本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及一种sph-ru-mmt@pz纳米抗菌剂及其制备方法和应用。
背景技术：
每年细菌性疾病威胁着数百万患者的健康和生命，抗生素治疗感染性病原体疾病是目前最普遍的方法。传统的抗生素通过阻止细胞复制、修复、蛋白质合成和细胞壁更新等细胞过程来选择性抑制或杀死微生物细胞。多年来，致病细菌通过突变或从其他生物体获得抗药性基因，已对几乎所有类型的传统抗生素产生了抗药性。但是，由于缺乏直观的结果，抗生素的治疗效果无法及时反馈，这很容易导致药物过量使用。
光动力抗菌疗法是传统抗生素的有效替代品。适当的波长照射下，激发态的光敏剂处于三重态，与基态的分子氧反应生成激发态的单重态氧，从而可以氧化生物有机分子。光动力抗菌疗法不易引起耐药性，但缺乏靶向性。如何将光敏剂近距离转运到细菌细胞膜上，并使光敏剂有效产生ros是提升抗菌活性的最关键问题。
基于上述内容，提出一种sph-ru-mmt@pz纳米抗菌剂及其制备方法和应用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种sph-ru-mmt@pz纳米抗菌剂及其制备方法和应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明提供了一种sph-ru-mmt@pz纳米抗菌剂，包括纳米颗粒sph-ru-mmt@pz，所述纳米颗粒sph-ru-mmt@pz为将蒙脱石mmt和光敏剂酞菁锌pz依次加载至纳米钌配合物颗粒sph-ru上所获得，所述纳米颗粒sph-ru-mmt@pz的直径为85～155nm。
本发明还提供了一种sph-ru-mmt@pz纳米抗菌剂在抗大肠杆菌领域中的应用。
作为上述发明的进一步优化方案，所述sph-ru-mmt@pz纳米抗菌剂抗大肠杆菌的条件为红外光照射。
本发明还提供了一种纳米颗粒sph-ru-mmt的制备方法，包括以下步骤：
(1)将[ru(bpy)2cl2]和dppz溶于乙醇溶液中，向该溶液中滴加聚苯乙烯悬浮液，剧烈混合得到混合物，混合物经过加热、回流、冷却、沉淀、离心洗涤、烘干后，获得纳米钌配合物颗粒sph-ru；
(2)将蒙脱石mmt与乙醇溶液混合，向该溶液中加入十六烷基三甲基溴化十六烷基铵ctab得到混合物，经过搅拌、冷凝回流、离心洗涤，得到沉淀物，沉淀物溶于水中得到储备溶液一；
(3)将(2)中所述储备溶液一与硅烷偶联剂kh-550混合，加入乙醇形成混合物，调节混合物ph至酸性，经过加热、冷却、离心洗涤后，将得到的物质悬浮在去离子水中获得悬浮液二；
(4)将所述纳米钌配合物颗粒sph-ru溶解于去离子水后溶液和(3)中所述悬浮液二混合，搅拌后进行过滤，收集滤液，滤液经过离心洗涤、烘干，获得纳米颗粒sph-ru-mmt；
(5)将光敏剂酞菁锌pz溶于氢氟酸溶液中，向该溶液中加入所述纳米颗粒sph-ru-mmt溶解于去离子水后的溶液得到混合物，调节混合物的ph至碱性，过滤混合物收集滤液，滤液经过离心洗涤、烘干后，获得纳米颗粒sph-ru-mmt@pz。
作为上述发明的进一步优化方案，所述步骤(1)中纳米钌配合物颗粒sph-ru的直径为5～25nm。
作为上述发明的进一步优化方案，所述步骤(3)中采用hcl将混合物ph调节至3～4。
作为上述发明的进一步优化方案，所述步骤(4)中纳米颗粒sph-ru-mmt的直径为75～135nm。
作为上述发明的进一步优化方案，所述步骤(5)中混合物过滤前步骤具体为：使用超声波浴将光敏剂酞菁锌pz和氢氟酸完全溶解，将sph-ru-mmt在去离子水中的超声波浴溶解20～30min，在室温下于黑暗中搅拌2～3h后添加到光敏剂酞菁锌pz和氢氟酸混合溶液中，采用naoh将混合物ph调节至7～8。
作为上述发明的进一步优化方案，所述步骤(4)和步骤(5)中过滤均采用0.45μm的膜滤器过滤。
作为上述发明的进一步优化方案，所述步骤(1)至步骤(5)中离心洗涤的次数为至少三次，离心转速为3000～5000rpm，离心时间为3～5min。
本发明的有益效果在于：本发明将mmt加载到sph-ru纳米颗粒上，将其锚定在大肠杆菌膜的外表面上，并且膜锚定功能性光敏剂光敏剂酞菁锌pz用670nm近红外nir光照射，会通过产生活性氧ros破坏细菌的结构，从而导致大肠杆菌裂解，sph-ru-mmt@pz纳米抗菌剂具有靶向细胞膜能力，有效提高抗菌活性；细菌裂解后，sph-ru-mmt@pz与受损细菌的生物分子结合，sph-ru发出强烈的红色荧光，更重要的是，sph-ru-mmt@pz对完整细胞膜的活大肠杆菌无反应，但选择性染色并在早期细胞膜损伤以及晚期细胞核暴露期间显示荧光，能细菌死亡时能观察到红色荧光，有效避免药物的过量使用。
附图说明
图1为对比例1制备所得sph-ru的tem；
图2为对比例2制备所得sph-ru-mmt的tem；
图3为实施例1制备所得sph-ru-mmt@pz纳米抗菌剂的tem；
图4为对比例1制备所得sph-ru、对比例2制备所得sph-ru-mmt以及实施例1制备所得sph-ru-mmt@pz的红外光谱图；
图5为对比例1制备所得sph-ru、对比例2制备所得sph-ru-mmt以及实施例1制备所得sph-ru-mmt@pz的zeta电位图。
图6为实施例1制备所得sph-ru-mmt@pz的最小抑菌浓度测定mic图。
图7为sph-ru-mmt@pz与大肠杆菌的荧光效应图。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
本发明一种sph-ru-mmt@pz纳米抗菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将[ru(bpy)2cl2]0.27g～2.7g和dppz0.15g～1.5g溶于8.0～20ml乙醇溶液，乙醇溶液中乙醇和水的体积比为3：1，放入三颈烧瓶中，滴加500～1500μl聚苯乙烯悬浮液，剧烈混合得到混合物，将该混合物在氩气下于100～110℃加热至回流10～12h，将反应混合物冷却至室温，得到黄色溶液，并使用旋转蒸发仪除去溶剂，通过添加nh4pf6水溶液使络合物沉淀，使用80khz超声浴将固体悬浮在乙醇中3min，用四氢呋喃离心洗涤以除去聚苯乙烯，最后用去离子水离心洗涤，除去溶剂烘干，得到5～25nm直径的纳米钌配合物颗粒sph-ru。
(2)在锥形瓶中将1.0～5.0g蒙脱石mmt与2.0～6.0ml水和2.0～6.0ml乙醇混合，然后，加入2.0～5.0g十六烷基三甲基溴化十六烷基铵ctab得到混合物，搅拌反应，然后使用回流冷凝器加热至60～70℃保持1～2h，将反应混合物离心，用去离子水离心洗涤，再用乙醇离心洗涤，将得到的沉淀物溶解在去离子水中，并作为储备溶液一。
(3)将储备溶液一与5.0～10ml的硅烷偶联剂kh-550在锥形瓶中混合，并加入5.0～10ml乙醇形成混合物，用hcl将混合物ph调节至3～4，并将混合物加热至55～65℃保持3～4h，冷却后，将反应混合物用去离子水离心洗涤，然后将反应混合物悬浮在去离子水中以获得悬浮液二。
(4)将5.0～10mg纳米钌配合物颗粒sph-ru在5～10ml去离子水中超声溶解30min，然后和2.0～4.0ml悬浮液二混合，并在烧杯中于室温搅拌3～4h，通过0.45μm的膜滤器过滤混浊的溶液，并收集滤液，用去离子水离心洗涤，除去溶剂烘干，得到75～135nm直径的纳米颗粒sph-ru-mmt。
(5)使用超声波浴将2.0～4.0mg光敏剂酞菁锌pz和3.0～6.0ml氢氟酸完全溶解在烧杯中，将5.0～10mgsph-ru-mmt在5.0～10ml去离子水中的超声波浴溶解20～30min，在室温下于黑暗中搅拌2～3h后添加到烧杯中得到混合物，用naoh将得到混合物ph调节至7～8，使用0.45μm的膜滤器过滤所得混合物，滤液用去离子水离心洗涤，除去溶剂烘干，得到85～155nm直径的纳米颗粒sph-ru-mmt@pz。
上述步骤中离心洗涤均为至少三次，离心转速为3000～5000rpm，离心时间为3～5min。
实施例1
(1)将0.27g[ru(bpy)2cl2]和0.15gdppz溶于8.0ml乙醇溶液放入三颈烧瓶中，滴加500μl聚苯乙烯悬浮液，剧烈混合得到混合物，将该混合物在氩气下于100℃加热至回流10h，将反应混合物冷却至室温，得到黄色溶液，并使用旋转蒸发仪除去溶剂，通过添加nh4pf6水溶液使络合物沉淀，使用80khz超声浴将固体悬浮在乙醇中3min，用四氢呋喃离心洗涤以除去聚苯乙烯，最后用去离子水离心洗涤，除去溶剂烘干，得到纳米钌配合物颗粒sph-ru。
(2)在锥形瓶中将1.0g蒙脱石mmt与6.0ml水和6.0ml乙醇混合，然后，加入3.0g十六烷基三甲基溴化十六烷基铵ctab得到混合物，搅拌反应，然后使用回流冷凝器加热至70℃保持2h，将反应混合物离心，用去离子水离心洗涤，再用乙醇离心洗涤，将得到的沉淀物溶解在去离子水中，并作为储备溶液一。
(3)将储备溶液一与5.0ml的硅烷偶联剂kh-550在锥形瓶中混合，并加入5.0ml乙醇形成混合物，用物质的量浓度为3mol/l的hcl将混合物ph调节至4，并将混合物加热至65℃保持4h，冷却后，将反应混合物用去离子水离心洗涤，然后将反应混合物悬浮在去离子水中以获得悬浮液二。
(4)将5.0mg纳米钌配合物颗粒sph-ru在5ml去离子水中超声溶解30min，然后和2.0ml悬浮液二混合，并在烧杯中于室温搅拌4h，通过0.45μm的膜滤器过滤混浊的溶液，并收集滤液，用去离子水离心洗涤，除去溶剂烘干，得到纳米颗粒sph-ru-mmt。
(5)使用超声波浴将2.0mg光敏剂酞菁锌pz和3.0ml氢氟酸完全溶解在烧杯中，将5.0mgsph-ru-mmt在5.0ml去离子水中的超声波浴溶解30min，在室温下于黑暗中搅拌3h后添加到烧杯中得到混合物，用物质的量浓度为0.1mol/lnaoh将得到混合物ph调节至7，使用0.45μm的膜滤器过滤所得混合物，滤液用去离子水离心洗涤，除去溶剂烘干，得到纳米颗粒sph-ru-mmt@pz。
实施例1所制备的sph-ru-mmt@pz如图3所示，平均直径为85～155nm。
对比例1
将0.27g[ru(bpy)2cl2]和0.15gdppz溶于8.0ml乙醇溶液放入三颈烧瓶中，滴加500μl聚苯乙烯悬浮液，剧烈混合得到混合物，将该混合物在氩气下于100℃加热至回流10h，将反应混合物冷却至室温，得到黄色溶液，并使用旋转蒸发仪除去溶剂，通过添加nh4pf6水溶液使络合物沉淀，使用80khz超声浴将固体悬浮在乙醇中3min，用四氢呋喃离心洗涤以除去聚苯乙烯，最后用去离子水离心洗涤，除去溶剂烘干，得到纳米钌配合物颗粒sph-ru。
对比例1所制备的sph-ru如图1所示，平均直径为15～20nm。
对比例2
(1)将0.27g[ru(bpy)2cl2]和0.15gdppz溶于8.0ml乙醇溶液放入三颈烧瓶中，滴加500μl聚苯乙烯悬浮液，剧烈混合得到混合物，将该混合物在氩气下于100℃加热至回流10h，将反应混合物冷却至室温，得到黄色溶液，并使用旋转蒸发仪除去溶剂，通过添加nh4pf6水溶液使络合物沉淀，使用80khz超声浴将固体悬浮在乙醇中3min，用四氢呋喃离心洗涤以除去聚苯乙烯，最后用去离子水离心洗涤，除去溶剂烘干，得到纳米钌配合物颗粒sph-ru。
(2)在锥形瓶中将1.0g蒙脱石mmt与6.0ml水和6.0ml乙醇混合，然后，加入3.0g十六烷基三甲基溴化十六烷基铵ctab得到混合物，搅拌反应，然后使用回流冷凝器加热至70℃保持2h，将反应混合物离心，用去离子水离心洗涤，再用乙醇离心洗涤，将得到的沉淀物溶解在去离子水中，并作为储备溶液一。
(3)将储备溶液一与5.0ml的硅烷偶联剂kh-550在锥形瓶中混合，并加入5.0ml乙醇形成混合物，用物质的量浓度为3mol/l的hcl将混合物ph调节至4，并将混合物加热至65℃保持4h，冷却后，将反应混合物用去离子水离心洗涤，然后将反应混合物悬浮在去离子水中以获得悬浮液二。
(4)将5.0mg纳米钌配合物颗粒sph-ru在5ml去离子水中超声溶解30min，然后和2.0ml悬浮液二混合，并在烧杯中于室温搅拌4h，通过0.45μm的膜滤器过滤混浊的溶液，并收集滤液，用去离子水离心洗涤，除去溶剂烘干，得到纳米颗粒sph-ru-mmt。
对比例2所制备的sph-ru-mmt如图2所示，平均直径为75～135nm。
图4为对比例1制备所得sph-ru、对比例2制备所得sph-ru-mmt以及实施例1制备所得sph-ru-mmt@pz的红外光谱图，红外光谱分析表明：所有runp样品均在1653cm-1处显示吡啶环峰，此外，在709cm-1处的sph-ru峰发生了蓝移，表明复合药物加载系统更稳定。
图5为对比例1制备所得sph-ru、对比例2制备所得sph-ru-mmt以及实施例1制备所得sph-ru-mmt@pz的zeta电位图，结果表明，溶解在去离子水中的sph-ru的zeta电位为8.0±0.2mv，当带负电的mmt包裹在sph-ru周围时，sph-ru-mmt的表面带负电，并且ζ电位降至-12.2±0.5mv，随着带正电的pz进一步被吸附，电势升至-6.1±0.2mv，在每个步骤中都观察到zeta电位的这些变化，表明mmt的成功封装和pz的完全修饰。
图6为实施例1制备所得sph-ru-mmt@pz的最小抑菌浓度测定mic图，结果表明：经过红外照射的sph-ru-mmt@pz的mic明显变小，抑菌能力显著增强，sph-ru-mmt@pz纳米抗菌剂对大肠杆菌e.coli的最小抑菌浓度为3.3±0.21μg/ml。
图7为sph-ru-mmt@pz与大肠杆菌的荧光效应，三种runps在大肠杆菌中孵育后，未观察到荧光，滴加溶菌酶lzm，然后再孵育30分钟，如果在紫外光下观察到，则会产生红色荧光；在sph-ru-mmt@pz ir组中，与大肠杆菌孵育12小时后，在紫外线下可以观察到强烈的红色荧光。该结果表明，sph-ru-mmt@pz ir处理对大肠杆菌的作用与溶菌酶处理相同，两者均会破坏细胞壁，导致细胞裂解，裂解液中的dna随后与sph-ru结合，并且恢复了由sph-ru淬灭的荧光。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
1.一种sph-ru-mmt@pz纳米抗菌剂，其特征在于，包括纳米颗粒sph-ru-mmt@pz，所述纳米颗粒sph-ru-mmt@pz为将蒙脱石mmt和光敏剂酞菁锌pz依次加载至纳米钌配合物颗粒sph-ru上所获得，所述纳米颗粒sph-ru-mmt@pz的直径为85～155nm。
2.一种如权利要求1所述的sph-ru-mmt@pz纳米抗菌剂在抗大肠杆菌领域中的应用。
3.根据权利要求2所述的一种sph-ru-mmt@pz纳米抗菌剂在抗大肠杆菌领域中的应用，其特征在于，所述sph-ru-mmt@pz纳米抗菌剂抗大肠杆菌的条件为红外光ir照射。
4.一种如权利要求1所述的sph-ru-mmt@pz纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将[ru(bpy)2cl2]和dppz溶于乙醇溶液中，向该溶液中滴加聚苯乙烯悬浮液，剧烈混合得到混合物，混合物经过加热、回流、冷却、沉淀、离心洗涤、烘干后，获得纳米钌配合物颗粒sph-ru；
(2)将蒙脱石mmt与乙醇溶液混合，向该溶液中加入十六烷基三甲基溴化十六烷基铵ctab得到混合物，经过搅拌、冷凝回流、离心洗涤，得到沉淀物，沉淀物溶于水中得到储备溶液一；
(3)将(2)中所述储备溶液一与硅烷偶联剂kh-550混合，加入乙醇形成混合物，调节混合物ph至酸性，经过加热、冷却、离心洗涤后，将得到的物质悬浮在去离子水中获得悬浮液二；
(4)将所述纳米钌配合物颗粒sph-ru溶解于去离子水后溶液和(3)中所述悬浮液二混合，搅拌后进行过滤，收集滤液，滤液经过离心洗涤、烘干，获得纳米颗粒sph-ru-mmt；
(5)将光敏剂酞菁锌pz溶于氢氟酸溶液中，向该溶液中加入所述纳米颗粒sph-ru-mmt溶解于去离子水后的溶液得到混合物，调节混合物的ph至碱性，过滤混合物收集滤液，滤液经过离心洗涤、烘干后，获得纳米颗粒sph-ru-mmt@pz。
5.根据权利要求4所述的一种纳米钌配合物颗粒sph-ru的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中纳米钌配合物颗粒sph-ru的直径为5～25nm。
6.根据权利要求4所述的一种纳米钌配合物颗粒sph-ru的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中采用hcl将混合物ph调节至3～4。
7.根据权利要求4所述的一种sph-ru-mmt@pz纳米抗菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中纳米颗粒sph-ru-mmt的直径为75～135nm。
8.根据权利要求4所述的一种sph-ru-mmt@pz纳米抗菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中混合物过滤前步骤具体为：使用超声波浴将光敏剂酞菁锌pz和氢氟酸完全溶解，将sph-ru-mmt在去离子水中的超声波浴溶解20～30min，在室温下于黑暗中搅拌2～3h后添加到光敏剂酞菁锌pz和氢氟酸混合溶液中，采用naoh将混合物ph调节至7～8。
9.根据权利要求4所述的一种sph-ru-mmt@pz纳米抗菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)和步骤(5)中过滤均采用0.45μm的膜滤器过滤。
10.根据权利要求4所述的一种sph-ru-mmt@pz纳米抗菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)至步骤(5)中离心洗涤的次数为至少三次，离心转速为3000～5000rpm，离心时间为3～5min。
技术总结