也无差异，说明肺功能raw无明显变化。慢阻肺大鼠模型组cdyn与正常对照组比较，在mch2mg·ml-1开始至mch64mg·ml-1cdyn值有显著降低，本发明中药颗粒高剂量组和中剂量组与模型组比较明显改善肺功能cdyn值，使大鼠cdyn值升高，说明慢阻肺大鼠的肺功能cdyn发生了改变，本发明中药颗粒可改善肺功能cdyn值，使cdyn值升高。cdyn值反应小气道的状况，cdyn值下降表明有肺气肿的变化，本发明中药颗粒使cdyn值升高，说明本发明中药颗粒减轻了肺气肿，对肺功能气流受限有一定的改善作用。
1.8.3气道和肺部炎症
参与慢阻肺气道炎症的细胞因子由气道炎症细胞产生，它们相互作用，构成细胞因子-炎症细胞网络，调节慢阻肺的气道炎症反应。与慢阻肺发病有关的主要细胞因子有白介素-6(il-6)、白介素-8(il-8)、白介素-32(il-32)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)。本研究选择il-8和tnf-α作为炎症细胞因子检测指标。il-8是单核/巨噬细胞、中性粒细胞等分泌的前炎症细胞因子，介导中性粒细胞浸润为主的各种炎症疾病，能趋化和(或)激活中性粒细胞等多种炎症细胞，释放各种炎症介质，如弹性蛋白酶、各种碱性蛋白、paf、lts等，加重炎性循环，造成组织损伤，引起气道壁增厚和管腔狭窄，导致气流阻塞。il－8的检测可作为判断慢阻肺病程的一个指标。tnf-α是由活化的单核巨噬细胞、肥大细胞及t淋巴细胞等多种炎症细胞产生的具有广泛生物活性的炎症细胞因子，可作为强有力的诱导剂使il-8合成和释放增加。在慢阻肺炎症反应中，它能诱导内皮细胞表达粘附分子，从而起到介导白细胞粘附于血管内皮细胞的作用。profita等发现慢阻肺患者气道上皮细胞及痰液中tnf-α水平升高，与气道阻塞程度呈正相关。这表明tnf-α是通过其本身致炎作用及活化其它炎性细胞因子的基因转录导致慢阻肺的炎症过程。tnf-α的持续存在可能是慢阻肺患者反复发作、恶化进展的原因之一。髓过氧化物酶(mpo)是中性粒细胞活性的标志物，白细胞计数和分类及mpo活性的测定均可代表细胞浸润情况。
本研究表明，由cse和lps引起的慢阻肺模型表现为支气管肺泡灌洗液中细胞数增多、肺病理炎症细胞浸润、肺组织细胞因子tnf-a和il-8含量升高，mpo升高，形成了明显的炎症反应。本发明中药颗粒用药4周后减少了支气管肺泡灌洗液中的细胞数、减轻了病理炎症细胞浸润、抑制了肺炎症细胞产生tnf-a和il-8以及mpo水平，这表明本发明中药颗粒有抑制慢阻肺大鼠支气管和肺部炎症作用。
1.8.4气道粘液高分泌
气道粘液高分泌和气道上皮及粘膜下腺的粘液分泌细胞的数量增多有关。在刺激作用下，粘膜下腺增生肥大，气道上皮杯状细胞化生，表现为其在大气道表面分布增多，在正常没有或极少有杯状细胞的小气道上也有出现或是数量明显增多。长期的粘液高分泌和肺功能的下降与慢性阻塞性肺病的发生有密切的关系。目前有一系列的证据表明，粘蛋白对杯状细胞化生、粘液高分泌和气道粘液堵塞等病理进展有着非常重要的决定性的作用。
气道粘液的一个重要组成部分是粘蛋白。muc5ac和muc5b是构成正常呼吸道分泌物的主要的糖蛋白。在本研究中，我们检测了大鼠肺组织muc5ac发现，由cse和lps引起的慢阻肺，其模型组的肺组织muc5ac含量明显增多，说明形成了气道粘液高分泌模型，ab-pas染色观察到模型组支气管、细支气管杯状细胞化生明显。本发明中药颗粒组较模型组muc5ac含量明显下降、阳性杯状细胞明显减少，muc5ac位于糖蛋白阳性杯状细胞和粘膜下腺粘液细胞，气道内cse和lps滴注能导致杯状细胞化生和muc5ac表达增高，本发明中药颗粒可减轻杯状细胞化生和降低muc5ac的含量，提示本发明中药颗粒对慢阻肺大鼠气道粘液高分泌有抑制作用。
1.8.5肺气肿
吸入有害气体、有害物质可以导致蛋白酶产生增多或活性增强，同时，氧化应激、吸烟等危险因素可以降低抗蛋白酶的活性，最终导致蛋白酶-抗蛋白酶失衡。有关蛋白酶-抗蛋白酶平衡中的蛋白酶主要有：中性粒细胞弹性蛋白酶(ne)，基质金属蛋白酶(mmps)；抗蛋白酶有α1-抗胰蛋白酶,基质金属蛋白酶组织抑制剂((timps)。本研究选择了基质金属蛋白酶mmp-9和基质金属蛋白酶组织抑制剂timp-1的检测来观察慢阻肺大鼠模型中mmp-9和timp-1的改变。在许多慢阻肺患者和肺气肿患者中发现mmp-9的表达水平及活性增高。mmp-9能降解气道和肺内的细胞外基质(ecm)和基底膜，直接和间接参与肺气肿的发生和发展。timp-1作为mmp-9的天然抑制剂能特异性抑制mmp-9的活性，二者是调节细胞外基质降解合成的主要酶类，正常情况下，mmp-9及timp-1处于平衡状态，一旦mmp-9过表达使得细胞外基质降解过度，则会引起肺结构破坏，组织重塑。本研究慢阻肺模型组肺组织mmp-9和timp-1含量均较正常对照组显著增强，说明慢阻肺大鼠模型组mmp-9的含量增高，其天然抑制物timp-1的含量也有增高。本发明中药颗粒高剂量组降低了mmp-9的含量，随着mmp-9含量的降低，其抑制物timp-1的含量也降低了，这表明本发明中药颗粒不仅能显著降低肺组织mmp-9的含量增高，还降低了timp-1的含量。病理组织学观察到本发明中药颗粒能减少肺泡破坏，说明对肺泡有保护作用。提示本发明中药颗粒对慢阻肺大鼠肺气肿改变的保护作用可能与其对mmp-9的抑制作用有关。
1.8.6关于阳性药
阳性药选择了地塞米松，由于中成药没有明确治疗慢阻肺的已上市的药物，西药目前治疗慢阻肺稳定期的有：支气管舒张剂如沙丁胺醇等、抗胆碱药如噻托溴铵等、氨茶碱等；糖皮质激素；其它如祛痰药等对症治疗。本发明中药颗粒是一中药复方，处方中有党参、麻黄、陈皮、甘草等10味中药组成，功能主治定为慢阻肺的稳定期，对本发明中药颗粒比较难选有西药治疗作用的明确指标，支气管舒张剂有良好的支气管舒张作用，本发明中药颗粒可能不如，所以选了糖皮质激素地塞米松作为阳性药，虽然选地塞米松为阳性药，但本发明中药颗粒与地塞米松还是难以做比较，因此，在本研究报告中没有对本发明中药颗粒治疗慢阻肺的效果与地塞米松比较，主要是报告了本发明中药颗粒治疗慢阻肺的药效和一些作用机制的分析。在本研究报告中也可看出地塞米松在大多数指标都是有效的。
1.9药效汇总和有效剂量
本发明中药颗粒治疗大鼠慢性阻塞性肺疾病的药效汇总：
-：表示无效；*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001：表示有效
本发明中药颗粒治疗大鼠慢阻肺药效学有12个检测指标，按照统计学有显著性差异的指标/总指标数计算有效％，求出ed50为4.5g·kg-1(3.701～5.355g·kg-1)。
本发明中药颗粒有效剂量：根据动物药效学有效剂量推算人用剂量，本发明中药颗粒对大鼠慢性阻塞性肺疾病治疗作用的有效剂量4.5g·kg-1，用等效剂量折算法计算临床用药预测剂量为人日服42g。
本发明中药颗粒的疗效：从本发明中药颗粒3个剂量组对12种指标的影响作用强度来看，除了慢阻肺大鼠支气管肺泡灌洗液中细胞总数这个指标的本发明中药颗粒高剂量组与模型组比较抑制细胞总数超过50％，其它指标中本发明中药颗粒各用药组与模型组比较抑制％(或增加％)均没有超过50％。所以，本发明中药颗粒对大鼠慢阻肺的治疗作用比较温和，但作用面比较广，具有抑制炎症反应、降低气道粘液高分泌、改善肺气肿和肺功能，适合用于慢阻肺稳定期的治疗，这也符合本发明中药颗粒的临床方案中本发明中药颗粒适用于慢性阻塞性肺疾病稳定期治疗的设想。
2、本发明中药颗粒的止咳、平喘作用研究
2.1止咳作用
试验选用经筛选合格的km种小鼠50只，体重20-22g，随机分为5组，每组10只，雌雄各半。按表11所示剂量ig给药，每天1次，连续7天，对照组给予同体积蒸馏水，阳性对照组试验当日给予止咳糖浆1次。于末次给药后40分钟，将每只动物分别置于喷雾装置内，浓度为12.5％的氨水用诱咳引喘仪匀速喷入5秒，仪器自动记录小鼠咳嗽潜伏期，并记数3分钟内咳嗽次数。将各组所得平均值与对照组平均值比较，进行统计学t检验。结果(见表11)显示，本发明中药颗粒高、中剂量组能够显著地延长小鼠咳嗽潜伏期，减少咳嗽次数。阳性对照药止咳糖浆止咳作用亦显著。
表11.本发明中药颗粒对小鼠的止咳作用
与对照组比较*p<0.05**p<0.01***p<0.001
2.2平喘作用
试验选用经筛选合格的豚鼠50只，体重180-200g，随机分为5组，每组10只，雌雄各半。按表12所示剂量口服给药，每天1次，连续7天，对照组给予同体积蒸馏水，阳性对照组试验当日给予硫酸特布他林1次。于末次给药后40分钟，将每只动物分别置于喷雾装置内，浓度为0.2％的磷酸组胺溶液用诱咳引喘仪匀速喷入18秒，仪器自动记录豚鼠引喘潜伏期。将各组所得平均值与对照组平均值比较，进行统计学t检验。结果(见表12)显示，本发明中药颗粒高、中、低剂量组能够非常显著地延长豚鼠引喘潜伏期，阳性对照药特布他林平喘作用亦显著。表明本发明中药颗粒具有明显的平喘作用。
表12.本发明中药颗粒对豚鼠的平喘作用
与对照组比较*p<0.05**p<0.01
3、本发明中药颗粒的抗炎作用研究
3.1对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响
试验选用km种小鼠，雄性，体重19-21g。随机分为5组，每组10只，按表13所示剂量ig给药，每天1次，连续3天，对照组给予同体积蒸馏水。于末次给药后40分钟，尾静脉注射伊文思兰溶液(1％)0.1ml/只，同时腹腔注射冰醋酸溶液(0.7％)0.2ml/只。20分钟后脱颈处死动物，用生理盐水冲洗腹腔，收集洗脱液，离心，上清液用酶标仪于波长580nm处比色，测定光密度(od值)，以各给药组平均od值与对照组平均od值相比较，进行统计学t检验。结果(见表13)显示，本发明中药颗粒高、中、低剂量组od值与对照组od值比较均显著降低，表明该药能显著抑制醋酸引起的小鼠毛细血管通透性增加，对急性渗出性炎症有显著的抗炎作用。阳性对照药作用亦显著。
表13本发明中药颗粒对小鼠毛细血管通透性的影响
与对照组比较*p<0.05***p<0.001
3.2对大鼠棉球肉芽肿的影响
选用sd种雄性大鼠50只，体重190－210g，随机分为5组，按表14每天灌胃给药1次，连续给药9天，对照组灌胃给予相同体积蒸馏水。于第2次给药后，在戊巴比妥钠麻醉下将大鼠背部剃毛、消毒、切开皮肤，把30mg灭菌棉球埋入两侧腋部皮下，再继续给药7天。末次给药后24小时，处死大鼠，剥出棉球肉芽肿物，去除外面附着的脂肪、结缔组织等物质，称湿重，然后在60-70℃烘干，恒重后称干重(湿、干称重均去除棉球重量)。结果(见表14)表明，本发明中药颗粒高、中、低剂量组对大鼠棉球肉芽肿有非常显著的抑制作用，表明其抗增生性慢性炎症作用显著。
表14本发明中药颗粒对大鼠棉球肉芽肿的影响
与对照组比较*p<0.05**p<0.01***p<0.001
4、本发明中药颗粒的体外抑菌作用研究
1、试验用菌种及来源：
2、金黄色葡萄球菌：标准株cmcc26003，绿脓杆菌：标准株gim1.220
3、乙型溶血性链球菌：标准株cmcc32210，肺炎链球菌，标准株cmcc31001，
4、流感嗜血杆菌：atcc49247
5、以上标准菌株均购自北京北纳创联生物技术研究院。
6、将冻存的以上金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、乙型溶血性链球菌3种细菌分别接种于血平皿中，培养后备用；肺炎链球菌和流感嗜血杆菌2种细菌分别接种于巧克力培养基平皿中，培养后备用。将本发明中药颗粒配制成药液，紫外灭菌，在无菌条件下均倍比稀释成系列浓度(实验浓度范围为283～0.55mg生药/ml)，混入0.3％琼脂液(含营养肉汤)中，每孔加100μl菌液和1ml(0.3％琼脂 药物)琼脂液，同时做空白对照。然后将金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、乙型溶血性链球菌各24孔板置于37℃温箱24小时后观察结果，肺炎链球菌和流感嗜血杆菌各24孔板置于37℃(含5％co2)温箱24小时后观察结果，无细菌生长的孔中的药物浓度为本发明中药颗粒对该菌的最低抑菌浓度。实验时各药物浓度设复孔。结果(见表15)显示，本发明中药颗粒对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、乙型溶血性链球菌、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌5种实验菌均有明显的体外抑菌作用，其最低抑菌浓度分别为：35.4mg生药/ml、17.7mg生药/ml、17.7mg生药/ml、35.4mg生药/ml、35.4mg生药/ml。
表15本发明中药颗粒对细菌的抑制作用
(三)试验结论
1、本发明中药颗粒对大鼠慢阻肺的治疗作用比较温和，但作用面比较广，具有改善肺功能、抑制炎症反应、降低气道粘液高分泌、改善肺气肿的作用，说明本发明中药颗粒对大鼠慢性阻塞性肺疾病有治疗作用。
2、止咳及平喘作用：本发明中药颗粒可显著地延长小鼠咳嗽潜伏期、减少咳嗽次数；显著地延长豚鼠引喘潜伏期，有显著的止咳平喘作用。
3、抗炎作用：本发明中药颗粒能显著抑制醋酸引起的小鼠毛细血管通透性增加和显著抑制大鼠棉球肉芽肿的生长，具有显著的抗急慢性炎症作用。
4、体外抑菌作用：本发明中药颗粒对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、乙型溶血性链球菌、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌5种实验菌均有明显的体外抑菌作用，其最低抑菌浓度分别为：35.4mg生药/ml、17.7mg生药/ml、17.7mg生药/ml、35.4mg生药/ml、35.4mg生药/ml，表明其对与呼吸道感染有关的细菌有一定抑制作用。
上述结果表明，本发明中药颗粒具有改善肺功能、抑制炎症反应、降低气道粘液高分泌、改善肺气肿的作用，同时具有明显的止咳、平喘作用，显著的抗急慢性炎症作用，并对与呼吸道感染有关的抑菌有一定的抑制作用。本发明中药颗粒的这些药理作用与其功能主治一致，均有利于慢性阻塞性肺疾病症状的稳定和恢复。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
1.一种用于治疗稳定期慢阻肺的中药颗粒剂，其特征在于：按重量份数计包括如下原料药材：党参200份，熟地黄200份，当归200份，山萸肉200份，蜜麻黄100-120份，黄芩160-200份，陈皮100份，蜜紫菀180-200份，赤芍200份，甘草40-80份，并包括如下重量份数的辅料：乳糖25-69份，淀粉12-35份，麦芽糊精12-35份，聚维酮k303-10份。
2.根据权利要求1所述的中药颗粒剂，其特征在于：按重量份数计包括如下原料药材：党参200份，熟地黄200份，当归200份，山萸肉200份，蜜麻黄100份，黄芩176份，陈皮100份，蜜紫菀200份，赤芍200份，甘草76份，并包括如下重量份数的辅料：乳糖25-45份，淀粉12-23份，麦芽糊精12-23份，聚维酮k303-8份。
3.根据权利要求1至2中任意一项所述的中药颗粒剂的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
(1)除黄芩外，将其他药材置提取设备内，加8-10倍量水加热。
(2)待温度达到80-100℃，投入黄芩，回流提取1-2小时，过滤得第一滤液。
(3)药渣加8-10倍量水回流提取1-2小时，过滤得第二滤液。
(4)药渣加8-10倍量水回流提取1-2小时，过滤得第三滤液。
(5)合并上述滤液，浓缩滤液，进一步浓缩至相对密度为1.20-1.30(60℃)，减压干燥，粉碎，过筛后得中药提取细粉。
(6)中药提取细粉与适量辅料混合均匀，采用沸腾制粒机喷入粘合剂溶液，制成颗粒。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
(1)除黄芩外，将其他药材置提取设备内，加8倍量水加热。
(2)待温度达到80℃，投入黄芩，回流提取1小时，过滤得第一滤液。
(3)药渣加8倍量水回流提取1小时，过滤得第二滤液。
(4)药渣加8倍量水回流提取1小时，过滤得第三滤液。
(5)合并上述滤液，浓缩滤液，进一步浓缩至相对密度为1.25-1.30(60℃)，减压干燥，粉碎，过筛后得中药提取细粉。
(6)中药提取细粉与适量辅料混合均匀，采用沸腾制粒机喷入粘合剂溶液，制成颗粒。
5.权利要求1至4任一项所述的中药颗粒剂在制备用于治疗慢性阻塞性肺疾病稳定期的药物中的用途。
6.根据权利要求1至4任一项所述的中药颗粒剂在制备用于治疗具有咳嗽，喘息，气短、动则加重，乏力，易感冒的慢性阻塞性肺疾病稳定期见上述证候者的药物中的用途。
7.根据权利要求1至4任一项所述的中药颗粒剂在制备用于治疗具有咳嗽，喘息，气短、动则加重，乏力，易感冒的慢性阻塞性肺疾病稳定期兼具糖尿病见上述证候者的药物中的用途。
技术总结