本发明涉及一种倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv在制备皮肤抗光老化和氧化药物中的应用，尤其是一种天然多功能抗氧化肽-腹斑倭蛙(nanoranaventripunctata)皮肤修复肽cathelicidin-nv在制备皮肤抗光老化治疗药物、皮肤抗氧化保护药物、体内自由基清除药物以及制备化妆品中的应用，属于生物医学领域。
背景技术：
自由基是生物体新陈代谢过程中产生的一类可以单独存在的具有高度氧化活性的带有一个或几个不配对电子的原子团或原子，为维持生命所必需，但同时也是生物大分子、细胞和生物组织的潜在杀手。机体的许多功能障碍和疾病的发生如吞噬、解毒、炎症、肿瘤、衰老、辐射损伤等可以导致自由基的产生。及时清除体内过量的自由基是机体免疫调节的重要组成部分。抗氧化多肽快速、强大的自由基清除能力可以最大限度地保护皮肤，使其尽可能少地受到日照、紫外线等诱导的自由基损伤。
皮肤光老化(skinphotoaging)是指由于皮肤反复暴露于紫外线下而引起的皮肤结构和功能的特征性改变，表现为皮肤过早衰老、多皱纹、粗糙似皮革、色素沉着、毛细管扩张、伴有癌前期损害和恶性肿瘤等特征。由于光老化不仅严重影响患者皮肤外观,极大的降低其生活质量，还可诱发皮肤恶性肿瘤(如恶性黑色素瘤、基底细胞癌、鳞癌等)，近年来，由于大气臭氧层的破坏,辐射到地球表面的紫外线逐渐增多,由此引起的皮肤光老化发病率急剧升高，2015年，全球治疗严重皮肤光老化及由此诱发的皮肤癌每年带来的巨额医疗花费总计超过291亿美元，其中美国高达114亿美元，因此如何有效地预防及治疗紫外线引起的皮肤光老化，在光老化的防治过程中寻找到安全、低毒且成本低廉的新型高效抗氧化药物成为亟待解决的问题。
两栖动物是生物活性多肽资源发掘中最重要的一类资源，其皮肤裸露，为抵御环境中各种恶劣环境，它们能够分泌多种分子结构新颖、功能复杂多样的的生物活性多肽。这些活性多肽广泛参与机体的各种生理活动，具有各种药理活性，如抗微生物、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、创伤修复、镇痛等作用。目前，从两栖动物皮肤中筛选一些药理活性单体化合物是新药发明的热点。据国内外文献报道，已从各种生物来源分离得到不同的活性多肽，而且有些已进入临床阶段。腹斑倭蛙(nanoranaventripunctata)为两栖纲无尾目蛙科倭蛙属的两栖动物，为中国特有物种，是青藏高原的特有种属，腹斑倭蛙相比较其它蛙科动物其生活环境极为严酷，那里有长时间持续的日光照射，强烈的紫外线辐射以及高原寒冷、低压缺氧、干燥及强风的气候特点。这种特异的恶劣生态环境使得它们面临的内外应激因素以及外界微生物的侵袭都与其他的两栖动物有所差异。特殊的高原强紫外线的环境必然赋予这个物种会产生特殊的一些物质来适应这种恶劣的环境。
中国专利cn108484747b《倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv及其基因和应用》公开了一种倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv及其在制备促皮肤创伤修复治疗药物中的应用，目前，涉及其在皮肤抗光老化，抗氧化保护和清除体内自由基作用还鲜有报道。
技术实现要素：
针对现有技术的腹斑倭蛙皮肤分泌物中促皮肤修复肽cathelicidin-nv在制备促皮肤创伤修复治疗药物中的应用之外，发明人经过进一步研究和实验发现，其还具有极强的抗氧化活性及皮肤抗光老化活性，说明cathelicidin-nv既具有促皮肤修复活性又具有抗氧化及皮肤抗光老化活性，故可认为cathelicidin-nv是一种多功能抗氧化肽。
本发明的目的是基于上述现有技术基础，在腹斑倭蛙cathelicidin-nv促皮肤修复应用的基础上，提供cathelicidin-nv的一种新的具有强烈的皮肤抗光老化、抗皮肤氧化保护和清除体内自由基作用方面的新用途。
本发明所述的倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv是中国两栖类特有物种腹斑倭蛙防御肽基因编码的一种环状多肽，根据中国专利《倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv及其基因和应用》(cn108484747b)公开内容，所述的倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv由第七位半胱氨酸和第十二位半胱氨酸组成一对分子内二硫键的环状多肽，分子量2845.9道尔顿，等电点9.90多肽全序列一级结构(氨基酸序列seqidno:1)为：
argkkeckddrcrllmkrgsfsyv(24aa)，其第七位半胱氨酸和第十二位半胱氨酸组成一对分子内二硫键。
本发明的内容包括：
倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv在制备清除体内自由基药物中的应用。
倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv在制备皮肤抗光老化治疗药物中的应用。
倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv在制备皮肤抗氧化保护药物中的应用。
所述的皮肤抗光老化治疗药物和/或皮肤抗氧化保护药物用于制备化妆品。
本发明的有益效果在于：提供了cathelicidin-nv的一种新的具有强烈的皮肤抗光老化、抗皮肤氧化保护和清除体内自由基作用方面的新用途。该倭蛙皮肤修复肽具有强烈的抗氧化活性和皮肤抗光老化作用，可应用于制备皮肤抗氧化保护药物和体内自由基清除药物、皮肤抗光老化治疗药物以及制备化妆品中。该倭蛙皮肤修复肽由于其具有序列简单、合成方便的优点，为应用于制备皮肤抗氧化保护药物和体内自由基清除药物、皮肤抗光老化治疗药物以及制备化妆品提供了较好的的应用前景。
附图说明
图1是实施例1的倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv不同浓度和作用时间的自由基清除率对照图。
图2是实施例2的倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv具有清除细胞内活性氧(ros)作用的结果图。
图3是实施例3的倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv具有极强的皮肤抗光老化作用的效果图。
在图2和图3中，uvb-代表无紫外线uvb照射；uvb 代表紫外线uvb照射；uvb cathelicidin-nv代表紫外线uvb照射，同时给与cathelicidin-nv治疗。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作详细说明。
实施例1：倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv的抗氧化和清除自由基作用
本实施例采用abts 清除法检测倭蛙皮肤修复肽抗氧化和清除自由基的作用。
abts ·是相当稳定的蓝绿色自由基阳离子，在有供氢能力的抗氧化剂存在下，变成没有颜色的abts。抗氧化肽清除abts ·的能力通过734nm处吸光度的变化测定。样品的抗氧化能力与abts ·的残留量成反比。abts ·残留量(％)按照下面公式计算：
％abts ·r＝[(abts ·)t/(abts ·)t＝0]×100
abts ·t是abts ·与样品避光孵育10min后的734nm光吸收值；abts ·t＝0是abts ·在初始时的734nm光吸收值。实验方法为：
①.abts的pbs储存液的配制，浓度为2mm。②.k2s2o8的pbs溶液配制，浓度为70mm。③.abts ·的制备：使用前将abts储存液和k2s2o8溶液按照体积比为250:1混合，室温避光15-16h。④.实验前用pbs稀释abts ·溶液，使其a734在0.8±0.030之间。吸取稀释好的abts ·溶液48μl，加入2μl待测样品(浓度为0.5-10mg/ml)，室温放置10min，于734nm波长下测定其光吸收值。pbs调零。
以上试验均使用样品溶解液(超纯水)做对照，每组设3个平行。
结果如图1显示，随着cathelicidin-nv浓度和作用时间的增加，对abts 清除率也随之增加，且在1min内清除效率最高。80μg/mlcathelicidin-nv在1min时完成了超过90％abts 的清除，10min清除率达94.6±5.4。这表明倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv具有很强的清除自由基和抗氧化作用，同时还具有序列简单、合成方便等优点，能作为制备皮肤抗氧化保护和清除体内自由基药物的应用。
实施例2：倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv清除细胞内活性氧(ros)的作用
本实施例采用流式细胞仪检测紫外线(uvb)介导hacat细胞内ros含量，检测倭蛙皮肤修复肽在体抗氧化的作用。
uvb辐射hacat会导致细胞发生氧化应激，同时引起细胞内活性氧ros剧增，导致细胞代谢紊乱。我们通过流式细胞仪检测uvb介导hacat细胞内ros含量，结果如图2所示：发现uvb辐射处理组相比正常组(非uvb辐射处理组)明显上调细胞内ros，而倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv能显著降低细胞内ros含量。以上结果充分说明cathelicidin-nv能有效清除uvb介导的hacat细胞内ros，进一步证明了其具有很强的细胞内抗氧化作用。实施例3：倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv在制备皮肤抗光老化治疗药物中的应用
将无毛小鼠随机分为uvb-组:无紫外线uvb照射；uvb 组：紫外线uvb照射：uvb cathelicidin-nv组：紫外线uvb照射，同时给与cathelicidin-nv治疗。uvb-组和uvb 组在无毛小鼠背部，涂抹pbs溶液，uvb cathelicidin-nv组在无毛小鼠背部，涂抹溶于pbs溶液的皮肤抗氧化肽cathelicidin-nv，然后将无毛鼠置于uvb光源正下方50cm处，第一周，除正常对照组外,其余组每天照射一次，共5次，每次uvb照射剂量为100mj/cm2，第2周后，除正常对照组外,其余组均隔日照射uvb一次，每次uvb照射剂量为200mj/cm2,持续共12周。
结果如图3所示：在uvb照射12周后，肉眼观察uvb 组无毛小鼠背部照射区域，出现了典型的皮肤光老化皮肤现象：表现为进行性弹性丧失，皱纹变粗深，出现皮革样外观，并伴有脱屑等光老化改变；uvb-组皮肤色泽正常，弹性好，而uvb cathelicidin-nv组给与倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv后皮肤光老化改变明显比uvb 组轻。进一步组织学观察无毛小鼠光老化模型皮肤的病理改变，uvb 组表皮明显增厚，表皮突及真皮乳头消失；真皮纤维变性、排列紊乱，分布不均或稀疏。uvb-组表皮细胞排列整齐，真皮层可见波浪状纤维组织，排列有序，分布均匀，疏密有致，细胞成分数量适中。而uvb cathelicidin-nv组给与倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv后，表皮厚度及胶原纤维变性，损伤程度较uvb 组轻。
实验结果表明：倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv有较强的皮肤抗光老化的作用，明显抑制了uvb引起的皮肤光老化现象，明显抑制了光老化引起的表皮层增厚，详见图3。
1.倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv在制备皮肤抗氧化保护药物中的应用，所述倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv是中国两栖类特有物种腹斑倭蛙防御肽基因编码的一种环状多肽，由第七位半胱氨酸和第十二位半胱氨酸组成一对分子内二硫键的环状多肽，分子量2845.9道尔顿，等电点9.90。
2.倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv在制备皮肤抗光老化治疗药物中的应用，所述倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv是中国两栖类特有物种腹斑倭蛙防御肽基因编码的一种环状多肽，由第七位半胱氨酸和第十二位半胱氨酸组成一对分子内二硫键的环状多肽，分子量2845.9道尔顿，等电点9.90。
3.倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv在制备清除体内自由基药物中的应用，所述倭蛙皮肤修复肽cathelicidin-nv是中国两栖类特有物种腹斑倭蛙防御肽基因编码的一种环状多肽，由第七位半胱氨酸和第十二位半胱氨酸组成一对分子内二硫键的环状多肽，分子量2845.9道尔顿，等电点9.90。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的皮肤抗光老化治疗药物和/或皮肤抗氧化保护药物用于制备化妆品。
技术总结