本发明涉及纳米药物技术领域，尤其涉及一种细菌外膜囊泡、包含该细菌外膜囊泡的通用纳米疫苗及其制备方法和应用。
背景技术：
近年来随着分子生物学和肿瘤免疫学的发展，肿瘤免疫治疗成为继手术、化疗、放疗和分子靶向治疗后最具潜力的肿瘤治疗手段。肿瘤免疫治疗是通过重新启动并维持免疫系统对肿瘤的识别监视，恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法，主要包括免疫检查点抑制剂、肿瘤疫苗、细胞治疗和细胞因子治疗等。近几年，肿瘤免疫治疗飞速发展，目前已在多种肿瘤如黑色素瘤，非小细胞肺癌、肾癌和前列腺癌等的治疗中展示出了强大的抗肿瘤活性，多个肿瘤免疫治疗药物已经获得美国fda(foodanddrugadministration,fda)批准临床应用，如免疫检查点抗体和car-t等。肿瘤免疫治疗由于其卓越的疗效和创新性，在2013年被《科学》杂志评为年度最重要的科学突破。
作为免疫治疗的一种，肿瘤疫苗是近年来的研究热点。根据功能不同，肿瘤疫苗可分为预防性疫苗和治疗性疫苗。预防性肿瘤疫苗，实际上是针对致癌性病毒的疫苗，如宫颈癌疫苗，能够有效预防hpv相关的宫颈疾病。本项目中的肿瘤疫苗主要是指治疗性疫苗：将肿瘤细胞内基因突变产生的新生抗原以多种形式，如细胞裂解物、抗原蛋白或多肽、表达肿瘤抗原的dna或者mrna等，与免疫佐剂联合一起接种至患者体内，通过激活免疫系统对肿瘤抗原的识别、处理、和递呈，诱导机体产生对这些抗原的特异性免疫反应，从而达到控制或清除肿瘤的目的。2010年，首个肿瘤治疗性疫苗—，首个肿瘤治疗性疫苗抗原疫苗(provenge)被美国fda批准用于治疗前列腺癌。近十年来，伴随着二代测序、基因组学、大数据等领域的技术进步，人们对于肿瘤抗原的鉴定能力不断提高，为肿瘤疫苗的飞速发展奠定了基础。2017年，来自美国dana-farber癌症中心和德国美因茨大学的两个研究团队在个体化肿瘤疫苗领域取得重大突破，两个项目都是首先对肿瘤组织样本进行取样测序，并分别使用独特算法预测了最可能的肿瘤抗原，然后分别开发出了以多肽片段和mrna为基础的肿瘤疫苗，在晚期黑色素瘤患者中展示出令人振奋的治疗效果。总之，肿瘤抗原的鉴定已经不是制约肿瘤疫苗发展的障碍，如何提高抗原的免疫原性，从而刺激机体产生强烈有效的抗肿瘤免疫应答，成为了肿瘤疫苗领域的新热点。
借助于纳米技术，将抗原和佐剂与纳米载体偶联在一起共递送，利用dc细胞对颗粒物的天然摄取习性，提高免疫系统对抗原的摄取、处理和递呈能力，能够有效提高抗原的免疫原性。2016年，moon等人设计了一种基于脂质双分子层的纳米盘疫苗载体，具有高效引流淋巴结的能力，被用于共同递送多种肿瘤抗原和佐剂，刺激产生了强烈的抗原特异性t细胞免疫应答和抗肿瘤效应。2017年，chen等人将抗原和佐剂与evansblue(eb)连接，利用eb能够特异结合白蛋白，而白蛋白具有淋巴结引流的特性，实现了利用白蛋白作为“火车头”将抗原和佐剂共递送至淋巴结的目的。2018年，mooney等人设计了一种pei包被的介孔硅棒疫苗载体用于共同递送肿瘤抗原和佐剂，该载体能显著增强宿主dc细胞活化并激活t细胞免疫反应。2019年，florindo等人开发了甘露糖修饰的plga纳米肿瘤疫苗载体，联合免疫检查点阻断剂α米肿瘤疫、免疫激活剂α免疫激活和mdscs小分子抑制剂伊鲁替尼(ibrutinib)对黑色素瘤的生长、转移、复发都具有显著的抑制作用。纵观近几年肿瘤疫苗载体设计，这些载体都需要复杂的合成过程和佐剂修饰，开发一种能够大批量快速获取同时本身具有佐剂效应的纳米疫苗载体，是肿瘤疫苗发展的迫切需求。
近年来，基于天然生物膜的仿生纳米材料越来越受到研究者的关注。由于继承了天然生物膜表面的蛋白和完整的磷脂双分子层结构，这些仿生生物膜纳米材料具备了特殊的功能，如配体识别、生物靶向、长循环性等。其中，来源于细菌的细菌外膜囊泡(outermembranevesicle,omv)是一种特殊的天然纳米颗粒，由革兰氏阴性细菌分泌，粒径约30-200nm，是细菌新陈代谢过程的重要途径，能够通过细菌发酵大批量获取。由于革兰氏阴性菌的外膜含有大量的脂多糖(lipopolysaccharide,lps)，因此omv具有天然的免疫佐剂功能，能够有效激活天然免疫；其纳米尺寸和外源身份，使dc细胞能够快速识别并大量摄取，提高了抗原的处理和递呈效率，增强机体对抗原的免疫应答能力。尽管omv的免疫原性限制了其作为药物载体的应用，但是这种免疫激活能力使其成为理想的疫苗载体。目前已经有许多研究报道，omv可以直接作为疫苗，引起机体对omv来源细菌的特异性免疫，如基于omv的b群脑膜炎球菌疫苗menzb使新西兰流脑的发生率和病死率得到了有效控制，这也说明了omv体内应用的安全性和有效性。关于将omv的免疫刺激功能用于肿瘤免疫治疗的研究还很少，目前只有一篇来自韩国课题组的报道，利用大肠杆菌来源的omv刺激产生的天然免疫应答，能够明显抑制肿瘤生长，但是这一研究并没有涉及肿瘤抗原和特异性免疫。如何将omv作为疫苗载体，在其表面展示肿瘤抗原，从而在omv刺激天然免疫的基础上进一步实现肿瘤抗原递呈和特异性抗肿瘤免疫，是目前仍未解决的科学问题。
技术实现要素：
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种细菌外膜囊泡、包含该细菌外膜囊泡的通用纳米疫苗及其制备方法和应用。本发明通过在细菌外膜囊泡上表达分子胶水蛋白spycatcher和snoopcatcher作为肿瘤疫苗平台，可以任意组装携带有相应标签的不同肿瘤类型的抗原得到纳米疫苗，可以在提高抗原的利用度的同时，还能显著刺激机体产生抗原特异免疫反应，增强对肿瘤的杀伤效果。
第一方面，本发明提供一种细菌外膜囊泡，所述细菌外膜囊泡包含分子胶水蛋白spycatcher和/或snoopcatcher。
进一步地，所述分子胶水蛋白和所述细菌外膜囊泡上的细菌外膜蛋白融合表达于所述细菌外膜囊泡中；
所述细菌外膜蛋白为clya、血红蛋白蛋白酶、细菌外膜蛋白a、细菌外膜蛋白c或细菌外膜蛋白f中的一种或多种，优选为clya。
本发明进一步提供所述细菌外膜囊泡作为疫苗佐剂的应用。
第二方面，本发明提供一种通用纳米疫苗，所述通用纳米疫苗包含所述细菌外膜囊泡，以及和所述细菌外膜囊泡以异肽键或共价键-异肽键形式连接的抗原，所述抗原携带spytag和/或snooptag。
spytag和snooptag可以通过tag和catcher间的反应将抗原和细菌外膜囊泡连接在一起，该反应形成异肽键。
进一步地，
所述spytag包含如下氨基酸序列：
缬氨酸-脯氨酸-苏氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-甲硫氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-丙氨酸-酪氨酸-赖氨酸-精氨酸-酪氨酸-赖氨酸，
所述snooptag包含如下氨基酸序列：
甘氨酸-赖氨酸-亮氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-天冬酰胺-赖氨酸-甘氨酸-酪氨酸。
更进一步，所述通过固相合成将spytag和snooptag分别与抗原通过酰胺键连接在一起。
进一步地，所述肿瘤疫苗的粒径为20～40nm，该范围内的纳米颗粒稳定，具有淋巴结富集作用，并且有利于抗原递呈细胞摄取，可以提高抗原和佐剂的靶向性和生物利用度。
进一步地，所述抗原为肿瘤特异性抗原，优选为黑色素瘤、肺癌、结肠癌或脑胶质瘤的特异性抗原。所述肿瘤特异性抗原为mhci限制性抗原，该种抗原与mhci分子形成复合物后将抗原信息传递给t细胞，激活抗原特异性cd8 t细胞。
第三方面，本发明提供所述通用纳米疫苗的制备方法，包括：
将spycatcher蛋白和snoopcatcher蛋白的编码基因通过基因重组的方式和clya蛋白的编码基因重组后，在革兰氏阴性菌中融合表达得到细菌外膜囊泡；
将携带有spytag和/或snooptag的抗原和所述细菌外膜囊泡混合。
进一步地，所述抗原和所述细菌外膜囊泡的质量比为1:1～4。
进一步地，所述革兰氏阴性菌为肠道沙门氏菌、脑膜炎奈瑟菌、鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏杆菌、大肠杆菌、霍乱弧菌等；优选为大肠杆菌。
作为一种优选的具体实施方式，本发明提供一种通用纳米疫苗的制备方法，包括：
(1)利用基因工程的方法设计融合有spycatcher和snoopcatcher蛋白的质粒，获得质粒petduet-clya-spycatcher-clya-snoopcatcher；
(2)将质粒petduet-clya-spycatcher-clya-snoopcatcher导入rosetta(de3)感受态大肠杆菌，加入诱导剂进行诱导表达，低速离心收集菌液，通过滤膜和超滤管对菌液进行浓缩和纯化，超速离心后去除上清，在超离管内再次加入pbs重悬后超离，最后去除上清，用pbs重悬沉淀即为所需的clya-catchersomv；
(3)通过固相合成的方法将肿瘤抗原肽分别偶联到spytag和snooptag，将spytag-抗原和snooptag-抗原按一定的蛋白比例加入到clya-catchersomv中，得到纳米疫苗。
进一步地，所述诱导剂为iptg，诱导最佳浓度为1mm；
进一步地，所述低速离心转数为5000rpm，离心5-10min；
进一步地，所述滤膜孔径为0.45μm和0.22μm；
进一步地，所述超滤管的截留分子量为50kda，在超滤前将细菌培养基过0.45μm滤膜，超滤结束后再过0.22μm滤膜；
进一步地，所述超速离心所用转数为150000g，离心时间为3h；
进一步地，所述将spytag-抗原和snooptag-抗原按一定的蛋白比例加入到clya-catchersomv中，其中，所述比例为1:1～4。
目前存在的肿瘤抗原尺寸都很小，直接经过皮下免疫后大多数肿瘤抗原随着血液循环富集到肝肾快速被代谢，并且可溶性的肿瘤抗原相比于颗粒状纳米疫苗更不易被抗原递呈细胞所摄取，因此，本发明利用基因工程的办法将两对分子胶水clya-spycatcher和clya-snoopcatcher与细菌上的clya蛋白进行融合表达，通过超速离心和纯化后获得clya-catchersomv，其上的两对分子胶水可高效且特异地与带有spytag和snooptag的抗原进行反应，即可将抗原灵活且快速展示在omv上。所得到的抗原-omv疫苗制剂生物相容性好，稳定，可高效引流至淋巴结，omv本身即可诱导机体产生固有免疫，所插入的抗原在被抗原递呈细胞摄取后提呈给相应免疫细胞后即可产生抗原特异免疫反应，可以有效抑制肿瘤的肺转移，具有良好的抑瘤效果。另外，本发明通过固相合成或者重组融合表达的技术即可快速合成带有spytag和snooptag的抗原库，从抗原库取出标签-抗原肽后即可和clya-catchersomv快速反应获得针对不同个体的个性化疫苗制剂。
本发明提供带有分子胶水的clya-catchersomv平台和带有分子胶水相应标签的抗原肽库，在温和的反应条件下(室温、ph7.4)即可实现分子胶水的反应，即实现抗原装载到疫苗载体上，根据肿瘤抗原的多样性本发明所设计的标签抗原也丰富多样，可以很好的实现个性化疫苗的设计。本发明组装得到的纳米疫苗具有omv刺激固有免疫的性能，载带抗原后还能刺激机体产生抗原特异免疫反应，纳米疫苗可以实现淋巴结高效富集，并且还能增加抗原递呈细胞对疫苗的摄取，有效提高抗原的递呈效率。该制剂可以通过刺激机体固有免疫和抗原特异免疫反应从而实现对肿瘤的双重打击，达到高效抑制肿瘤甚至清除肿瘤的目的。
本发明具备如下有益效果：
本发明的肿瘤疫苗平台及制备得到的纳米疫苗相容性好，毒副作用低，具有很好的淋巴结富集和抗原递呈细胞增强摄取的性能，疫苗载体平台本身即可促进机体产生固有免疫，具有一定杀伤肿瘤的能力，本发明通过分子胶水技术将肿瘤抗原连接到疫苗载体上，可以进一步提高抗原的利用度的同时，还能显著刺激机体产生抗原特异免疫反应，增强对肿瘤的杀伤效果。本发明利用基于omv的疫苗平台展示了一系列小鼠肿瘤抗原，获得了良好的抗原特异性t淋巴细胞介导的抗肿瘤免疫反应。这种生物工程的omv系统能够同时展示多种肿瘤抗原，此方法在开发针对复杂多样肿瘤抗原的个性化肿瘤疫苗方面具有广阔应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的omv纳米疫苗搭载抗原前后的表征；其中，a为omv纳米疫苗平台的电镜和粒径表征，标尺为100nm；b为omv纳米疫苗平台载带抗原后的电镜和粒径表征，标尺为100nm；
图2为本发明实施例2提供的检测的omv纳米疫苗和携带标签抗原是否能连接的结果；其中，a为spycatcher和spytag的蛋白免疫印迹条带结果，b为snoopcatcher和snooptag的蛋白免疫印迹条带结果，a和b中的cnomv为clya蛋白未进行改造的对照组，c为免疫胶体金电镜结果，其中靠左两个箭头为5nm金颗粒，靠右箭头为10nm金颗粒，标尺为20nm；
图3为本发明实施例3提供的验证omv可以刺激dc成熟的成熟度检测结果，检测标志物为cd11c、cd80和cd86，其中spt为spytag的缩写；
图4为本发明实施例3提供的验证omv是否可以被dc细胞摄取后进行抗原递呈的检测结果；其中，a为流式检测结果，b为共聚焦检测结果；
图5为本发明实施例4提供的验证抗原与疫苗载体连接的必要性的检测结果；其中，a为通过激光共聚焦检测cy5.5荧光被dc细胞摄取情况，b为活体注射不同药物制剂后，通过小动物成像系统检测cy5.5荧光在小鼠各脏器的分布情况；
图6为本发明实施例5提供的小鼠皮下免疫cc-snt-tpr2omv后的内脏变化情况，其中a为小鼠肺部转移灶照片，b为小鼠脾脏细胞再次接受抗原肽trp2刺激后的免疫斑点变化情况统计；
图7为本发明实施例5提供的小鼠皮下免疫cc-spt-oti/cc-snt-otiiomv后的内脏变化情况；其中a为小鼠肺部转移灶照片，a中oti为ova257-264的缩写，otii为ova323-339的缩写，b为在皮下免疫cc-spt-oti/cc-snt-otiiomv后小鼠脾脏细胞再次接受抗原肽oti和otii刺激后，流式检测cd3 cd8 ifn抗原细胞比例变化情况，c为皮下免疫cc-spt-oti/cc-snt-otiiomv后小鼠脾脏细胞再次接受抗原肽oti和otii刺激后，流式检测cd3 cd4 ifn， 细胞比例变化情况；
图8为本发明实施例5提供的小鼠皮下免疫cc-spt-oti/cc-snt-trp2omv后小鼠内脏变化情况；其中，a为小鼠肺部转移灶照片，a中oti为ova257-264的缩写，b为皮下免疫cc-spt-oti/cc-snt-trp2omv后小鼠脾脏细胞再次接受抗原肽oti和trp2刺激后的免疫斑点变化情况统计；
图9为本发明实施例5提供的小鼠皮下结肠癌(mc38)模型的肿瘤生长曲线；
图10为本发明实施例5提供的皮下结肠癌模型的各类免疫细胞在肿瘤组织中的浸润情况；
图11为本发明实施例6提供的验证纳米疫苗的免疫记忆效应检测结果；其中，a为小鼠免疫60天时小鼠脾脏中免疫记忆t细胞含量统计(cd3 cd8 cd44l cd62-)，b为小鼠免疫后接种b16-ova肿瘤细胞后肺部转移灶情况。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
在本实施例中，通过以下方法构建omv纳米疫苗平台和标签抗原库，所述方法为：
选用markhowarth等，proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica,2012,109(12):4347-4348和proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica,2016,113(5):1202-1207提供的分子胶水spycatcher、spytag和snoopcatcher、snooptag，通过基因工程的方法将spycatcher和snoopcatcher与clya蛋白的c端进行融合表达，构建质粒petduet-clya-spycatcher-clya-snoopcatcher，之后将该质粒转化进rosetta(de3)，在1mmiptg诱导剂作用下表达目的蛋白。通过超滤、超离的方式分离纯化omv。其中spycatcher可以特异与spytag(缬氨酸-脯氨酸-苏氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-甲硫氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-丙氨酸-酪氨酸-赖氨酸-精氨酸-酪氨酸-赖氨酸)发生特异反应形成稳定共价键-异肽键。snoopcatcher和snooptag(甘氨酸-赖氨酸-亮氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-天冬酰胺-赖氨酸-甘氨酸-酪氨酸)可以产生特异反应形成异肽键。具体地，spycatcher上带有赖氨酸，与其对应的spytag上的天冬氨酸反应形成异肽键；snoopcatcher上带有天冬酰胺，与其对应的snooptag上的赖氨酸反应形成异肽键。
1、omv纳米疫苗平台的获取过程如下：
1.1设计合成质粒petduet-clya-spycatcher-clya-snoopcatcher，将其导入rosetta(de3)感受态细胞，具体导入过程如下：
(1)从-80℃冰箱取出rosetta(de3)感受态细胞(100μl)放在冰上融化；
(2)加入50ng质粒后轻弹混匀，在冰上静置30min；
(3)将上述感受态细胞放入42℃水浴锅中热激70s，然后迅速放回冰上至少2min，随后加入额外900μl的lb培养基，并将其放于37℃培养箱中，设定转速为180rpm，孵育45min；
(4)取出上述处理后的细菌，取50μl均匀涂抹在加有氨苄青霉素的lb估体培养基中进行筛选，放置在37℃培养箱中培养过夜，第二天挑单菌落。
1.2对菌种进行扩大培养并冻存，在扩大培养至od＝0.6-1.0时，加入1mmiptg诱导菌体表达clya-catchers蛋白，在恒温摇床内培养，设定摇床转速为160rpm，温度为16℃，培养时间为16h；
1.3后续操作全部在冰上或者4℃环境中进行，步骤1.2的菌液通过低速离心收集上清液，5000rpm离心10min，收集上清，上清过0.45μm滤膜，将滤液分批加入到50kda的超滤管中进行超滤，收集滤芯内液体，将其过0.22μm滤膜后装填至超离管；
1.4将步骤1.3的产物装入超离管进行超离，超离转速设定为150000g，时间为3h，超离结束后再次加入pbs重悬底部沉淀，用pbs装满超离管后再次超离，去除上清后加入少量pbs重悬底部沉淀，最终获得omv纳米疫苗平台，即clya-catchersomv；
2、标签抗原库的制备过程如下：
2.1用于合成抗原肽库的氨基酸的末端氨基均由fmoc(笏甲氧羰基)保护，氨基酸均购自吉尔生化(上海)有限公司。
2.2使抗原肽(例如：ova257-264(siinfekl))羧基末端氨基酸的羧基与clear-酰胺树脂(引入clear-酰胺树脂的目的是将氨基酸的羧基末端固定，以便使其氨基端发生反应)的氨基末端连接，通过20％哌啶/n,n-二甲基甲酰胺脱去该氨基酸上的fmoc保护基以暴露出氨基，然后以此结合在树脂上的氨基酸作为氨基组分，同过量的含活化羧基的下一个氨基酸反应接长肽链，重复上述操作直至所有的氨基酸缩合完毕，形成带有标签的抗原肽链。
2.3用高浓度三氟乙酸的二氯甲烷溶液将肽链从树脂上裂解下来，肽链片段中的boc保护基团也将同时除去，经过纯化等处理，即得到标签的抗原肽链。
利用透射电镜(美国fei，tecnaig220s-twin，200kv)和激光粒度仪(英国malvern,zetasizernanozs90)对得到的omv纳米疫苗平台和标签抗原库进行形态以及粒径表征，如图1所示，图1中a为omv纳米疫苗平台的透射电镜图，从图中可以看出，制备得到的omv纳米疫苗平台呈球形，颗粒大小较均一，粒径分布为20-40nm，平均粒径约为30nm，分散指数(pdi)为0.27；图1中的b为制备得到的omv纳米疫苗平台载带抗原所拍电镜图，粒径形貌基本没有因为添加抗原而改变，同样也是呈球形，平均粒径约为30nm，分散指数(pdi)为0.25。
实施例2
本实施例目的在于验证标签和omv疫苗平台可以稳定连接。
为了检测标签与相应分子胶水蛋白结合，本实施例在spytag和snooptag分别偶联上一段ha多肽(ypydvpdya)，ha标签可以通过蛋白免疫印迹的方法进行检测，由于这段标签分子量小，只有在与相应的分子胶水spycatcher和snoopcatcher蛋白连接后才能在约为45kda的位置被检测到。本实施例通过检测ha标签的位置来判断catcher和tag之间的反应是否产生。在50μgspytag-ha或snooptag-ha中分别加入0，10，20，30，40μgclya-catchersomv，室温反应半小时后，加入蛋白上样缓冲液使蛋白变性(100变处理10min)。通过sds-page电泳，转膜后孵育ha标签抗体，孵育二抗后加入显影液检测条带位置。图2中的a显示，在加入spytag-ha多肽后，45kda处可以明显检测到条带，说明spytag可以结合上clya-catchersomv上。图2中的b为加入snooptag-ha多肽后，在45kda处可以明显检测到条带，说明snooptag可以结合上clya-catchersomv上。
本实施例进一步利用免疫胶体金技术检测上述spycatcher和snoopcatcher是否同时存在一个omv上，具体为利用5nm金颗粒修饰spytag，利用10nm金颗粒修饰snooptag，与clya-catchersomv室温反应30min后，通过透射电镜观察金颗粒的分布情况，如图2中的c所示，在一个omv上同时存在两种大小的金颗粒。
实施例3
本实施例目的在于测定纳米疫苗平台及其药物组合可以有效刺激dc成熟，并且实现抗原递呈，可作为dc疫苗的潜在刺激剂。
本实施例通过固相合成合成带有ova抗原肽的标签模式抗原，即spytag-ova。与clya-cathcersomv混合后制备获得纳米疫苗制剂(cc-spytag-ovaomv)。在体外，本实施例通过提取小鼠大腿骨髓来源细胞，通过gm-csf和il-4协同刺激诱导骨髓来源细胞分化为树突状细胞(dc细胞)，加入cc-spt-ovaomv及其他对照组对dc细胞进行刺激，通过流式细胞术和激光共聚焦来检测dc细胞的成熟情况和抗原递呈情况。如图3所示，加入omv可以有效刺激dc细胞成熟，dc细胞成熟标志物明显上调。图4中的a和b分别是流式检测和激光共聚焦检测cc-spt-ovaomv被dc细胞递呈抗原的情况，结果显示spt-ova cnomv(cnomv即clya蛋白未进行改造的对照组)的抗原几乎不能被dc递呈抗原，但是cc-spt-ovaomv可以被dc摄取并呈递抗原。以上两个实验说明cc-spt-ovaomv不仅能刺激dc成熟，而且还能被dc细胞摄取并递呈抗原。
实施例4
本实施例目的在于说明抗原和疫苗载体连接的必要性。
在实施例3中制备的spt-ova多肽进一步偶联上荧光分子cy5.5，与clya-catchersomv混合后，一方面在体外将纳米疫苗加入到dc细胞中，通过激光共聚焦检测摄取情况；另一方面将纳米疫苗经皮下注射入小鼠体内，在不同时间点取出小鼠各脏器和组织，利用小动物成像系统进行成像，观测荧光分布情况。图5中的a为体外细胞共聚焦结果(共孵育12h)，可以看出单独的抗原肽组和将抗原肽偶联在omv组能够被dc细胞摄取。图5中的b为纳米疫苗在各脏器内的分布情况(皮下注射12h)，结果显示只有在抗原和omv偶联后才能有效引流淋巴结。以上结果说明抗原与omv偶联后才能有效被dc摄取，在淋巴结内富集。
实施例5
本实施例的目的在于验证纳米疫苗的抗肿瘤普适性。
本实施例利用实施例1中建立的标签抗原库，以及疫苗平台的优势(灵活、快速插入抗原)，通过更换插入的肿瘤抗原验证纳米疫苗平台对肿瘤的抑制效果。
图6的动物模型选择的是黑色素瘤模型，在第0天尾静脉接种2尾静脉1×105个b16-f10肿瘤细胞，在第3、6、11天时对小鼠进行皮下免疫，在第17天时进行疗效和免疫分析。图6中的a为插入trp2抗原后抑制b16-f10肿瘤的照片，图6中的b为治疗后脾脏细胞免疫斑点的统计结果，以上结果可以看出抗原和佐剂通过免疫载体共递送可以有效抑制肺转移，并且有效激发抗原特异性免疫反应。
图7的动物模型选择的是黑色素瘤模型，在第0天尾静脉接种2尾静脉1×105个b16-ova细胞，在第3、7天时皮下免疫纳米疫苗，在第17天时进行疗效和免疫分析。图7中a为插入两种ova抗原表位的肺转移照片，图7中的b和c分别为流式检测脾脏细胞再次接受抗原刺激后，抗原特异性细胞cd3 cd8 ifn流 细胞和cd3 cd4 ifn流 细胞的比例变化情况统计。从结果可以看出本发明所设计的纳米疫苗载带同一种抗原的两个表位可以同时激发两种抗原表位所对应的免疫细胞，并且具有协同抗肿瘤的效果。
图8的动物模型选择的是黑色素瘤模型，在第0天尾静脉接种2尾静脉1×105个b16-ova细胞，在第3、7天时皮下免疫纳米疫苗，在第17天时进行疗效和免疫分析。图8中的a为插入两种mhci递呈的抗原肽(ova257-264和trp2)的肺转移照片，图8中的b为治疗后脾脏细胞再次接受抗原刺激后，ifnγ阳性免疫斑点的个数统计。从结果可以看出本发明所设计的纳米疫苗载带同一种递呈分子两种抗原肽可以进一步激发抗原特异免疫反应，有较好的协同效果。
图9的动物模型选择的是结肠癌皮下模型，在第0天皮下接种1×106个mc38细胞，mc38的抗原肽为adpgk，所用的标签为spytag，在第3、7和11天时皮下免疫各种疫苗(saline，poly(i:c) spt-adpgk，cnomv spt-adpgk，cc-spt-adpgkomv)，当小鼠肿瘤体积达到50mm3时记录肿瘤体积，并绘制小鼠肿瘤生长曲线(图9)，结果表明纳米疫苗cc-spt-adpgkomv能够显著抑制mc38肿瘤的生长。在第29天时进行疗效和免疫分析。在第29天时用流式细胞术分析小鼠肿瘤组织中各种免疫细胞浸润情况(图10)，可以看出clya-catchersomv在携带抗原adpgk后可以诱导cd3 ,cd3 cd4 和cd3 cd8 t细胞在肿瘤组织内富集，并且能降低免疫抑制细胞treg细胞(cd3 cd4 foxp3 )在肿瘤组织内的比例。本发明的纳米疫苗平台在和相应的抗原结合后得到的纳米疫苗的免疫治疗效果显著，具有很好的应用前景。
实施例6
本实施例的目的在于验证纳米疫苗的免疫记忆效应。
本实施例在健康小鼠上接种不同的制剂(saline，poly(i:c) spt-ova，cnomv spt-ova，cc-spt-ovaomv)，免疫三次(1，4，8天)后，在第60天分析小鼠脾脏和血液中记忆t细胞的含量。同时在第60天时尾静脉接种b16-ova细胞，在第80天时检测小鼠肺转移情况。图11中的a为小鼠免疫60天后血液中免疫记忆t细胞的含量变化，图11中的b为小鼠免疫后接种b16-ova肿瘤细胞后肺部转移灶情况。从结果可以看出小鼠接种纳米疫苗(cc-spt-ovaomv组)能够有效刺激机体产生免疫记忆效应，在血液和脾脏中的记忆t细胞相比其它组都有显著提高，随后肺转移照片可以看出，纳米疫苗能够有效抑制b16-ova的肺部转移灶生成，具有预防肿瘤生成的功能。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
1.一种细菌外膜囊泡，其特征在于，所述细菌外膜囊泡包含分子胶水蛋白spycatcher和/或snoopcatcher。
2.根据权利要求1所述的细菌外膜囊泡，其特征在于，所述分子胶水蛋白和所述细菌外膜囊泡上的细菌外膜蛋白融合表达于所述细菌外膜囊泡中；
所述细菌外膜蛋白为clya、血红蛋白蛋白酶、细菌外膜蛋白a、细菌外膜蛋白c或细菌外膜蛋白f中的一种或多种，优选为clya。
3.权利要求1或2所述细菌外膜囊泡作为疫苗佐剂的应用。
4.一种通用纳米疫苗，其特征在于，所述通用纳米疫苗包含权利要求1或2所述细菌外膜囊泡，以及和所述细菌外膜囊泡以异肽键或共价键-异肽键形式连接的抗原，所述抗原携带spytag和/或snooptag。
5.根据权利要求4所述的通用纳米疫苗，其特征在于，所述spytag包含如下氨基酸序列：
缬氨酸-脯氨酸-苏氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-甲硫氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-丙氨酸-酪氨酸-赖氨酸-精氨酸-酪氨酸-赖氨酸，和/或，
所述snooptag包含如下氨基酸序列：
甘氨酸-赖氨酸-亮氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-天冬酰胺-赖氨酸-甘氨酸-酪氨酸。
6.根据权利要求4所述的通用纳米疫苗，其特征在于，所述肿瘤疫苗的粒径为20～40nm。
7.根据权利要求4-6任一项所述的通用纳米疫苗，其特征在于，所述抗原为肿瘤特异性抗原，优选为黑色素瘤、肺癌、结肠癌或脑胶质瘤的特异性抗原。
8.权利要求4-7任一项所述通用纳米疫苗的制备方法，其特征在于，包括：
将spycatcher蛋白和snoopcatcher蛋白的编码基因通过基因重组的方式和clya蛋白的编码基因重组后，在革兰氏阴性菌中融合表达得到细菌外膜囊泡；
将携带有spytag和/或snooptag的抗原和所述细菌外膜囊泡混合。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述抗原和所述细菌外膜囊泡的质量比为1:1～4。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述革兰氏阴性菌为肠道沙门氏菌、脑膜炎奈瑟菌、鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏杆菌、大肠杆菌或霍乱弧菌中的一种或多种；优选为大肠杆菌。
技术总结