本发明属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域，特别涉及一种非洲猪瘟p30、p54、p72和b602l的dna疫苗和亚单位疫苗及其制备方法与应用。
背景技术：
非洲猪瘟(aficanswinefever，asf)是一种由非洲猪瘟病毒(africanswinefevervirus，asfv)引起的高度接触、出血性、病毒性的传染病，病死率高达100％，严重危及养猪业发展。非洲猪瘟自1921年在肯尼亚发现以来，疫情在全球范围内不断的蔓延，仍然具有流行扩大的趋势，且目前没有安全有效的疫苗以及治疗手段，仅能从生物防控方面阻止疾病的传播。我国自2018年8月以来，国内报道了首例asf疫情，随后asfv蔓延至我国所有的省份和地区，给我国的生猪养殖造成了巨大的经济损失。由于asfv免疫保护机制不清楚、结构复杂、且大部分基因功能未知、病毒与宿主细胞相互作用的机制不明确等因素存在，所以疫苗的研发较为困难。在特异性免疫应答的过程中，细胞免疫和体液免疫起到不同的作用。
非洲猪瘟疫苗的研究于上世纪60年代开始，由于对asfv的生物学特性研究不充分，非洲猪瘟的灭活疫苗虽能刺激猪产生抗体，但未能检测到中和抗体的存在，且因难以刺激机体产生细胞免疫，均以失败告终。通过细胞传代、天然致弱等方式研制的弱毒疫苗，有部分能抵御同源毒株的攻击，但无法提供异源毒株的交叉保护，且存在较大的安全性问题，故此类疫苗的研发及应用不是未来的研究重点。
asfv可编码产生多达167种蛋白，在选择哪些蛋白作为亚单位疫苗的候选抗原是一个需要深入研究的过程。现阶段已经报道了几种asfv蛋白可作为病毒中和的靶标，并且实验验证了这些蛋白诱导产生的保护力。其中包括使用杆状病毒表达系统表达的p54和p30蛋白，使用修饰的痘病毒载体表达p72、cd2v和c型凝集素等。asfv的dna疫苗研究中，有研究人员将asfv血凝素的胞外域、p54蛋白、p30蛋白和泛素基因进行融合，可产生部分保护效果；基于asfv-ba71v毒株的80多个开放阅读框的基因序列，与泛素基因进行融合后，将构建的表达文库进行免疫接种后，使用高毒力的毒株进行攻毒，可产生60％的保护效力。
asfv的亚单位疫苗研究中，有研究人员使用杆状病毒表达系统表达的p54和p30蛋白，分3次免疫猪，单次免疫100μg抗原，在使用高毒力的欧洲asfve75毒株进行攻毒后，有3/6(50％)的动物死亡，且存活动物中表现出临床症状及病毒血症；有研究将p30、p54、p72、p22等基因从asfv-pr毒株上克隆后使用杆状病毒表达系统表达蛋白，免疫4次，单次免疫200μg抗原，在使用亲本asfv-pr4毒株(基因ⅰ型)攻毒后，仅观察到疾病及进程有两天的延迟和病毒血症的水平有所降低，但是对于疾病的进展以及最终的攻毒实验不提供保护力，均在7～10d死亡。
asfv的核酸疫苗及亚单位疫苗能够诱导猪产生特异性抗体和中和抗体，但是无法提供攻毒保护效果，且存在抗体依赖性增强效应，抗体水平高的动物，其asf发病过程、病毒血症均更加严重。在亚单位疫苗的研究中，有研究人员将病毒中和表位已经明确的p30、p54、p72这三种蛋白使用杆状病毒表达系统进行蛋白表达，免疫猪后产生中和抗体，但经过攻毒实验后，实验组的动物表现为疾病进程推迟两天，最终无法提供保护性免疫力。dna疫苗的潜在优势包括刺激b细胞和cd4 、cd8 t细胞反应。在另一项研究中表明，构建了表达asfv血凝素(sha)的胞外域与p30、p54和泛素融合蛋白的dna质粒，进行免疫后，在未能检测到抗体存在的情况下，有33％的实验动物产生了免疫保护效力，证实了t细胞免疫反应在针对asfv的保护性免疫中的重要作用。由此可见，单一形式的dna疫苗或者亚单位疫苗的使用，刺激机体产生的免疫反应效果不佳，因此，需要开发出新的疫苗组合方案及免疫程序进行免疫效果的提升。
技术实现要素：
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种非洲猪瘟p30、p54、p72和b602l的dna疫苗和亚单位疫苗。
本发明的又一目的在于提供所述的非洲猪瘟p30、p54、p72和b602l的dna疫苗和亚单位疫苗的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述的非洲猪瘟p30、p54、p72和b602l的dna疫苗和亚单位疫苗的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种非洲猪瘟p30、p54、p72和b602l的dna疫苗和亚单位疫苗，所述的dna疫苗包括编码非洲猪瘟病毒p30、p54、p72和b602l蛋白的四个重组pcaggs真核表达质粒；所述的亚单位疫苗包括利用重组杆状病毒表达系统的三个蛋白：单独表达的非洲猪瘟病毒p30蛋白、非洲猪瘟病毒p54蛋白，联合表达的非洲猪瘟病毒p72蛋白和非洲猪瘟病毒b602l蛋白，以及药学上可以接受的佐剂。
构建重组pcaggs表达质粒过程中，对非洲猪瘟病毒各蛋白的基因序列进行猪源密码子优化：
所述的非洲猪瘟病毒p30基因的核苷酸序列如seqidno.5所示；
所述的非洲猪瘟病毒p54基因的核苷酸序列如seqidno.6所示；
所述的非洲猪瘟病毒p72基因的核苷酸序列如seqidno.7所示；
所述的非洲猪瘟病毒b602l基因的核苷酸序列如seqidno.8所示；
构建重组杆状病毒过程中，对非洲猪瘟病毒各病毒蛋白的基因进行昆虫细胞密码子优化：
编码所述的非洲猪瘟病毒p30蛋白的核苷酸序列如seqidno.9所示；
编码所述的非洲猪瘟病毒p54蛋白的核苷酸序列如seqidno.10所示；
编码所述的非洲猪瘟病毒p72蛋白的核苷酸序列如seqidno.11所示；
编码所述的非洲猪瘟病毒b602l蛋白的核苷酸序列如seqidno.12所示。
所述的药学上可以接受的佐剂优选包括水包油包水佐剂；更优选为montanidetmisa201vg佐剂。
所述的非洲猪瘟p30、p54、p72和b602l的dna疫苗和亚单位疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)dna疫苗的制备：
将非洲猪瘟p30、p54、p72和b602l基因分别与pcaggs空载体连接，得到连接产物，将连接产物转化、筛选，分别得到重组质粒pcaggs-p30、pcaggs-p54、pcaggs-p72和pcaggs-b602l，加入佐剂，即得非洲猪瘟p30、p54、p72和b602l的dna疫苗；
所述的用于扩增上述目的基因的引物分别如下表1所示：
表1：
(2)亚单位疫苗的制备：
1)将编码所述的非洲猪瘟p30、p54蛋白的核苷酸序列分别克隆入pacebac1质粒构建重组表达载体pacebac1-p30和pacebac1-p54；
2)先将编码所述的非洲猪瘟p72蛋白的核苷酸序列克隆入pfastbacdual载体构建重组载体pfastbacdual-p72，再将编码所述的非洲猪瘟b602l蛋白的核苷酸序列克隆入重组载体pfastbacdual-p72构建得到重组表达载体pfastbacdual-p72-b602l；
3)分别将上述重组表达载体pacebac1-p30、pacebac1-p54和pfastbacdual-p72-b602l转入昆虫-杆状病毒表达系统进行蛋白表达，然后加入佐剂，即得非洲猪瘟p30、p54、p72和b602l的亚单位疫苗。
步骤1)中所述的构建重组表达载体的具体步骤优选为：针对编码所述的非洲猪瘟p30、p54、p72和b602l蛋白的核苷酸序列，通过设计引物进行pcr，然后分别进行如下操作：
s1.分别将非洲猪瘟p30、p54基因和pacebac1质粒载体双酶切后构建得到重组表达载体pacebac1-p30和pacebac1-p54；
s2.将非洲猪瘟p72基因片段双酶切后与pfastbacdual载体连接，构建得到pfastbacdual-p72重组载体，然后将非洲猪瘟b602l基因片段双酶切后与pfastbacdual-p72重组载体连接构建得到pfastbacdual-p72-b602l重组表达载体。
其中，所述的引物为：
表2：
所述的用于双酶切非洲猪瘟p30、p54基因和pacebac1载体的酶均优选为bamhl和hindiii限制性内切酶。
所述的用于双酶切非洲猪瘟p72基因和pfastbacdual载体的酶均优选为xhol和kpnl限制性内切酶。
所述的用于双酶切b602l基因和pfastbacdual-p72重组载体的酶均优选为bamhl和ecori限制性内切酶。
所述的非洲猪瘟p30、p54、p72和b602l的dna疫苗和亚单位疫苗在预防和/或治疗非洲猪瘟病毒引起的猪相关疾病中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)针对亚单位疫苗及核酸疫苗免疫后仅能提供部分保护或者无保护力的问题，为提高亚单位疫苗和核酸疫苗的免疫效果，通过猪源及昆虫细胞的密码子优化，且采取“鸡尾酒”式混合免疫，用于提高疫苗的免疫效果。本发明将asfv抗原基因：p30、p54、p72和b602l蛋白选为研究目标，进行猪源密码子优化，构建了pcaggs-p30、pcaggs-p54、pcaggs-p72和pcaggs-b602l等哺乳动物真核表达dna质粒；同时利用bac-to-bac昆虫杆状病毒表达系统构建了重组杆状病毒：bac-p30、bac-p54和bac-p72-b602l。该非洲猪瘟疫苗免疫4周龄仔猪后，于一免后28天时可检测到显著高于对照组的体液免疫和细胞免疫。
(2)本发明根据表达目的基因的物种-草地贪夜蛾进行核苷酸序列的优化，实现了目的蛋白的稳定和大量表达。
(3)本发明是通过bac-to-bac杆状病毒表达系统表达的非洲猪瘟p30、p54、p72和b602l蛋白，由于利用的表达系统属于真核表达系统，因此表达产物与天然外源产物有极高的理化特性和生物学活性剂免疫原性，同时由于对无脊椎动物无感染性，因此其表达产物具有较高的生物安全性。
(4)本发明实施例中利用摇瓶悬浮培养昆虫细胞的方式表达蛋白，摇瓶培养细胞量较普通贴壁培养大，日后可利用发酵罐等方式大量表达蛋白，能极大地降低生产成本。
附图说明
图1为实施例1中p30、p54、p72和b602l基因的pcr扩增结果图；其中，泳道m为dnamarkerdl2000，泳道1为p30基因扩增产物；泳道2为阴性对照；泳道3为p54基因扩增产物；泳道4为阴性对照；泳道5为p72基因扩增产物；泳道6为阴性对照；泳道7为b602l基因扩增产物；泳道8为阴性对照。
图2为实施例1中重组质粒pcaggs-p30和pcaggs-p54的酶切鉴定结果图；其中，泳道m为dnamarkerdl10000，泳道1为pcaggs-p30的双酶切产物；泳道2为pcaggs-p30的单酶切产物；泳道3为pcaggs-p30的未酶切质粒；泳道4为阴性对照；泳道5为pcaggs-p54的双酶切产物；泳道6为pcaggs-p54的单酶切产物；泳道7为pcaggs-p54未酶切质粒；泳道8为阴性对照。
图3为实施例1中重组质粒pcaggs-p72和pcaggs-b602l的酶切鉴定结果图；其中，泳道m为dnamarkerdl10000，泳道1为pcaggs-p72的双酶切产物；泳道2为pcaggs-p72的单酶切产物；泳道3为pcaggs-p72的未酶切质粒；泳道4为阴性对照；泳道5为pcaggs-b602l的双酶切产物；泳道6为pcaggs-b602l的单酶切产物；泳道7为pcaggs-b602l未酶切质粒；泳道8为阴性对照。
图4为重组质粒pcaggs-p30、pcaggs-p54、pcaggs-p72和pcaggs-b602l转染293t细胞的间接免疫荧光试验(ifa)的实验结果图。
图5为实施例2中目的产物的琼脂糖凝胶电泳结果图；其中，泳道m为dnamarkerdl2000；泳道1为p30基因扩增产物；泳道2为阴性对照；泳道3为p54基因扩增产物；泳道4为阴性对照；泳道5为p72基因扩增产物；泳道6为阴性对照；泳道7为b602l基因扩增产物；泳道8为阴性对照。
图6为实施例2中pacebac1-p30、pacebac1-p54的酶切结果图；其中，泳道m为dnamarkerdl50000；泳道1为pacebac1-p30质粒的双酶切产物；泳道2为pacebac1-p30质粒的单酶切产物；泳道3为pacebac1-p30质粒的未酶切质粒；泳道4为阴性对照；泳道5为pacebac1-p54质粒的双酶切产物；泳道6为pacebac1-p54质粒的单酶切产物；泳道7为pacebac1-p54的未酶切质粒；泳道8为阴性对照。
图7为实施例2中pfastbacdual-p72-b602l质粒的酶切结果图；其中，泳道m为dnamarkerdl10000；泳道1为p72基因的双酶切产物；泳道2为b602l基因的双酶切产物；泳道3为pfastbacdual-p72-b602l的单酶切质粒；泳道4为pfastbacdual-p72-b602l的未酶切质粒；泳道5为阴性对照。
图8为实施例2中p30蛋白的western-blot鉴定结果图；其中，泳道m为180kda的marker；泳道1为72h、p30细胞上清鉴定结果；泳道2为72h、p30细胞沉淀鉴定结果；泳道3为96h、p30细胞上清鉴定结果；泳道3为96h、p30细胞沉淀鉴定结果；泳道5为全细胞样阴性对照。
图9为实施例2中p54蛋白的western-blot鉴定结果图；其中，泳道m为180kda的marker；泳道1为p54细胞上清鉴定结果；泳道2为p54细胞沉淀鉴定结果；泳道3为全细胞样阴性对照。
图10为实施例2中p72蛋白的western-blot鉴定结果图；其中，泳道m为180kda的marker；泳道1为p72细胞上清鉴定结果；泳道2为p72细胞沉淀鉴定结果；泳道3为全细胞样阴性对照。
图11为实施例2中b602l蛋白的western-blot鉴定结果图；其中，泳道m为180kda的marker；泳道1为b602l细胞上清鉴定结果；泳道2为b602l细胞沉淀鉴定结果；泳道3为全细胞样阴性对照。
图12为实施例2中p30蛋白和p54蛋白的定量western-blot鉴定结果图；其中，泳道m为180kda的marker；泳道1-3为p30细胞上清的鉴定结果；泳道4为flic蛋白上清的鉴定结果；泳道5-6为p54细胞沉淀的鉴定结果；泳道7为flic蛋白上清的鉴定结果；泳道8为sf9空白细胞样结果。
图13为实施例2中p72-b602l蛋白的定量western-blot鉴定结果图；其中，泳道m为180kda的marker；泳道1-2为p72-b602l细胞沉淀的鉴定结果；泳道3为flic蛋白上清的鉴定结果；泳道4为sf9空白细胞样结果。
图14为p54特异性抗体水平变化趋势图。
图15为pcaggs-p30、pcaggs-p54、pcaggs-p72、pcaggs-b602l四个质粒分别转染293t细胞的间接免疫荧光试验结果图。
图16为pcaggs-p72和pcaggs-b602l质粒共转染组与pcaggs-b602l质粒单转染组的间接免疫荧光试验结果图。
图17为初免42天后pbmc中分泌ifn-γ的淋巴细胞数量结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：重组真核表达质粒pcaggs-p30、pcaggs-p54、pcaggs-p72、pcaggs-b602l的构建及验证
1.1、asfvp30、p54、p72及b602l的合成及扩增
根据genbank提供的基因ⅱ型asfv毒株序列：包括格鲁吉亚毒株(genbank登录号：nc_044959.1)、中国境内第一株asfv-sy18(genbank登录号：mh766894.1)和asfv-db/ln/2018(genbank登录号：mk333181.1)，进行序列比分析对后，选定编码非洲猪瘟病毒p30蛋白、非洲猪瘟病毒p54蛋白、非洲猪瘟病毒p72蛋白和非洲猪瘟病毒b602l蛋白的基因序列，并进行核苷酸优化，通过通过华大基因公司进行合成，并克隆于puc57载体上。
其中，编码非洲猪瘟病毒p30蛋白的核苷酸原序列如seqidno.1所示，优化后如seqidno.5所示，根据优化后的非洲猪瘟病毒p30基因核苷酸序列设计引物，在基因上下游分别添加ecorⅰ和kpnⅰ两种限制性内切酶酶切位点；
编码非洲猪瘟病毒p54蛋白的核苷酸原序列如seqidno.2所示，优化后如seqidno.6所示，根据优化后的非洲猪瘟病毒p54基因核苷酸序列设计引物，在基因上下游分别添加ecorⅰ和kpnⅰ两种限制性内切酶酶切位点；
编码非洲猪瘟病毒p72蛋白的核苷酸原序列如seqidno.3所示，优化后如seqidno.7所示，根据优化后的p72基因核苷酸序列设计引物，在基因上下游分别添加ecorⅰ和kpni两种限制性内切酶酶切位点；
编码非洲猪瘟病毒b602l蛋白的核苷酸原序列如seqidno.4所示，优化后如seqidno.8所示，根据优化后的b602l基因核苷酸序列设计引物，在基因上下游分别添加ecorⅰ和kpni两种限制性内切酶酶切位点；
表1：引物序列如下所示：
以含有目的基因的puc57-p30、puc57-p54、puc57-p72、puc57-b602l为模板，以相应的引物进行目的基因的扩增，使用premixprimestarhs高保真酶进行pcr扩增。pcr完成后，将50μlpcr扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1所示，其中p30基因扩增目的条带(携带酶切位点)大小为624bp，p54基因扩增目的条带大小为573bp，p72基因扩增目的条带大小为1959bp，b602l基因扩增目的条带大小为1611bp，符合预期，进行目的基因的胶回收。
1.2、pcaggs重组质粒构建与鉴定
将pcr扩增产生的目的基因与质粒抽提产生的空载体进行双酶切实验：根据不同基因使用相对应的两种限制性内切酶对胶回收的目的基因与pcaggs空载体(由华南农业大学兽医学院传染病教研室提供)进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳的方式回收酶切产物。
目的片段与载体连接：酶切产物回收完成后，通过连接反应将各个目的基因与载体连接，使用t4连接酶进行目的基因与载体的连接。于16℃的恒温连接仪中，反应过夜12～16h，得到连接产物。
连接产物转化dh5α感受态细胞，使用amp 抗性琼脂平板进行筛选。筛选出来的单菌落扩大培养后进行菌液pcr鉴定，将阳性菌寄送至华大基因公司进行测序分析，并同时使用阳性菌抽提质粒进行重组质粒pcaggs-p30、pcaggs-p54、pcaggs-p72和pcaggs-b602l的双酶切鉴定。酶切鉴定结果如图2、3所示。
间接免疫荧光转染实验：为验证构建的4个pcaggs质粒真核细胞中的蛋白表达情况，通过间接免疫荧光实验进行质粒的蛋白表达情况验证，实验步骤如下：实验用细胞系为293t细胞(购于atcc)，将处于对数生长期的293t细胞经胰酶消化分散后铺于12孔细胞培养板中，加入含有10％血清的dmem完全培养基(购于sigma-aldrich公司)培养18～24h，直至细胞生长至90％～95％的细胞密度。使用lipofectamine2000作为转染试剂，转染质粒质量为1.6μg/孔，转染试剂使用量为4.0μl。分别将1.6μg重组质粒pcaggs-p30、pcaggs-p54、pcaggs-p72和pcaggs-b602l溶于100μlopti-men无血清培养基(购于sigma-aldrich公司)中(a液)，将4μllipofectamine2000转染试剂溶于100μlopti-men无血清培养基中(b液)，室温混匀放置5min。将两管置于1.5mlep管中混合，放置20min。将12孔板使用pbs缓冲液(ph7.4，0.01mol/l)洗涤两遍，更换为无血清培养基，每孔加入400μl，并将混合液加入到12孔板对应的孔中，4小时后更换成dmem完全培养基(购于sigma-aldrich公司)。
间接免疫荧光实验：将转染质粒24h后的细胞从培养箱取出后，弃去培养基，每孔加入1mlpbs缓冲液(ph7.4，0.01mol/l)轻轻漂洗3遍细胞，弃去pbs缓冲液后，最后倒扣于纱布上静置3min，吸干多余水分。每孔加入500μl多聚甲醛，固定细胞活动，室温静置孵育20min。接着弃去多聚甲醛，每孔加入1mlpbs缓冲液轻轻漂洗3遍细胞。每孔加入500μl0.5％(v/v)曲拉通溶液(使用pbs缓冲液稀释)进行通透处理，室温静置孵育10min。漂洗细胞，弃去曲拉通溶液，每孔加入1mlpbs缓冲液，置于80rpm的摇床上摇洗10min，总共洗涤细胞3次。封闭处理，每孔加入500μl5％(w/v)脱脂奶粉(使用pbs缓冲液稀释)，37℃静置孵育30min。漂洗细胞，弃去脱脂奶粉溶液，每孔加入1mlpbst(1×，ph7.5)溶液，置于80rpm的摇床上摇洗10min，总共洗涤细胞3次。一抗孵育，每孔加入pbs缓冲液稀释的非洲猪瘟耐过猪的阳性血清，每孔500μl，置于4℃孵育过夜(10～16h)；漂洗细胞，弃去一抗溶液，每孔加入1mlpbst溶液，置于80rpm的摇床上摇洗10min，总共洗涤细胞3次。二抗孵育，每孔加入500μl羊抗猪fitc二抗(使用pbs缓冲液(ph7.4，0.01mol/l)按1:500比例稀释，置于80rpm的摇床上避光摇晃30min，于室温条件进行。漂洗细胞，弃去二抗溶液，每孔加入1mlpbst溶液，置于80rpm的摇床上摇洗10min，总共洗涤细胞3次；荧光显微镜下观察，每孔添加500μlpbs缓冲液，避光转移至倒置荧光显微镜下观察实验结果。实验结果如图4所示。
实施例2：杆状病毒表达载体的构建及蛋白表达验证结果
2.1、杆状病毒表达系统使用的asfvp30、p54、p72、b602l基因的合成
基因合成：参照实施例1已经选定的基因序列，根据昆虫细胞(草地贪夜蛾为宿主)进行密码子优化，优化后各基因中gc含量在60％左右。p30蛋白的核苷酸原序列如seqidno.1所示，优化后如seqidno.9所示；p54蛋白的核苷酸原序列如seqidno.2所示，优化后如seqidno.10所示；p72蛋白的核苷酸原序列如seqidno.3所示，优化后如seqidno.11所示；b602l蛋白的核苷酸原序列如seqidno.4所示，优化后如seqidno.12所示。asfv-p30、p54基因上下游分别添加bamhⅰ和hindiii两种限制性内切酶酶切位点。asfv-p72基因上下游分别添加xhol和kpnl两种限制性内切酶酶切位点。asfv-b602l基因上下游分别添加bamhi和ecori两种限制性内切酶酶切位点。将最终优化好的目的基因通过华大基因公司进行合成，并克隆于puc57质粒载体上。
2.2、引物设计
根据优化后的基因合成序列，使用primerpremier6和snapgene软件进行扩增引物的设计，引物具体序列如下：
表2：
每个基因的酶切位点和6×his标签均通过引物添加，6×his标签添加于p30、p54、p72基因的起始密码子后方和终止密码子前方，b602l基因的起始密码子后方添加flag标签(用于鉴定)，终止密码子前方添加his标签(用于纯化)。
2.3、pcr扩增及产物回收
以含有目的基因的puc57-p30、puc57-p54、puc57-p72、puc57-b602l为模板，以相应的引物进行目的基因的扩增。使用premixprimestarhs高保真酶进行pcr扩增。pcr完成后，进行目的产物的琼脂糖凝胶电泳及目的基因的胶回收，扩增结果如图5所示。
2.4、重组转递质粒的构建与鉴定
目的片段和质粒载体的双酶切：(1)对于构建单表达p30、p54这两个目的基因的pacebac1质粒，p30、p54这两个目的基因和pacebac1质粒载体的双酶切，使用bamhi和hindiii两种限制性内切酶；(2)对于构建联合表达p72基因和b602l基因的pfastbacdual的重组质粒，p72基因使用xhol和kpnl两种限制性内切酶，pfastbacdual空载体(购于sigma-aldrich公司)同时使xhol和kpnl两种限制性内切酶。当连接上p72基因后，对b602l基因使用bamhi和ecori两种限制性内切酶酶切，构建好的pfastbacdual-p72使用bamhi和ecori两种限制性内切酶酶切。各个目的基因跟载体双酶切完成后，进行凝胶电泳分离条带，并进行酶切产物的胶回收，结果如图6、7所示。
目的基因与载体的连接与转化：使用t4连接酶将将目的基因和质粒载体进行连接反应。接着进行连接产物转化dh5α感受态细胞，将转化完成的菌液涂布于相应抗性的固体琼脂平板上(含pacebac1质粒的为gen 抗性平板，含pfastbacdual质粒的为amp 抗性平板)。
单克隆阳性菌筛选：重组pace质粒阳性菌选用gen 抗性培养基，pfastbacdual质粒阳性菌选用amp 抗性培养基进行扩大培养。扩大培养后进行菌液pcr验证。将初步验证为阳性的菌寄送至华大基因公司进行测序分析。测序正确的质粒，命名为pacebac1-p30、pacebac1-p54、pfastbacdual-p72-b602l，并将测序正确的菌株进行保菌处理和质粒抽提。
2.5、重组杆状病毒质粒的获得与鉴定
将抽提的重组质粒转化至dh10bac感受态细胞中，实验操作步骤如下：将dh10bac感受态细胞从-80℃环境中取出，置于冰上解冻10min。将1μg重组质粒加入到100μl感受态细胞中，轻轻吹打混匀，置于冰上冰浴30min，冰浴结束置于42℃水浴锅中热应激42s，再返回冰浴状态5min。在每管感受态细胞中加入600μl无抗lb液体培养基(购于北京鼎国昌盛生物技有限责任公司)，于37℃恒温摇床中220rpm震荡培养4h。培养结束后，使用无抗lb液体培养基对菌液进行10倍梯度稀释，稀释至10-2，将高稀释倍数(10-1和10-2稀释倍数)的菌液吸取400μl均匀涂布于三抗lb琼脂平板上(三抗分别为：卡那霉素(50μg/ml)、庆大霉素(7μg/ml)、四环素(10μg/ml)，并且加入x-gal(终浓度为100μg/ml)和iptg(40μg/ml))，在生物安全柜中静置20min挥发多余水分后，使用报纸将琼脂板避光包好，倒置放于37℃培养箱中培养48h。
挑单克隆菌落验证：使用10μl移液器枪头进行单菌落挑选，依据视野中菌落大小排序，优先挑选体积大的白色单菌落。将菌体置于1.5ml离心管中，加入800μl三抗lb培养基，置于37℃恒温摇床中，220rpm震荡培养4h。随后进行菌液pcr鉴定。菌液pcr鉴定成功后，则表明目的基因3成功转座重组杆状病毒穿梭载体bacmid。
重组杆状病毒质粒的抽提：将pcr鉴定正确的菌株进行扩大培养，培养基使用三抗lb培养基。收集菌体后使用异丙醇沉淀法抽提重组杆毒质粒。
2.6、重组杆状病毒的获得与表达鉴定
(1)重组杆状病毒bv-p30、bv-p54、bv-p72-b602l的获得
利用
确认sf9昆虫细胞处于对数期(1.0～2.5×106个细胞/ml)，且存活率高于95％；使用前混匀
(2)蛋白表达步骤：
假设p2代重组病毒的滴度为5×107pfu/ml，将p2代病毒以moi为0.05、0.1、0.25、0.5、1不同感染剂量感染sf9细胞，细胞密度为2.5×106/ml，于27℃恒温摇床，悬浮培养72h。无菌收集含有sf9细胞的培养基，500g离心5min，离心后的上清为p3代病毒，离心后的细胞沉淀进行蛋白鉴定分析及moi筛选，将离心后的细胞沉淀进行冰浴裂解，分别取适量上清与沉淀，加入6×proteinloadingbuffer，置于100℃金属水浴锅中加热10min，将制备好的蛋白样品通过sds-page及western-blot进行蛋白鉴定。
(3)western-blot鉴定p30、p54、p72和b602l蛋白的表达
sds-page电泳实验：将浓度为12％的蛋白胶放置于倒满sds-page缓冲液的电泳槽中，将制备好的蛋白样依次加入至孔中，每孔加入20μl样品，第一列为蛋白maker。将电泳仪电压设置为80v，恒压电泳30min；随后将电压设置为120v，恒压电泳至目的蛋白条带与其他蛋白充分分离。蛋白胶电泳完成后，将上层浓缩胶弃去，把分离胶放置于考马斯亮蓝染色液中染色30min。将染色液弃去后，加入脱色液摇洗脱色，置于摇床上以80rpm的转速摇洗3h，更换脱色液，重复漂洗3次。当背景基本漂洗干净，目的蛋白清洗可见时，漂洗结束。将脱色完毕的蛋白胶置于双色激光成像分析系统进行扫描观察，拍照记录结果。
western-blot实验：依据上述sds-page电泳实验步骤进行凝胶电泳，电泳结束后，参照蛋白maker的大小，将目的蛋白上下的凝胶切出，依据切下的胶体长宽，裁剪相同大小的硝酸纤维素膜(nc膜)。将滤纸裁剪好，并将转膜仪中的海绵板、滤纸及硝酸纤维素膜浸润到预冷的转膜液中。将准备好的各种材料按以下(-)黑板 海绵板 滤纸 胶 nc膜 滤纸 海绵板 白板( )顺序组装，放入转膜仪中，在电泳槽中注满电泳缓冲液，并将转膜仪放入冰盒中。将电流设置为200ma，使用恒流转膜70min。封闭处理，将nc膜取出，加入5％的脱脂奶粉，置于37℃恒温摇床封闭1h，弃去封闭液，使用pbs缓冲液(ph7.4，0.01mol/l)置于摇床上摇洗10min，重复操作3次。将nc膜用1:5000稀释好的his-tag(4c2)monoclonalantiboby孵育，置于4℃孵育过夜，随后吸弃一抗溶液，置于摇床用pbst(1×，ph7.5)摇洗三次，每次10min。避光加入以1：10000稀释好的
各蛋白的表达量定量：采用灰度分析法进行定量，使用本实验室之前利用杆状病毒表达系统表达的带有his标签的鞭毛蛋白为标准参照品，该蛋白经镍柱成功纯化后使用bca试剂盒定量。纯化后鞭毛蛋白的浓度为：1.029mg/ml。将待检测样品与标准参照品分别使用6×proteinloadingbuffer制混匀，放入沸水中加热变性10min制备样品，通过western-blot进行蛋白灰度分析。进行western-blot点样时，检测样品和标准参照以相同体积点样。将western-blot结果导入至图片分析软件imagestudio中，经软件分析得到样品与标准参照品的灰度值，将样品灰度值与标准参照品灰度值进行比对，再根据标准参照品蛋白浓度求得待测样品浓度。样品浓度为：
表3：
实施例3：dna及亚单位疫苗的制备
本实验制作dna疫苗以及亚单位疫苗使用的佐剂均为seppic公司生产的montanidetmisa201vg佐剂(水包油型乳剂)，根据实验操作手册指示，乳化步骤不需要高剪切，但高度依赖温度的变化，疫苗配制的乳化步骤如下：按重量比50/50准备两相，水相为dna质粒溶液或蛋白溶液，油相为montanidetmisa201佐剂。将两相均置于水浴锅中加热10min至32℃，将两相抽吸至注射器中，注射器连接乳化管，快速互推10循环，单次循环小于1s。随后将乳化完全的疫苗制剂置于20℃水浴锅中冷却1h。冷却完成后即可用于注射使用。
实施例4：dna及亚单位疫苗联用的免疫原性研究
4.1、实验分组
将6只无特定病原(asfv、prrsv、prv和csfv)4周龄断奶仔猪由广东省云浮市梁益棠养殖场提供。随机分为2组，每组3只，具体分组情况如下：
表4：
组别设置：空白组，将dna质粒(空pcaggs质粒)和pbs缓冲溶液，使用等体积的montanidetmisa201佐剂(购自seppic公司)制备后注射免疫；实验组，在三次免疫的过程中，每次免疫均为dna疫苗(每种质粒均免疫1mg) 亚单位疫苗(每种蛋白均免疫500μg)。
免疫程序：实验猪于4周龄进行免疫，总免疫次数为3次，每次间隔14d，免疫量如上表所示，将疫苗通过多点注射的方式进行免疫，分为颈部斜方肌、股四头肌和耳后皮下注射，每个部位注射1/3剂量的疫苗。每次免疫后2周抽血，收集血液中的外周血淋巴细胞以及血清，外周血淋巴细胞用于elispot实验，血清用于特异性抗体和中和抗体检测。
4.2、elisa检测p54蛋白抗体水平
血清的采集于处理：在采血前8小时内禁止喂食，采集首免后2周、4周及6周的血清，通过猪前腔静脉采血10ml，置于37℃恒温培养箱中，静置2h析出血清，后转移至4℃，自然沉降3～4h，750g离心20min，将血清分装于无菌ep管中，置于-80℃冻存备用。
elisa检测p54抗体：采用武汉科前生物股份有限公司生产的非洲猪瘟间接elisa抗体检测试剂盒进行检测。操作步骤按说明书进行。结果判读依据为：将酶标仪测量波长设置为630nm，10min内读取数据。结果判定，试验成立标准是阳性对照孔od630nm值均应≥1.0，阴性对照孔od630nm值均应≤0.2。成立后计算样品s/p值。
若s/p≥0.25，结果判定为非洲猪瘟病毒抗体阳性；
若s/p＜0.25，结果判定为非洲猪瘟病毒抗体阴性。
结果如图14所示。从图14可以看出，非洲猪瘟病毒p54抗体呈阴性。
4.3、ifa验证各蛋白的特异性抗体
本试验使用的血清为各组首免后42天时采集的血清。
ifa验证各蛋白在动物体内抗体产生情况：将构建完成的pcaggs-p30、pcaggs-p54、pcaggs-p72、pcaggs-b602l四个质粒，分别转染293t细胞，转染步骤参考实施例2的2.5部分。转染36h之后，将各组血清(1:200稀释后)作为一抗，将兔抗猪fitc荧光二抗(1:500稀释后)作为二抗。结果如图15所示。
ifa验证p72与b602l共转染步骤：设置两个试验组，组一为pcaggs-p72和pcaggs-b602l质粒共转染组，组内的p72质粒转染剂量一致，b602l质粒转染剂量设置梯度，分别设置为0.1倍(0.05μg)、0.4倍(0.2μg)、原剂量1.0倍(0.5μg)进行转染；组二为pcaggs-b602l质粒单转染组(未转染pcaggs-p72)，转染剂量同上。转染后于36h，使用“双加强组”动物血清(1:200稀释后)作为一抗，将兔抗猪fitc荧光二抗(1:500稀释后)作为二抗。结果如图16所示。
4.4、外周血淋巴细胞ifn-γelispot测定
猪外周血淋巴细胞(pbmc)的分离：通过前腔静脉无菌采集血液2.5ml于肝素钠抗凝管中，立即摇晃混匀。将抗凝血与等量3％胎牛血清pbs缓冲液混匀，以提高分离效果，降低细胞凝聚效应。取等体积的淋巴细胞分离液(5ml)，置于无菌15ml离心管中，将稀释后的抗凝血液平铺于分离液之上。于室温条件下，800g水平离心机离心20min。此时离心管中分为4层，最上层为血浆层，第2层为乳白色的淋巴细胞层，第3层为分离液，第4层为红细胞，使用移液枪小心吸取第二层细胞加入到新15ml离心管中，添加5ml3％胎牛血清pbs缓冲液洗涤细胞，250g离心10min。弃去上层pbs缓冲液，使用3ml红细胞裂解液重悬，并静置10min。于室温条件下，250g离心5min，使用3％胎牛血清pbs重悬并吹打洗涤细胞。弃去上层pbs缓冲液，使用10mlrpmi-1640培养基(购于sigma-aldrich公司)重悬并进行细胞计数。使用4％台盼蓝与等量分离细胞混合均匀，静置2min后镜检，此时活细胞不着色，死细胞染成蓝色，要求细胞活率95％以上。
刺激剂准备：多肽合成，使用http://www.cbs.dtu.dk/services/网站(cbs预测服务器)对p30、p54、p72和b602l等4个基因的蛋白序列进行分析，依据神经网络计算出能与mhci类分子相结合的t细胞表位，依据计算结果，择优选取了13条肽段，每条肽段的大小均为14aa，肽段信息如下：
表4：
elispot实验：从密封的包装中将elispot板取出，使用无菌pbs洗涤板孔，200μl/孔，洗涤4次。使用完全培养基孵育elispot板，含有10％血清的rpim-1640培养基，100μl/孔，孵育30min。将上述步骤的培养液弃掉，将与刺激剂预混好的细胞悬液加入板中，每孔含有细胞数量在40万至60万之间，在37℃二氧化碳培养箱中培育12～48h，当捕获抗体捕获足够的ifn-γ后，一般32h后，即可开始检测斑点。将细胞从板中移除，使用pbs溶液洗板5次，200μl/孔。将检测抗体(p2c11-biotin)稀释至0.5μg/ml(使用含有0.5％小牛血清的pbs进行稀释)，每孔添加100ul，置于室温下作用2h。使用pbs溶液洗板5次，200μl/孔。稀释链酶亲和素-alp(1:1000稀释)，使用含有0.5％小牛血清的pbs进行稀释)，每孔添加100μl，置于室温下作用1h。使用pbs溶液洗板5次，200μl/孔。使用0.45μm的滤膜将(bcip/nbt-plus)溶液过滤，并每孔添加100μl，直至斑点出现。使用大量水进行冲洗，停止斑点颜色反应。避光将板在晾干，在显微镜下或者elispot读板仪器上进行计数。实验结果如图17所示。从图17可以看出，针对免疫的4个asfv抗原蛋白设计合成的肽段，在免疫后产生了差异显著的ifn-γ刺激效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>华南农业大学
<120>非洲猪瘟p30、p54、p72和b602l的dna疫苗和亚单位疫苗及其制备方法与应用
<160>41
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>585
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<223>asfvp30原始序列
<400>1
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1.一种非洲猪瘟p30、p54、p72和b602l的dna疫苗和亚单位疫苗，其特征在于，所述的dna疫苗包括编码非洲猪瘟病毒p30、p54、p72和b602l蛋白的四个重组pcaggs真核表达质粒；所述的亚单位疫苗包括利用重组杆状病毒表达系统的三个蛋白：单独表达的非洲猪瘟病毒p30蛋白、非洲猪瘟病毒p54蛋白，联合表达的非洲猪瘟病毒p72蛋白和非洲猪瘟病毒b602l蛋白，以及药学上可以接受的佐剂。
2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟p30、p54、p72和b602l的dna疫苗和亚单位疫苗，其特征在于，
构建重组pcaggs表达质粒过程中，对非洲猪瘟病毒各蛋白的基因进行猪源密码子优化：
所述的非洲猪瘟病毒p30基因的核苷酸序列如seqidno.5所示；
所述的非洲猪瘟病毒p54基因的核苷酸序列如seqidno.6所示；
所述的非洲猪瘟病毒p72基因的核苷酸序列如seqidno.7所示；
所述的非洲猪瘟病毒b602l基因的核苷酸序列如seqidno.8所示；
构建重组杆状病毒过程中，对非洲猪瘟病毒各蛋白的基因进行昆虫细胞密码子优化：
编码所述的非洲猪瘟病毒p30蛋白的核苷酸序列如seqidno.9所示；
编码所述的非洲猪瘟病毒p54蛋白的核苷酸序列如seqidno.10所示；
编码所述的非洲猪瘟病毒p72蛋白的核苷酸序列如seqidno.11所示；
编码所述的非洲猪瘟病毒b602l蛋白的核苷酸序列如seqidno.12所示。
3.根据权利要求1所述的非洲猪瘟p30、p54、p72和b602l的dna疫苗和亚单位疫苗，其特征在于，所述的药学上可以接受的佐剂包括水包油包水佐剂。
4.权利要求1-3任一所述的非洲猪瘟p30、p54、p72和b602l的dna疫苗和亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)dna疫苗的制备：
将非洲猪瘟p30、p54、p72和b602l基因分别与pcaggs空载体连接，得到连接产物，将连接产物转化、筛选，分别得到重组质粒pcaggs-p30、pcaggs-p54、pcaggs-p72和pcaggs-b602l，加入佐剂，即得非洲猪瘟p30、p54、p72和b602l的dna疫苗；
所述的用于扩增上述目的基因的引物分别如pca-p30-f、pca-p30-r、pca-p54-f、pca-p54-r、pca-p72-f、pca-p72-r、pca-b602l-f和pca-b602l-r所示；
(2)亚单位疫苗的制备：
1)将编码所述的非洲猪瘟p30、p54蛋白的核苷酸序列分别克隆入pacebac1质粒构建重组表达载体pacebac1-p30和pacebac1-p54；
2)先将编码所述的非洲猪瘟p72蛋白的核苷酸序列克隆入pfastbacdual载体构建重组载体pfastbacdual-p72，再将编码所述的非洲猪瘟b602l蛋白的核苷酸序列克隆入重组载体pfastbacdual-p72构建得到重组表达载体pfastbacdual-p72-b602l；
3)分别将上述重组表达载体pacebac1-p30、pacebac1-p54和pfastbacdual-p72-b602l转入昆虫-杆状病毒表达系统进行蛋白表达，然后加入佐剂，即得非洲猪瘟p30、p54、p72和b602l的亚单位疫苗。
5.根据权利要求4所述的非洲猪瘟p30、p54、p72和b602l的dna疫苗和亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述的构建重组表达载体的具体步骤为：针对编码所述的非洲猪瘟p30、p54、p72和b602l蛋白的核苷酸序列，通过设计引物进行pcr，然后分别进行如下操作：
s1.分别将非洲猪瘟p30、p54基因和pacebac1质粒载体双酶切后构建得到重组表达载体pacebac1-p30和pacebac1-p54；
s2.将非洲猪瘟p72基因片段双酶切后与pfastbacdual载体连接，构建得到pfastbacdual-p72重组载体，然后将非洲猪瘟b602l基因片段双酶切后与pfastbacdual-p72重组载体连接构建得到pfastbacdual-p72-b602l重组表达载体；
其中，所述的引物如bac-p30-f(his)、bac-p30-r(his)、bac-p54-f(his)、bac-p54-r(his)、bac-p72-f(his)、bac-p72-r(his)、bac-b602l-f(flag)和bac-b602l-r(his)所示。
6.根据权利要求5所述的非洲猪瘟p30、p54、p72和b602l的dna疫苗和亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述的用于双酶切非洲猪瘟p30、p54基因和pacebac1载体的酶均为bamhl和hindiii限制性内切酶；
所述的用于双酶切非洲猪瘟p72基因和pfastbacdual载体的酶均为xhol和kpnl限制性内切酶；
所述的用于双酶切b602l基因和pfastbacdual-p72重组载体的酶均为bamhl和ecori限制性内切酶。
7.权利要求1-3任一所述的非洲猪瘟p30、p54、p72和b602l的dna疫苗和亚单位疫苗在预防非洲猪瘟病毒引起的猪相关疾病中的应用。
技术总结