本发明涉及凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisproteins,iaps)的新用途,涉及凋亡抑制蛋白作为治疗药物靶点的应用。
背景技术:
肝纤维化是病毒性肝炎、酒精滥用、非酒精性脂肪肝、胆汁淤积、自身免疫性肝炎、药物或遗传等多种因素引起的慢性肝病的共同病理学基础,是肝硬化形成的早期阶段和必经病理阶段(batallerr,brennerda.2005)。流行病学资料表明,我国约3亿人患有病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病和酒精性肝炎。部分慢性肝病患者如未进行有效治疗,可进展为肝硬化,导致并发急性/慢性肝衰竭和肝细胞癌的风险显著增加(wangfs,fanjg,etal.2014)。
肝纤维化是一个慢性的炎症病理过程,在肝脏持续受到各种致病因子刺激时发生的反复损伤修复反应(pellicoroa,ramachandranp,etal.2014)。虽然不同的损伤因素诱导肝纤维化发生的病理生理过程、参与的细胞因子存在不同程度差异,但其中肝星状细(hepaticstellatecells,hscs)活化和细胞外基质蛋白(extracellularmatrixproteins,ecm)的过度积累是纤维形成的两个关键环节,是其共同病理生理过程。活化的hscs具有强大的增殖性、收缩性和纤维生成的表型,随着hscs数量的增加和ecm的过度分泌,导致过量的纤维基质沉积(hendersonnc,iredalejp.2007)。ecm合成和降解由基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,mmps)和基质金属蛋白酶抑制剂(tissueinhibitorsofmetalloproteinase,timps)共同调节。mmps促进ecm的降解,而timps可通过抑制mmps酶原的活化来阻止ecm降解(iredalejp,thompsona,etal.2013)。由此可见,hscs是肝纤维化过程中的主要效应细胞,ecm是肝纤维化发生的分子基础,诱导活化的hscs凋亡和ecm降解是治疗肝纤维化的重要研究方向。
目前研究表明,肝纤维化是一个可逆转的过程,早期对肝纤维化进行干预,可以减缓、停止或逆转纤维化进程,控制疾病进展,改善预后(campanal,iredalejp.2017)。近年来,随着纤维化相关研究大量涌现,我们对肝纤维化发病机理的理解取得了巨大进展,新的抗纤维化治疗在实验和临床中都有诸多尝试,但基本问题仍未解决,切实有效的治疗方法仍未找到(leeya,wallacemc,etal.2015)。因此,探讨肝纤维化逆转的分子机制和开发特效的抗肝纤维化药物对于慢性肝病的治疗具有重要的临床意义。
凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisproteins,iaps)是一类高度保守的内源性抗细胞凋亡分子家族,在哺乳动物中共发现有8个iaps,其中常见的有细胞凋亡抑制蛋白1(ciap1,birc2)、ciap2(birc3)、xiap等,均表达于肝组织(estornesy,bertrandmj.2015)。ciap1、ciap2皆是通过先与caspase结合后,再通过ring结构域泛素化和降解caspase-3/8发挥抑制凋亡作用,xiap是通过与caspases结合后直接抑制caspase-3/7/9活性发挥抗凋亡作用(saleemm,qadirmi,etal.2013)。第二线粒体衍生的caspase激活剂(secondmitochondria-derivedactivatorofcaspase,smac),是细胞凋亡过程中线粒体释放的内源性iap拮抗剂,通过阻断iap对caspases的抑制,促进细胞凋亡(martinez-ruizg,maldonadov,etal.2008)。模拟iaps和smac结合相互作用的小分子被称为“smac类似物”,可以抑制iaps,导致caspases活化(fuldas.2015)。
人类多种疾病的发生发展与iaps的表达异常相关,开发其针对性的靶向药物是近年来医学研究的一个热门方向。目前已经开发了多种smac类似物,正在临床研究及临床前研究中进行评估,包括lcl-161、gdc-0152、cucd-427、birinapant、at406、debio1143、hgs1029、apg-1387。在癌症中,包括鼻咽癌、乳腺癌、肾细胞癌、肺癌、肝癌等,多个smac类似物作为潜在的癌症治疗药物在早期临床试验中进行评估(fuldas,vucicd.2012;fuldas.2015)。在hbv感染中,ciaps限制了感染肝细胞的死亡,允许病毒持续存在;而smac类似物birinapant可以拮抗ciaps来消除乙肝病毒(ebertg,etal.2015)。在肺纤维化中,转化生长因子(tgf-β)处理后可上调成纤维细胞和纤维细胞中iaps的表达,人ipf纤维灶中xiap高表达,且smac类似物at406可通过促进间充质细胞的凋亡来改善博莱霉素诱导的肺纤维化(ashleysl,sissonth,etal.2016)。apg-1387是一种二价smac类似物,体内体外均能有效抑制iaps分子,已被证明在癌症中具有显著的抗肿瘤活性(lin,fengl,etal.2016;chenz,chenj,etal.2018),并具有清除乙肝病毒的能力,目前正在临床试验中。
目前,尚未有实验研究结果表明iap分子与肝纤维化/硬化相关,更未有相关实验予以证明。
技术实现要素:
本发明的目的在于提供凋亡抑制蛋白(iap)用于制备治疗肝纤维化或肝硬化的药物的用途。
根据本发明所述的用途的进一步特征,所述的药物是抑制iap分子的靶向药物。
本发明的实验表明,在人肝组织中,iap基因,尤其是birc2、birc3在肝纤维化/硬化组织中表达升高,并与肝纤维化/硬化严重程度呈正相关关系;在动物模型中,使用smac类似物抑制iaps分子后可减缓肝纤维化或肝硬化的进程,具有很好的治疗作用。因此,可以将凋亡抑制蛋白(iap)作为肝纤维化或肝硬化的治疗药物靶点,用于制备治疗肝纤维化或肝硬化的药物,尤其是制备抑制iap分子的靶向药物。
附图说明
图1:在组织芯片显示肝脏疾病中iaps分子表达情况。与无肝硬化的肝血管瘤病人的肝组织相比较,肝硬化病人肝组织中肝细胞内ciap1(a、b)、ciap2(c、d)蛋白水平均高表达(*,p<0.05;****,p<0.0001)。
图2:在慢乙肝病人中,肝组织中iaps基因与肝脏炎症分级、纤维化分期的相关性。birc3与肝脏炎症分级正相关(c),birc2、xiap与肝脏炎症分级无明显相关性(a、e)。birc2、birc3基因的rna水平与肝纤维化分期呈正相关(b、d),相关性系数分别是r2=0.0968、r2=0.2459,xiap表达与纤维化分期无明显相关(f)。
图3:小鼠模型中smac类似物抑制iaps,可减轻肝纤维化严重程度。在四氯化碳(ccl4)诱导的小鼠纤维化模型中,smac类似物apg-1387靶向抑制ciap1、ciap2(c),并可显著抑制肝脏胶原沉积(siriusred)、纤维形成(massonstain),以及肝星状细胞的激活指标α-sma蛋白表达(a&b)(*,p<0.05)。
图4:smac类似物增强活化的hscs凋亡。在ccl4诱导的小鼠纤维化模型中,smac类似物apg-1387诱导活化的肝星状细胞凋亡(a);在tgf-β诱导活化的人肝星状细胞系lx-2中,apg-1387诱导细胞凋亡(b),同时影响lx-2活力(c)(*,p<0.05)。
图5:smac类似物上调mmp9,逆转mmp9/timp1失衡,降解ecm。在ccl4诱导的小鼠纤维化模型中,smac类似物apg-1387上调mmp9rna表达,抑制timp1rna,以逆转mmp9/timp1失衡(a);smac类似物apg-1387显著上调mmp9蛋白水平(b)(*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001)。
具体实施方式
下面通过具体实施例结合所附的附图,进一步详细说明本发明的技术方案。
1、肝硬化肝组织中iaps分子高表达。
选用人肝脏疾病谱的肝组织芯片,购买自西安艾丽娜生物科技有限公司,选择肝脏多病理类型组织芯片(货号:lv1201a),才用免疫组化的方法检测肝组织芯片中ciap1、ciap2蛋白的表达情况,由病理医生进行阅片并出具染色结果报告。其中肝血管瘤组织n=10例、肝硬化组织n=30例,比较两组染色强度(图1)。从图1可知,实验结果显示,ciap1、ciap2分子主要定位于肝细胞(a、c);相较于无纤维化的肝血管瘤组织,肝硬化组织中ciap1、ciap2均显著高表达,有统计学差异(b、d)。
2、慢乙肝病人中birc2、birc3水平与肝组织纤维化分级正相关。
为了探讨iaps在肝纤维化中的潜在作用,我们对基因表达综合数据库的一系列数据(gse65359)进行了分析。该数据为83名慢性乙型肝炎患者肝活检的标本,进行了肝内转录组微阵列分析。肝活检标本的肝脏炎症分级、纤维化分期根据scheuerg/s评分系统进行评分。分析主要的iap基因,包括birc2、birc3、xiap,与肝脏炎症活动度(g)、纤维化程度(s)之间的相关性(图2)。
从图2中可知,在慢性乙型肝炎患者中,与肝脏炎症活动度的相关系分析显示,birc3与其有正相关(r2=0.3538),birc2、xiap却没有此种相关性(a、c、e)。birc2、birc3基因表达与肝脏纤维化分期呈正相关关系,相关系数分别为r2=0.0968、r2=0.2459,且有统计学差异,然而xiap与肝纤维化分期无明显相关性(b、d、f)。
3、iaps分子靶向治疗可改善小鼠肝纤维化。
小鼠肝纤维化模型:选用雄性c57bl/6j小鼠,8周龄,每组4只,建模组腹腔注射20%(v/v,橄榄油稀释)的ccl43ml/kg,每周2次;溶剂组注射橄榄油3ml/kg,每周2次。连续8周。iaps分子抑制剂选用smac类似物apg-1387,每次ccl4或溶剂注射前1小时,对小鼠进行腹腔注射apg-138710mg/kg,对照组给与0.9%nacl注射。建模和/或给药连续8周。
ccl4末次给药后24小时,异氟烷吸入麻醉,眼眶后采血获取血清标本,用于血清学检测;断颈处死后,解剖小鼠,剪取部分肝中叶组织用4%中性甲醛固定后,脱水、石蜡包埋、切片,进行组织学检测;剪取部分肝脏进行液氮冻存,以备rna、蛋白标本提取。小鼠肝组织切片进行he、siriusred、masson三色染色,以检测小鼠肝脏病理组织学改变、胶原沉积情况、纤维化严重程度;采用免疫组化及westernblot方法检测肝星状细胞活化标志物α-sma,观察肝星状细胞激活状态;另外肝组织提蛋白,用westernblot方法检测iaps分子水平(图3)。如图3所示,在ccl4诱导的小鼠纤维化模型中,smac类似物apg-1387靶向抑制ciap1、ciap2(c),并可显著抑制肝脏胶原沉积(siriusred)、纤维形成(massonstain),以及下调肝星状细胞的激活指标α-sma蛋白表达(a&b),减少肝脏纤维化形成。
4、smac类似物增强活化的肝星状细胞凋亡。
在ccl4诱导的小鼠纤维化模型中,采用免疫荧光共定位的方法检测活化星状细胞标志物α-sma与凋亡关键分子cleaved-caspase3的共定位情况。另外,选用人肝星状细胞系lx-2,用tgf-β活化后,对其进行体外smac类似物刺激,分别用apg-13870、0.02、0.2、2um的浓度进行刺激,检测cleaved-caspase3及细胞活力水平。
如图4显示,体内实验中hscs活化标志物α-sma与cleaved-caspase3共定位(a);体外高浓度apg-1387(2um)处理后lx-2凋亡增强(b),并且lx-2细胞活力减弱(c)。由此推测,smac类似物可增强活化的肝星状细胞凋亡。
5、smac类似物诱导mmp9表达上调,timp1下调,逆转mmp9/timp1轴失衡。
在ccl4诱导的小鼠纤维化模型中,小鼠肝组织提取rna,采用rt-pcr方法检测mmp9、timp1的rna水平;westernblot检测mmp9蛋白水平(图5)。如图5所示,smac类似物可诱导mmp9rna表达上调,timp1表达下调,逆转mmp9/timp1平衡(a);显著提高mmp9蛋白水平,从而降解细胞外基质,减轻纤维化程度。
综上所述,可以将凋亡抑制蛋白(iap)作为肝纤维化或肝硬化的治疗药物靶点,用于制备治疗肝纤维化或肝硬化的药物,尤其是制备抑制iap分子的靶向药物。
1.凋亡抑制蛋白(iap)用于制备治疗肝纤维化或肝硬化的药物的用途。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:所述的药物是抑制iap分子的靶向药物。
技术总结