本发明涉及医药领域，尤其涉及新型环孢素a制剂在制备抗sars-cov-2的药物中的应用。
背景技术：
2019新型冠状病毒，2020年1月12日被世界卫生组织命名为covid-19，2020年2月11日被国际病毒分类委员会命名为sars-cov-2。新型冠状病毒与sars冠状病毒同源。专利cn03129067.1运用生物信息学方法对sars-cov中的蛋白质与人体蛋白质相互作用的网络进行了分析，发现sars-cov的核衣壳蛋白(sarsnucleocapsid，以下简称n蛋白)和人体中的人亲环素a(cyclophilina，以下简称cypa)有相互作用，对病毒的成熟、病毒的复制和新病毒颗粒的形成起重要作用。
cypa抑制剂包括免疫抑制药物环孢菌素(csa)，多种抗肝炎药物alisprivir(alv)、nim811、scy-635、stg-175、mm284和cpi-431-32等，结构式见图1。其中csa具有广谱的抗病毒作用，包括丙肝病毒，乙肝病毒，艾滋病毒，流感病毒和人类冠状病毒等。研究报道csa阻断n蛋白和cypa的结合。n蛋白是一种多功能蛋白，是病毒复制和扩增所必需的，能够包裹并保护基因组rna。n蛋白的缺失或功能阻碍是抑制病毒复制的一种措施。由于csa的免疫抑制特性在抗病毒治疗会导致不良副作用，因此已开发出许多非免疫抑制性亲环素抑制剂。研究发现，非免疫抑制性csa多个衍生物有效抑制hcov-229e复制，表明它们可能成为治疗人cov感染的候选药物。
在细胞水平上发现cypa抑制剂--阿拉泊韦alv可以抑制四种不同的冠状病毒(包括mers和sars冠状病毒)的复制；并在基于细胞的感染模型中发现，利巴韦林进一步增强了阿拉泊韦的抗病毒作用。证明，药物联用对抗病毒有显著的效果。
因此，本领域的技术人员致力于开发将cypa抑制剂及其衍生物作为抗sars-cov-2药物的应用。
技术实现要素：
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何将cypa抑制剂作为抗sars-cov-2药物并进行肺部给药。
为实现上述目的，本发明提供了新型肺部给药制剂ps-liposome-csa(表面活性剂-仿生脂质体-环孢素a)在制备抗sars-cov-2的药物中的应用。
本发明还提供一种新型肺部给药制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以表面活性剂(ps)的磷脂成份1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dppc)和1,2-二棕榈酰-sn-甘油3-磷酸-(1'-rac-甘油)(dppg)，并采用1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](dppe-peg2000)模拟ps中的蛋白质成份，结合胆固醇制备ps仿生脂质体(dppc/dppg/dppe-peg/chol)；
(2)dppc/dppg/dppe-peg/chol质量比为10∶1∶1∶1∶1；
(3)采用薄膜蒸发法制备脂质体：在脂质体的制备过程中，将药物环孢素a溶解于含有脂质膜材的氯仿中，制备得到载药脂质体，环孢素a与脂质体的质量比为1：16.15；
(4)将所得载药脂质体在50℃通过400nm和200nm膜挤出，最终得到ps-liposome-csa。
进一步的，所述ps-liposome-csa的尺寸为135.6±3.8nm，pdi:0.148±0.056,ζ电势为0.258±0.736mv。
本发明还提供一种抗sars-cov-2的新型肺部给药的制剂，其特征在于，包括环孢素(csa)和表面活性剂-仿生脂质体(ps-liposome)，所述环孢素(csa)负载于所述表面活性剂-仿生脂质体(ps-liposome)上，csa与ps-liposome的质量比为1：16.15。
技术效果
本发明的脂质体能够快速高效的到达肺部，用于治疗新型冠状病毒引起的肺炎疾病。
本发明的ps-liposome-csa有望成为抗sars-cov-2引起的肺炎的潜在药物。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是现有技术中的cypa抑制剂的化学结构式示意图；
图2是本发明的一个较佳实施例的csa、stg-175与cypa的相互作用的示意图；
图3是本发明的一个较佳实施例的csa和stg-175对病毒复制抑制的作用示意图；
图4(a)是本发明的一个较佳实施例的ps-liposome-csa构造完成后的质控检测,图4(b)包载bpbbt与did的脂质体经鼻腔给药后24h，使用近红外二区分别对小鼠活体和离体肺部器官进行成像，此外对肺部组织进行免疫荧光染色分析。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
抑制假病毒感染的实验方法：
在293t细胞中产生了带有cov-s蛋白或vsv-g蛋白以及表达荧光素酶作为报告基因的缺陷hiv-1基因组的假病毒，并使用hiv-1p24elisa定量了其效价。然后在候选化合物存在或不存在的情况下，使用假病毒感染目标huh-7细胞(或假病毒sars-cov的ace2/293t细胞)(96孔板中每孔104个)浓度。感染后12h，更换新培养基。再培养48h，然后用pbs洗涤细胞，用裂解试剂(promega)裂解细胞，然后将细胞裂解液转移到96孔costar平底发光仪中使用萤火虫萤光素酶测定试剂盒(promega)和ultra384照度计(tecan)检测板中的相对光单位(corningcostar)。
抑制冠状病毒复制的实验方法：
使用改良的中和试验在calu-3细胞中测试了候选化合物对mers-cov复制的抑制活性。中和实验的操作步骤：在96孔板的一式两份孔中，将60ml连续两倍稀释的候选化合物与60ml(120tcid50)的mers-cov在补充有2％fbs的mem培养基(m-2培养基)中于96孔板的双孔中孵育约60min，室内温度。然后将100μl的候选化合物/mers-cov混合物转移到在96孔板中生长的融合calu-3细胞中。在这些测定中分别将用有和没有病毒的m-2培养基培养的calu-3细胞的孔分别作为阳性和阴性对照。尽管在较高的感染复数(moi)为1或0.1(69)时，响应mers-cov感染，calu-3细胞的晚期cpe可能会在24～36h内发育，但直到感染后60～72h，估计moi为0.001。因此，为了更准确地测量抗mers-cov感染的cypa抑制剂的功效，在72h内收集了上清液，并通过基于veroe6的标准感染性测定法定量了感染性病毒滴度，并将滴度表示为log10tcid50/ml。
实施例1csa、stg175与cypa的计算化学分析
使用maestroschrodinger软件进行计算分析，csa、stg-175与cypa的相互作用如图2所示。
结论：
环孢素a(csa)的免疫抑制活性通过环孢素a，亲环素a和钙调神经磷酸酶(can)之间形成的三分子复合物来介导。该复合物的形成会阻断能够产生il-2的信号传导途径，进而达到抑制t细胞增殖的作用。
stg-175与亲环素a(cypa)结合的计算化学分析表明，stg-175与亲环素a的ppiase沟表面紧密结合，能够有效抑制cypa相关的功能。
实施例2csa和stg-175对sars-cov-2假病毒的体外药效
构建重组的sars-cov-2荧光素酶重组病毒(sars-cov-2-nluc)，用于体外抗病毒活性测定。为确保病毒的行为与野生型sars-cov-2相似，我们首先证明了在没有药物治疗的情况下，sars-cov-2-nluc和野生型(wt)2019-covhuh7株的复制和易感水平相似。
后使用sars-cov-2-nluc感染易感huh-7细胞(96孔板中每孔10^4个)浓度,加入csa和stg-175处理。感染后12h，更换新培养基。再培养48h，然后用pbs洗涤细胞，用裂解试剂(promega)裂解细胞，然后将细胞裂解液转移到96孔costar平底发光仪中使用萤火虫萤光素酶测定试剂盒(promega)和ultra384照度计(tecan)检测板中的相对光单位(corningcostar)
如图3所示，构建sars-cov-2荧光素酶重组病毒后，分别使用csa和stg-175对重组病毒进行处理，发现药物处理后对病毒复制有抑制效果，且csa抑制病毒复制存在明显的浓度依赖效应。
实施例3新型肺表面活性剂-仿生脂质体(ps-liposome)制剂的构建与体内分布研究
3.1ps-liposome-csa的制备
以ps的磷脂成份1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dppc)和1,2-二棕榈酰-sn-甘油3-磷酸-(1'-rac-甘油)(dppg)，并采用1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](dppe-peg2000)模拟ps中的蛋白质成份，结合胆固醇制备ps仿生脂质体。dppc/dppg/dppe-peg/chol质量比为10∶1∶1∶1∶1。采用薄膜蒸发法制备脂质体。在脂质体的制备过程中，将药物环孢素a溶解于含有脂质膜材的氯仿中，制备得到载药脂质体。将所得脂质体在50℃通过400nm和200nm膜挤出，最终得到ps-liposome-csa。通过zetasizer测量脂质体的粒径和ζ电势。通过在nanodrop紫外收来确定药物的包封效率，并通过液相色谱-质谱法(lc-ms)确认包封效率。
3.2ps-liposome-csa的体内分布研究
采用近红外ii区荧光探针bpbbt(ex/em＝808nm/1050nm)和红光荧光探针did(ex/em＝644nm/665nm)共同标记ps-liposome-csa，小鼠鼻腔内滴入后让其吸入的方式给药。在给药后不同时间点，处死小鼠，取出肺组织，小动物活体成像仪下观察肺组织的荧光。将肺组织包埋冰冻切片，观察给药后ps-liposome-csa在肺部的分布情况。通过荧光实验结果，可以判断ps-liposome-csa在肺部的分布与时间的关系。
采用111in标记dtpa-pe修饰的ps-liposome-csa，制备得到111in-ps-liposome-csa。小鼠经滴鼻肺部给药后，于不同时间点进行μspect/ct动态观察脂质体在全身以及肺部的分布情况，并计算给药后不同时间脂质体在肺部的分布剂量，计算脂质体的肺部有效沉积量。
采用lc/ms/ms方法测定环孢素a经ps-liposome-csa肺部给药后不同时间点在肺、心、肝、脾、肾、脑、血中的含量，计算血中药动学参数，以及靶组织(肺)与血中药物分布比例。另外，采用环孢素a市售口服制剂经小鼠灌胃给药同等剂量的环孢素a后，测定肺和主要组织器官中的药物含量，与肺部给药脂质体的血中药动学参数以及靶组织(肺)与血中药物分布比例进行比较。
如图4所示，(a)脂质体构造完成后的质控检测，size:135.6±3.8nm,pdi:0.148±0.056,ζ电势为0.258±0.736mv，mean±s.d.(n＝3)。(b)包载bpbbt与did的脂质体经鼻腔给药后24h，使用近红外二区分别对小鼠活体和离体肺部器官进行成像，此外对肺部组织进行免疫荧光染色分析。可发现经脂质体包载后的探针能够迅速，高效地到达肺部。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
1.新型肺部给药制剂ps-liposome-csa(表面活性剂-仿生脂质体-环孢素a)在制备抗sars-cov-2的药物中的应用。
2.一种抗sars-cov-2的新型肺部给药制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以表面活性剂(ps)的磷脂成份1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dppc)和1,2-二棕榈酰-sn-甘油3-磷酸-(1'-rac-甘油)(dppg)，并采用1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](dppe-peg2000)模拟ps中的蛋白质成份，结合胆固醇制备表面活性剂(ps)-仿生脂质体(dppc/dppg/dppe-peg/chol)；
(2)dppc/dppg/dppe-peg/chol的质量比为10∶1∶1∶1∶1；
(3)采用薄膜蒸发法制备脂质体：在脂质体的制备过程中，将药物环孢素a溶解于含有脂质膜材的氯仿中，制备得到载药脂质体，环孢素a与脂质体的质量比为1：16.15；
(4)将所得载药脂质体在50℃通过400nm和200nm膜挤出，最终得到ps-liposome-csa。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述ps-liposome-csa的尺寸为135.6±3.8nm，pdi:0.148±0.056,ζ电势为0.258±0.736mv。
4.一种根据权利要求2所述的制备方法得到的抗sars-cov-2的新型肺部给药的制剂，其特征在于，包括环孢素(csa)和表面活性剂-仿生脂质体(ps-liposome)，所述环孢素(csa)负载于所述表面活性剂-仿生脂质体(ps-liposome)上，csa与ps-liposome的质量比为1：16.15。
技术总结