本发明属于生物技术与药剂技术领域，尤其涉及一种硒肽及其制备方法和应用。
背景技术：
癌症是一种严重危害人们生命健康的疾病。受生活环境及不健康生活方式的影响，近年来，癌症的发病和死亡人数不断攀升，如何有效地治疗癌症一直以来都是人类重大的科学难题，也是现代医学研究的重点之一。
化疗在癌症治疗中占有重要地位，作为一种全身性的治疗手段，能够最大限度地杀死体内的肿瘤细胞，抑制肿瘤的复发和转移。传统的小分子抗癌制剂如铂类药物、紫杉醇和多柔比星等在杀死肿瘤细胞的同时，对患者的正常组织和器官也带来了很大的伤害。近年来，纳米医学的发展为肿瘤治疗带来了新的研究方向。研究表明，将毒副作用较大的抗肿瘤药物装载到纳米颗粒中形成纳米药物，可以在提高治疗效果的同时降低药物的毒副作用。然而，人体中复杂的生理屏障对纳米药物的治疗效果造成了影响，如纳米药物在血液中被快速清除、在肿瘤部分富集效率差、在肿瘤组织中渗透难及在肿瘤细胞中药物释放效率低等，这些因素阻碍了常规纳米药物的进一步临床化发展。
目前，针对肿瘤的纳米药物普遍存在代谢较快、富集效率差、难以渗透及释放效率较低的问题。如何提供一种纳米药物，能够针对人体的生理屏障进行多级次的响应，且生物相容性好、毒副作用小、对肿瘤微环境的响应灵敏度较高，已成为亟待解决的问题。
技术实现要素：
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种硒肽及其制备方法和应用，所述氧化响应硒氨基酸可以对肿瘤进行灵敏的响应，通过添加脂肪链增加了疏水性，帮助药物解聚集；所述硒肽具有肿瘤靶向功能、基质金属蛋白酶ii(mmp-2酶)响应断裂功能以及活性氧响应功能，与肿瘤治疗药物组成的自组装硒肽纳米药物具有良好的渗透性、较高的药物释放率及较强的肿瘤抑制能力，应用价值极其广泛。
为达此目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种硒肽，所述硒肽包括由n端到c端顺次连接的氧化响应单元、酶响应断裂单元和肿瘤靶向单元；
其中，所述氧化响应单元包括氧化响应硒氨基酸，所述氧化响应硒氨基酸为脂肪链-l-硒代半胱氨酸。
本发明中，通过静脉注射，肿瘤靶向单元能够靶向肿瘤细胞以及肿瘤组织新生血管表面的整合素(αvβ3)，显著提高药物在肿瘤部位的富集；在药物到达肿瘤组织后，肿瘤组织中过量表达的mmp-2酶能够切断硒肽中的酶响应断裂单元，导致药物的水合粒径变小，有利于渗透到肿瘤组织深处；药物通过胞吞作用进入肿瘤细胞后，肿瘤细胞内高表达的活性氧能够氧化氧化响应单元中的氧化响应硒氨基酸，使其疏水性发生变化，导致内部药物解聚集，释放抗肿瘤药物，实现肿瘤治疗的目的。通过上述肿瘤靶向单元、酶响应断裂单元和氧化响应单元的相互配合，所述硒肽可以帮助药物对肿瘤产生更好的治疗效果，且在正常细胞中摄取的药物水平相比于肿瘤细胞有较大降低，能够有效降低药物对正常组织和器官的毒副作用。
优选地，所述脂肪链-l-硒代半胱氨酸中的脂肪链包括饱和烃基链和/或不饱和烃基链，优选为饱和烃基链。
优选地，所述脂肪链包括直链脂肪链、支链脂肪链或环链脂肪链中的任意一种或至少两种的组合，例如可以是直链脂肪链或支链脂肪链和环链脂肪链的组合，优选为直链脂肪链。
优选地，所述脂肪链中的碳原子数为1～18的整数，例如可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18。
优选地，所述脂肪链为c6、c12或c18中的任意一种饱和直链脂肪链。
优选地，所述脂肪链-l-硒代半胱氨酸包括l-sec(c6h13)-oh、l-sec(c12h25)-oh或l-sec(c18h37)-oh中的任意一种或至少两种的组合，例如可以是l-sec(c6h13)-oh或l-sec(c12h25)-oh和l-sec(c18h37)-oh的组合。
优选地，所述脂肪链-l-硒代半胱氨酸包括l-sec(c12h25)-oh，所述l-sec(c12h25)-oh的结构式如式i所示：
优选地，所述氧化响应单元中包括至少1个氧化响应硒氨基酸，氧化响应硒氨基酸的数量例如可以是1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，且所述氧化响应硒氨基酸通过连接氨基酸相连。
优选地，所述氧化响应单元中包含2个氧化响应硒氨基酸。
优选地，所述连接氨基酸的数量为1个。
优选地，所述连接氨基酸为k(赖氨酸)。
优选地，所述酶响应断裂单元包括基质金属蛋白酶ii剪切的多肽序列。
优选地，所述酶响应断裂单元的多肽序列为plgvr(脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-精氨酸)。
优选地，所述肿瘤靶向单元包括靶向肿瘤整合素的多肽序列。
优选地，所述肿瘤靶向单元的多肽序列为rgd(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)。
优选地，所述氧化响应单元、酶响应断裂单元和肿瘤靶向单元通过间隔氨基酸x1和x2相连。
优选地，所述硒肽为：
[l-sec(alkyl)-oh]-k[l-sec(alkyl)-oh]-x1-plgvr-x2-rgd，其中alkyl表示脂肪链，所述硒肽的具体结构式如式ii所示：
优选地，所述间隔氨基酸包括天然氨基酸和/或非天然氨基酸，优选为g。
优选地，所述硒肽为：
[l-sec(c12h25)-oh]-k[l-sec(c12h25)-oh]-gplgvrgrgd，具体结构式如式iii所示：
第二方面，本发明提供了一种第一方面所述的硒肽的制备方法，所述制备方法包括：
制备boc基团保护的氧化响应硒氨基酸，再通过固相合成，按照从c端到n端的方向，将氨基酸和氧化响应硒氨基酸依次偶联到树脂上，洗脱，得到所述硒肽。
本发明中，所述硒肽的制备方法为本领域常规的技术手段，技术成熟，操作简单，产率较高，相关领域的技术人员很容易掌握，可以在相关的实验室或工厂中实现生产加工，具有大规模批量生产的潜能，为相关产品的使用推广创造了条件。
优选地，所述制备boc基团保护的氧化响应硒氨基酸的方法包括：
硒粉与硼氢化钠反应得到二硒化二钠后，再与1-卤代烷烃混合反应，制备得到烷基二硒醚，再加入还原剂还原后得到烷基硒醇；
所述烷基硒醇与n-叔丁氧羰基-o-对甲苯磺酰基丝氨酸甲酯混合，得到boc基团保护的脂肪链-l-硒代半胱氨酸甲酯，脱去甲基，得到boc基团保护的脂肪链-l-硒代半胱氨酸。
优选地，所述1-卤代烷烃包括1-溴代烷烃。
优选地，所述1-溴代烷烃的碳原子数为1～18的整数，例如可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18，优选为6、12或18。
优选地，所述混合反应在油浴条件下进行。
优选地，所述油浴的温度为45～55℃，例如可以是45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃，优选为50℃。
优选地，所述混合反应的时间为10～14h，例如可以是10h、10.5h、11h、11.5h、12h、12.5h、13h、13.5h或14h，优选为12h。
优选地，所述还原剂包括硼氢化钠。
优选地，所述加入还原剂前还包括冷却的步骤。
优选地，所述还原的时间为25～35min，例如可以是25min、26min、27min、28min、29min、30min、31min、32min、33min、34min或35min，优选为30min。
优选地，所述混合的时间为5～7h，例如可以是5h、5.5h、6h、6.5h或7h，优选为6h。
优选地，所述脱去甲基前还包括乙酸乙酯萃取和硅胶柱层析纯化的步骤。
优选地，所述脱去甲基的方法为将反应产物置于含有氢氧化锂的溶液中搅拌。
优选地，所述搅拌的时间为55～65min，例如可以是55min、56min、57min、58min、59min、60min、61min、62min、63min、64min或65min。
优选地，所述脱去甲基后还包括乙酸乙酯萃取的步骤。
优选地，所述boc基团保护的脂肪链-l-硒代半胱氨酸的合成步骤可以由如下反应式表示：
优选地，所述固相合成的步骤包括：
溶胀树脂，脱去树脂氨基酸的fmoc基团，再将氨基酸和所述氧化响应硒氨基酸顺次偶联到树脂上。
优选地，所述溶胀树脂的步骤包括将树脂浸泡在无水dmf中，并放置在摇床上。
优选地，所述氨基酸包括fmoc基团保护的氨基酸。
优选地，所述将氨基酸偶联到树脂前还包括脱去所述氨基酸的fmoc基团的步骤。
优选地，所述将氧化响应硒氨基酸偶联到树脂前还包括脱去所述氧化响应硒氨基酸的boc基团的步骤。
作为优选技术方案，本发明所述硒肽的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)硒粉与硼氢化钠反应得到二硒化二钠后，再与碳原子数为1～18的1-溴代烷烃在45～55℃的油浴条件下混合反应10～14h，制备得到烷基二硒醚，冷却后，再加入硼氢化钠还原25～35min，得到烷基硒醇；
(2)所述烷基硒醇与n-叔丁氧羰基-o-对甲苯磺酰基丝氨酸甲酯混合5～7h后，进行乙酸乙酯萃取和硅胶柱层析纯化，得到boc基团保护的脂肪链-l-硒代半胱氨酸甲酯；
(3)再将所得boc基团保护的脂肪链-l-硒代半胱氨酸甲酯在含有氢氧化锂的溶液中搅拌55～65min，脱去甲基，乙酸乙酯萃取后，得到boc基团保护的脂肪链-l-硒代半胱氨酸；
(4)将树脂浸泡在无水dmf中，并放置在摇床上，溶胀树脂，并脱去树脂氨基酸的fmoc基团；
(5)脱去所述fmoc基团保护的氨基酸的fmoc基团，并将所得脱去了fmoc基团的氨基酸偶联到树脂上；
(6)脱去所述boc基团保护的氧化响应硒氨基酸的boc基团，并将所得脱去了boc基团的氧化响应硒氨基酸偶联到树脂上，洗脱，得到所述硒肽。
第三方面，本发明提供了一种自组装硒肽纳米药物，所述自组装硒肽纳米药物包括如第一方面所述的硒肽和抗肿瘤药物。
本发明中，所述硒肽通过肿瘤靶向单元、酶响应断裂单元和氧化响应单元的相互配合，可以帮助纳米药物在肿瘤细胞部位进行富集；到达肿瘤组织后，氧化响应单元被肿瘤过量表达的mmp-2酶切断，纳米药物的水合粒径变小，有利于纳米药物渗透到肿瘤组织的深处；肿瘤细胞内高表达的活性氧对氧化响应单元进行氧化，使硒肽的疏水性发生变化，使纳米药物解聚，释放抗肿瘤药物，对肿瘤的治疗效果更好，对正常组织和器官的毒副作用更小，应用价值更高。
优选地，所述抗肿瘤药物为疏水性药物，优选为多柔比星。
优选地，所述自组装硒肽纳米药物的水合粒径为200～250nm，例如可以是200nm、205nm、210nm、215nm、220nm、225nm、230nm、235nm、240nm、245nm或250nm。
优选地，所述自组装硒肽纳米药物在基质金属蛋白酶ii的作用下，水合粒径减小至50～150nm，例如可以是50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm或150nm。
优选地，所述自组装硒肽纳米药物在氧化条件下解组装。
优选地，所述自组装硒肽纳米药物治疗肿瘤的工作原理如图1所示。
通过静脉注射，自组装硒肽纳米药物通过硒肽中的肿瘤靶向单元靶向肿瘤细胞及肿瘤组织新生血管表面的整合素，实现药物在肿瘤部位组织的富集；肿瘤组织中过量表达的mmp-2酶对硒肽中的酶响应断裂单元进行切割，自组装硒肽纳米药物的粒径变小，渗透到肿瘤组织的深处，进而通过胞吞作用进入肿瘤细胞中；肿瘤细胞内活性氧的表达量显著提高，氧化硒肽中的脂肪链-l-硒代半胱氨酸，使其亲水性发生变化，进而导致药物的解聚，抗肿瘤药物被释放出来，对肿瘤细胞进行杀伤。正常细胞表面mmp-2酶表达量较少，细胞内的活性氧自由基含量也较少，且自组装硒肽纳米药物对其也缺少靶向富集的能力，因此对药物的摄取能力及细胞内药物的释放水平明显降低，从而达到高效低毒的治疗效果。
第四方面，本发明提供了一种如第三方面所述的自组装硒肽纳米药物的制备方法，所述制备方法包括将硒肽与抗肿瘤药物混合。
本发明中，所述硒肽中的氧化响应硒氨基酸具有较好的疏水性，有助于药物的自组装，方便药物的生产与使用，产品的粒径也更小，渗透性更好；自组装过程不产生共价键，也不存在逆反应，产率极高，也降低了生产成本；通过上述方法制备得到的自组装硒肽纳米药物稳定性较好，可在室温下稳定保存至少12h；所述制备方法简单高效，节能环保，对操作人员的技术水平要求较低，推进了纳米药物的推广与使用。
优选地，所述硒肽溶解于磷酸钠缓冲液中。
优选地，所述磷酸钠缓冲液的ph值为7.0～7.8，例如可以是7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7或7.8，优选为7.4。
优选地，所述抗肿瘤药物溶解于二氯甲烷中。
优选地，所述混合后还包括减压蒸馏去除二氯甲烷的步骤。
优选地，所述去除二氯甲烷后还包括离心的步骤。
优选地，所述离心的转速为5000～6500rpm，例如可以是5000rpm、5100rpm、5200rpm、5300rpm、5400rpm、5500rpm、5600rpm、5700rpm、5800rpm、5900rpm、6000rpm、6100rpm、6200rpm、6300rpm、6400rpm或6500rpm，优选为6000rpm。
作为优选技术方案，本发明所述自组装硒肽纳米药物的制备方法，具体包括以下步骤：
将硒肽溶解于ph值在7.0～7.8的磷酸钠缓冲液中，将抗肿瘤药物溶解于二氯甲烷中，将溶液剧烈搅拌混合，减压蒸馏去除二氯甲烷后，在5000～6500rpm下离心，上层清液即为所述自组装硒肽纳米药物。
第五方面，本发明提供了如第一方面所述的硒肽和/或第三方面所述的自组装硒肽纳米药物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明中，所述氧化响应硒氨基酸具有较好的疏水性及对氧化环境灵敏响应的能力；所述硒肽可以帮助药物在肿瘤部位富集并增加药物对肿瘤的渗透性；所述自组装硒肽纳米药物通过多级次的灵敏响应，可以有效克服人体的多层生理屏障，药物的治疗效果更优，与人体的相容性更好，对正常组织和器官的毒副作用更小，应用价值更高。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明所述脂肪链-l-硒代半胱氨酸具有灵敏的氧化响应的能力，在含有活性氧自由基的环境中可以通过改变疏水性帮助药物的释放；所述脂肪链-l-硒代半胱氨酸本身即具备较好的疏水性，有利于药物的自组装，纳米药物的粒径更小，渗透性更好；制备方法简单易行，节能环保，具有大规模生产的潜能；
(2)本发明所述硒肽通过肿瘤靶向单元、酶响应断裂单元和氧化响应单元的相互配合，可以在肿瘤部位有效富集，并通过酶响应断裂单元和氧化响应单元的依次响应，逐级减小药物的粒径，进入肿瘤组织内部才实现抗肿瘤药物的最终释放，提升药物治疗效果的同时，还减小了对正常组织和器官的毒副作用，应用价值极高；
(3)所述自组装硒肽纳米药物粒径较小，仅为240±13nm；稳定性好，在室温下至少可以在12h内维持稳定性；具有很好的肿瘤靶向能力，可以被mmp-2酶的切割后缩小粒径至100～150nm，提高了渗透能力，进而在活性氧自由基的作用下实现解聚集，促进药物的释放，实现了在肿瘤组织中的富集、渗透入肿瘤组织的深处及药物的可控性释放，有效克服了人体的生理屏障对肿瘤治疗的阻碍，实现了肿瘤的高效低毒治疗；对肿瘤细胞具有良好的杀伤能力，对mda-mb-231细胞的ic50值为1.04μmol/l，可以抑制小鼠体内肿瘤细胞的生长，效果明显；延长了药物在血液中的滞留时间，注射1h后纳米颗粒的滞留量可达54.8±7.8％，治疗效果更好，生物利用率更高；所述纳米药物通过亲疏水作用进行自组装，制备方法简单高效，药物的渗透性和与人体的相容性极好，应用前景十分广阔。
附图说明
图1为自组装硒肽纳米药物治疗肿瘤的工作原理；
图2为本发明实施例3中检测c12-硒肽的mmp-2酶响应能力的结果图片；
图3为本发明实施例5中检测c12-硒肽临界胶束浓度实验中的结果图片；
图4为本发明实施例6中测量sep/dox水合粒径的结果图片；
图5为本发明实施例6中sep/dox的透射电子显微镜图片(标尺100nm)；
图6为本发明实施例9中检测sep/dox对肿瘤的靶向性的结果图片；
图7为本发明实施例10中检测sep/dox对肿瘤细胞团簇的渗透性的结果图片(标尺100μm)；
图8为本发明实施例11中检测sep/dox对肿瘤细胞杀伤效果的结果图片；
图9为本发明实施例12中检测sep/dox对原位三阴性乳腺癌的荷瘤鼠模型的抗肿瘤效果的结果图片。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
材料：
硒粉、月桂酸、过氧化氢、三乙胺、硼氢化钠、硫酸氢钾、无水硫酸钠和哌啶购自阿拉丁(上海)有限公司；
1-溴十二烷和n-叔丁氧羰基-o-对甲苯磺酰基丝氨酸甲酯购自上海毕得医药科技有限公司；
二氯甲烷、石油醚、甲醇和乙酸乙酯购自北京现代东方精细化工有限公司；
色谱级乙腈和n,n-二甲基甲酰胺(dmf)购自天津康科德科技有限公司；
氘代氯仿(cdcl3)购自北京伊诺凯科技有限公司；
盐酸多柔比星购自上海迈瑞尔科技有限公司；
rinkamideam树脂、fmoc-氨基酸、1-羟基苯并三唑(hobt)、o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)购自吉尔生化(上海)有限公司；
三异丙基硅烷(tis)和三氟乙酸(tfa)购自麦克林(上海)有限公司；
dmem细胞培养基、胎牛血清(fbs)、胰蛋白酶购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；
cck-8细胞计数试剂购自碧云天生物技术研究所；
mmp-2酶购自近岸蛋白质科技有限公司；
mda-mb-231细胞来自于中国医学科学院基础医学研究所细胞培养中心(中国北京)；
雌性balb/c鼠及裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
实施例1
本实施例提供一种boc基团保护的c12脂肪链-l硒代半胱氨酸boc-l-sec(c12h25)-oh，所述boc-l-sec(c12h25)-oh的制备方法包括以下步骤：
取0.64g硒粉和0.60g硼氢化钠于100ml圆底烧瓶中，加入2ml水，硒粉与硼氢化钠剧烈反应，生成二硒化二钠。将圆底烧瓶用橡胶塞密封并置于50℃的油浴中搅拌。20min后，将0.95ml的1-溴十二烷与10ml四氢呋喃混合，通过注射器注入反应烧瓶中，并让反应烧瓶在50℃的油浴中继续混合反应12h。将反应瓶置于冰水浴中冷却，将2ml含有0.3g硼氢化钠的水溶液用注射器加入圆底烧瓶中，在室温下搅拌30min。
将2.74gn-叔丁氧羰基-o-对甲苯磺酰基丝氨酸甲酯溶解于10ml四氢呋喃，并与1.1ml三乙胺一同加入到上述烧瓶中，室温搅拌6h。反应结束后，减压蒸馏除去反应溶液中的四氢呋喃，并用乙酸乙酯萃取产物。所得乙酸乙酯萃取液经过无水硫酸钠干燥并减压浓缩后，采用硅胶柱层析进行纯化，淋洗液为石油醚与乙酸乙酯的体积比为4:1的混合溶液。纯化后得到的淡黄色油状液体，即为boc-l-sec(c12h25)-ome，产品质量为2.44g，产率为67％。
boc-l-sec(c12h25)-ome的核磁以及质谱表征如下：
1hnmr(400mhz,cdcl3):δ5.36(d,j＝8.1hz,1h),4.70-4.50(m,1h),3.76(s,3h),2.98(d,j＝5.2hz,2h),2.57(t,j＝7.5hz,2h),1.70-1.55(m,2h),1.45(s,9h),1.26(s,18h),0.88(t,j＝6.7hz,3h).13cnmr(101mhz,cdcl3):δ171.7,155.2,80.1,53.6,52.5,32.0,30.5,29.9,29.7(2),29.7(0),29.6(7),29.5(9),29.4,29.2,28.4,25.9,25.2,22.8,14.2.ms(esi):c21h41no4se,m/z(％):calcd.451.2(100),found474.2[m na] (100),472.2(66),475.2(32).
通过质谱可知制备得到的物质确实为boc-l-sec(c12h25)-ome，可用于boc-l-sec(c12h25)-oh的合成中。
将上述所得boc-l-sec(c12h25)-ome加入至30ml含有0.5mol/l氢氧化锂的水与1,4-二氧六环的体积比为1:1的混合液中，室温搅拌1h，脱去羧基的甲基保护。反应完成后，使用1mol/l的硫酸氢钾调节反应溶液的ph为4～5，并用乙酸乙酯进行萃取。所得乙酸乙酯萃取液经过无水硫酸钠干燥并减压浓缩后，采用硅胶柱层析进行纯化，淋洗液为乙酸乙酯。纯化后得到的淡黄色油状液体即为boc-l-sec(c12h25)-oh，产品质量为1.14g，产率为48％。
boc-l-sec(c12h25)-oh的核磁以及质谱表征如下：
1hnmr(400mhz,cdcl3):δ5.46-5.22(m,1h),4.64-4.42(m,1h),3.02(d,j＝5.2hz,2h),2.61(t,j＝7.4hz,2h),1.64(p,j＝7.2hz,2h),1.46(s,9h),1.40-1.30(m,2h),1.26(s,16h),0.88(t,j＝6.7hz,3h).13cnmr(101mhz,cdcl3):δ175.2,155.6,80.8,53.5,32.1,30.6,30.0,29.8(1),29.7(9),29.7(6),29.6(8),29.5,29.3,28.4,25.5,22.8,14.3.77senmr(76mhz,cdcl3,dimethylselenide(δ0ppm)asreference):δ131.3.ms(esi):c20h39no4se,m/z(％):calcd.437.2(100),found436.2[m-h]-(100),434.2(49),437.2(22).13cnmr(101mhz,cdcl3)δ175.2,155.6,80.8,77.5,77.2,76.8,53.5,32.1,30.6,30.0,29.8(1),29.7(9),29.7(6),29.6(8),29.5,29.3,28.4,25.6,25.4,22.8,14.3.
由质谱可知，制备得到的物质确实为boc-l-sec(c12h25)-oh，可用于硒肽的制备中。
同时，采用相同的制备方法，将硒粉替换成硫粉，制备对照分子boc-l-cys(c12h25)-oh，作为后续的实验的对照组。
boc-l-cys(c12h25)-oh的核磁以及质谱表征如下：
1hnmr(400mhz,cdcl3):δ5.37(d,j＝7.2hz1h),4.50(s,1h),3.00(d,j＝5.1hz,2h),2.56(t,j＝7.3hz,2h),1.65-1.51(m,2h),1.46(s,9h),1.40-1.30(m,2h),1.26(s,16h),0.88(t,j＝6.6hz,3h).13cnmr(101mhz,cdcl3):δ175.9,155.6,80.6,53.3,34.2,33.0,32.0,29.7(9),29.7(7),29.7(4),29.6(6),29.5,29.4,28.9,28.4,22.8,14.3.ms(esi):c20h39no4s,m/z(％):calcd.389.3,found388.2[m-h]-.
由质谱可知，制备得到的物质确实为boc-l-cys(c12h25)-oh，可用于后续对照硫肽的制备中。
实施例2
本实施例提供一种硒肽(c12-硒肽)，所述硒肽的结构式为：[l-sec(c12h25)-oh]-k[l-sec(c12h25)-oh]-gplgvrgrgd，所述硒肽通过多肽固相合成法进行合成，具体包括以下步骤：
称取300mg的rinkamideam树脂(氨基酸装载率为0.35mmol/g)于10ml多肽合成管中，向其中加入8ml无水dmf，置于摇床上过夜，使树脂充分溶胀，用吸滤泵去除dmf。
在多肽合成管中加入8ml的fmoc脱保护剂(即体积比为4:1的dmf和哌啶的混合溶液)，反应10min使树脂上的氨基酸脱去fmoc，用二氯甲烷和dmf交替洗涤3次。
取少量树脂于1ml塑料离心管中，加入茚三酮测试液(即0.5g茚三酮、0.1g维生素c和20g苯酚溶于20ml乙醇得到的混合液)，煮沸1min。观察树脂颜色，如果树脂变为深蓝色或者深紫色，说明脱fmoc保护成功；如果颜色无变化则重复脱保护步骤。用吸滤泵去除多肽合成管中的dmf，用二氯甲烷和dmf交替洗涤树脂3次。
在试管中称取216mg的fmoc-l-天冬氨酸-1-叔丁酯(fmoc-asp(otbu)-oh)、199mg的hbtu以及70mg的hobt，并加入8ml偶联剂(即体积比为95:5的dmf与n-甲基吗啉的混合溶液)反应10min进行活化，将该溶液加入多肽合成管中，摇床上室温反应1h。用吸滤泵去除多肽合成管中的dmf，用二氯甲烷和dmf交替洗涤树脂3次，并取少量树脂于1ml塑料离心管中，加入茚三酮测试液，煮沸1min。如果树脂颜色无变化，说明氨基酸偶联成功；如果变为蓝色或者紫色，说明氨基酸偶联不完全，重复该氨基酸的偶联步骤。
重复以上脱fmoc保护和氨基酸偶联步骤，继续将fmoc-gly-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-pro-oh、n,n'-双芴甲氧羰基-l-赖氨酸(fmoc-l-lys(fmoc)-oh)、boc-l-sec(c12h25)-oh逐一偶联到树脂上。
氨基酸偶联结束后，用二氯甲烷和dmf交替洗涤树脂3次，甲醇洗2次，去除液体，取出树脂置于玻璃烧瓶中。在冰浴条件下，向玻璃烧瓶中加入5ml裂解液(即4.75ml三氟乙酸、125μl水和125μl三异丙基硅烷的混合液)，搅拌反应2h进行多肽裂解。将树脂过滤后，滤液用氮气吹干至原体积的1/10，用冰冷的无水乙醚沉降获得粗品硒肽。
粗品硒肽采用半制备液相进行纯化，使用hplc检测硒肽纯度高于95％。所得硒肽分子量由基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪(maldi-tof-ms)和四极杆高分辨质谱进行检测，结果为(c76h141n21o15se2,m/z:calcd.1748,found1749[m h] )，此外，硒元素具有独特的同位素分布，四极杆高分辨质谱测试得到的硒肽质谱同位素峰形与chemdraw软件模拟结果完全一致，进一步证明硒肽的成功合成。
采用相同的多肽固相合成法，将boc-l-sec(c12h25)-oh替换成boc-l-cys(c12h25)-oh，合成硫肽(c12-硫肽)，所述硫肽的化学式为：[l-cys(c12h25)-oh]-k[l-cys(c12h25)-oh]-gplgvrgrgd，同时合成不含硒和硫的对照肽(c12-对照肽)，化学式为c12h25-k(c12h25)-gplgvrgrgd，c12-硫肽和c12-对照肽用作后续实验的对照组。
实施例3
本实施例检测实施例2制备的c12-硒肽的mmp-2酶响应能力，具体步骤如下：
将mmp-2酶与c12-硒肽在ph为7.4的pbs缓冲液中混合，混合后二者的浓度分别为50μg/ml和120μmol/l。二者在37℃下反应2h。通过hplc对反应后的溶液进行检测，其中，hplc图谱中不同的出峰时间对应于不同的物质，峰面积对应于物质的含量，结果如图2所示。
由图可知，与mmp-2酶混合反应2h后，80％的c12-硒肽被mmp-2酶切断，同时出现了新峰，证明有新物质生成。该新物质经过maldi-tof-ms确认为[l-sec(c12h25)-oh]-k[l-sec(c12h25)-oh]-gplg，与文献报道的plgvr肽的剪切位点相同。上述结果说明c12-硒肽能够被mmp-2酶剪切而变短，具有mmp-2酶的响应能力。
实施例4
本实施例检测实施例2制备的c12-硒肽的氧化响应能力，具体步骤如下：
将c12-硒肽、c12-硫肽分别与h2o2混合，混合后c12-硒肽和c12-硫肽的浓度均为60μmol/l，h2o2的浓度为100μmol/l。其中，h2o2的浓度与文献报道的肿瘤细胞内的活性氧浓度相当。在37℃下进行反应，采用hplc对反应开始后30min、1h和2h的反应产物进行测试。
由计算可知，c12-硒肽在30min、1h和2h的氧化程度分别为76％、87％和91％，而c12-硫肽在30min、1h和2h的氧化程度分别为40％、43％和45％，这说明本发明制备的c12-硒肽对肿瘤微环境中较低浓度的活性氧具有灵敏、快速响应的能力，可以加速物质的释放，在肿瘤药物的制备中具有广阔的应用价值。
实施例5
本实施例提供一种自组装硒肽纳米药物，所述自组装硒肽纳米药物由c12-硒肽和多柔比星制备得到，具体制备过程如下：
(1)制备疏水多柔比星：
将20mg盐酸多柔比星溶于1ml的二甲基亚砜中，加入50μl三乙胺，振荡混合1h。反应液使用截留分子量为1000的透析袋，在避光条件下透析24h，透析过程中换水5次。透析后的浑浊液离心，收集沉淀并冻干。
(2)临界胶束浓度的确定：
使用芘浓度为24μg/l、ph为7.4的pbs缓冲液分别配置浓度为0.5μmol/l、1μmol/l、3μmol/l、6μmol/l、10μmol/l、15μmol/l、20μmol/l、30μmol/l、40μmol/l和60μmol/l的c12-硒肽溶液，测定其在330nm波长的激发光下的荧光光谱，计算各组溶液在384nm和373nm处的发射峰的强度的比值，并以该比值为纵坐标、浓度的对数为横坐标作图，图中出现转折的浓度点即为临界胶束浓度，结果如图3所示。
由图可知，c12-硒肽的临界胶束浓度为3.9μmol/l。
采用相同的方法，确定c12-硫肽和c12-对照肽的临界胶束浓度分别为4.4μmol/l和2.5μmol/l。
(3)c12-硒肽/多柔比星纳米药物(sep/dox)的制备：
将浓度为120μmol/l的c12-硒肽的pbs缓冲液(ph为7.4)与浓度为0.8g/ml的疏水多柔比星二氯甲烷溶液混合，剧烈搅拌使得溶液乳化，减压蒸馏除去二氯甲烷，在6000rpm下离心，上层清液即为自组装硒肽纳米药物sep/dox。
采用相同的制备方法，将c12-硒肽替换为c12-硫肽制备c-12硫肽/多柔比星纳米药物(sp/dox)；将c12-硒肽替换为c12-对照肽制备c12-对照肽/多柔比星纳米药物(ctrp/dox)，用做后续实验的对照组。
(4)药物包封率和装载率的测定：
采用紫外-可见分光光度计测定硒肽纳米药物溶液中多柔比星的含量，通过构建疏水多柔比星的浓度与吸光度的标准曲线，再测量药物的吸光度，根据朗伯-比尔定律进行计算，推算出sep/dox的药物包封率为16.1％，药物装载率为32.8％，同时计算出sp/dox和ctrp/dox的药物包封率分别为12.5％和10.9％，药物装载率分别为28.3％和30.5％。
实施例6
本实施例测定sep/dox的水合粒径，通过dls动态光散射仪测量sep/dox的水和粒径，结果如图4所示。
由图可知，sep/dox的水合粒径为240±13nm，多分散系数pdi为0.18±0.05，粒径较小，有利于药物的渗透。
采用相同的测量方法，测得硫肽纳米药物sp/dox的水合粒径为237±18nm，pdi为0.21±0.09；对照肽纳米药物ctrp/dox的水合粒径为207±13nm，pdi为0.26±0.03。
本实施例还对sep/dox进行了透射电子显微镜观察。
将纳米药物滴加到铜网上，孵育5min，滤纸吸干水分后，滴加醋酸双氧铀染色5min，用滤纸吸干液体，用水清洗5min，用滤纸吸干后，在200kv下进行观察，结果如图5所示。
由图可知，纳米药物粒子大小均匀，无过大或过小的药物颗粒；多分散系数表明sep/dox粒径分布均一，说明制备得到的纳米药物均一性较好，有利于后续药物的渗透、解聚和释放。
实施例7
本实施例测试sep/dox的稳定性，具体步骤如下：
采用dls动态光散射仪，测试硒肽纳米药物sep/dox配置完成后在室温条件下12h内的水合粒径变化。
观察结果显示，在室温放置12h后，sep/dox的水合粒径变化不大，这表明所述自组装硒肽纳米药物sep/dox在室温放置的条件下，至少可以在12h内维持稳定性。
实施例8
本实施例检测sep/dox对mmp-2酶的响应能力和对h2o2的氧化响应能力，具体步骤如下：
将sep/dox与mmp-2酶混合，混合后mmp-2酶的浓度为50μg/ml，硒肽的浓度为120μmol/l，在37℃下孵育2h，随后使用dls动态光散射仪测量粒径。
dls粒径测试的结果显示孵育后硒肽纳米颗粒的粒径减小到100～150nm，这说明mmp-2酶对硒肽进行了切割，导致了纳米颗粒粒径的减小。
再向反应后的硒肽纳米颗粒中加入最终浓度为0.1％的h2o2溶液，在37℃下孵育1h，使用dls动态光散射仪测量粒径。
dls粒径测试的结果显示体系中颗粒的粒径信号峰约为3μm，说明氧化环境引起了纳米颗粒的解聚集，促进药物的释放。
上述结果表明sep/dox具有对mmp-2酶和活性氧自由基的响应能力，通过缩小粒径，增加了对肿瘤组织的渗透性，通过氧化促进了药物的释放，提高了治疗效果。
实施例9
本实施例检测sep/dox对肿瘤的靶向性，具体步骤如下：
将mda-mb-231细胞以初始密度为1×105/孔接种于12孔板中，分为6组，未处理组(non-treated)、dox组、ctrp/dox组、sep/dox组、sep/dox和rgd抑制剂(crgd)组以及ctrp/dox和rgd抑制剂(crgd)组。细胞在37℃、5％的co2的环境下培养24h。去除培养液，分别与dox、ctrp/dox、sep/dox、sep/dox和crgd以及ctrp/dox和crgd共同孵育2h，未处理组使用pbs溶液进行相同的实验。pbs缓冲液洗涤后，胰酶消化并收集细胞，使用pbs缓冲液洗涤后，使用bdaccuric6流式细胞仪测试细胞中的多柔比星荧光强度，结果如图6所示。
由图可知，与未处理组、直接加入多柔比星(dox组)和ctrp/dox组相比，sep/dox组细胞中多柔比星的荧光强度显著增强，说明sep/dox具有肿瘤靶向功能；当与crgd抑制剂共同孵育后，细胞中多柔比星的荧光强度显著减弱，表明sep/dox通过rgd结构域实现对肿瘤的靶向功能。以上结果表明sep/dox具有极好的肿瘤靶向能力，且主要通过硒肽中的肿瘤靶向单元发挥靶向功能。
实施例10
本实施例检测sep/dox对肿瘤细胞团簇的渗透性，具体步骤如下：
将mda-mb-231细胞以初始密度为1×105/孔接种于铺有琼脂糖的96孔板内，培养14d后细胞团聚成球状。将球状肿瘤细胞团簇用移液枪吸出，分为平行的4组，分别与ctrp/dox、sep/dox、sep/dox mmp-2酶和dox共同孵育2h。用carlzeisslsm710激光扫描共聚焦显微镜中的z-stack模式观察细胞团在1/4、1/2和3/4处的聚焦面的多柔比星荧光强度，结果如图7所示。
由图可知，细胞团簇的中心聚焦面中多柔比星荧光强度在sep/dox和mmp-2酶共孵育的细胞团簇中最高，其次为dox和sep/dox，ctrp/dox则较弱。这表明mmp-2酶对自组装硒肽纳米药物进行切割后，可以使药物的粒径减小，提高了药物对肿瘤组织的渗透能力，提高了药物的治疗效果。
实施例11
本实施例检测sep/dox对肿瘤细胞的杀伤效果，具体步骤如下：
将mda-mb-231细胞以初始密度为5000/孔接种于96孔板中，培养24h后去除培养液，分为平行的30组，分别加入浓度为0、0.1μmol/l、0.25μmol/l、0.5μmol/l、1μmol/l、2μmol/l、4μmol/l、8μmol/l、16μmol/l和32μmol/l的ctrp/dox、sep/dox和dox，孵育24h，吸除带有药物的培养基，加入含有10％的cck-8的无血清培养基，孵育2h后，利用酶标仪检测其在450nm处的吸光度，根据吸光度值作图，计算出半数抑制浓度ic50，结果如图8所示。
由图可知，ctrp/dox、sep/dox和dox的ic50值分别为16.7μmol/l、1.04μmol/l和0.08μmol/l。与ctrp/dox相比，sep/dox处理后的ic50很小，说明其对于肿瘤细胞具有较好的抑制作用。虽然直接加入dox对肿瘤的杀伤作用更好，但考虑到dox对细胞的杀伤不具有选择性，对正常组织的毒副作用较大，sep/dox更适合应用于抗肿瘤药物的制备中。
实施例12
本实施例检测sep/dox对原位三阴性乳腺癌的荷瘤鼠模型的抗肿瘤效果，具体步骤如下：
原位三阴性乳腺癌的荷瘤鼠模型的建立：将数量为5×107的mda-mb-231细胞注射到balb/c裸鼠的乳腺脂肪垫中，2～3周后肿瘤体积长到约150mm3。肿瘤体积计算如下：肿瘤体积＝0.5×长边长度×(短边长度)2。
将30只荷瘤鼠随机分为5组，分别注射生理盐水(saline)、dox、ctrp/dox、sp/dox和sep/dox，每组6只荷瘤鼠。给药的具体方案如下，通过尾静脉注射，在第1d、3d、5d和7d共给药4次，给药剂量均为5mg/kg的dox，给药体积为200μl，生理盐水组注射等量的生理盐水。每2d记录1次小鼠肿瘤的体积，对结果进行统计。各实验组数据的显著性检验采用excel软件中的t-test(双尾)函数进行统计，**代表p<0.01，***代表p<0.001，统计结果如图9所示。
由图可知，sep/dox具有极好的抑制肿瘤生长的作用，给药4次后，sep/dox组小鼠的肿瘤的体积几乎无变化，而其余组别小鼠的肿瘤体积则有明显的增大。综合实施例11和实施例12的结果，可知sep/dox不仅在细胞水平上具有优异的抗肿瘤效果，在动物水平上也可以抑制肿瘤的生长，效果明显，性能优异，应用价值极高。
实施例13
本实施例检测c12-硒肽纳米颗粒在血液中的清除时间，具体步骤如下：
以甲基异硫氰酸罗丹明(tritc)作为荧光示踪分子，参照实施例5中的制备方法，将多柔比星替换为tritc，制备c12-硒肽/tritc纳米颗粒。
分别将200μl的tritc和c12-硒肽/tritc纳米颗粒通过尾静脉注射输入balb/c小鼠体内，两个样品中的tritc浓度相同。在不同时间点采集小鼠尾静脉血测试tritc的荧光强度，对比初始tritc的荧光强度，计算出药物在血液中的滞留情况。
结果显示，在注射药物1h后，tritc和c12-硒肽/tritc纳米颗粒在血液中的滞留量分别为29.6±10.2％和54.8±7.8％，这说明c12-硒肽纳米颗粒可以延长分子在血液中的滞留时间。与药物直接注射相比，与硒肽组装成纳米颗粒药物具有更长效的血液滞留效果，药物在体内滞留时间长，可以获得更为长效的治疗效果，生物利用率高。
综上所述，本发明提供了一种氧化响应硒氨基酸，所述氧化响应硒氨基酸具有灵敏的氧化响应的能力，可以在含有活性氧自由基的环境下改变疏水性，帮助药物的释放；所述硒肽包括顺次连接的氧化响应单元、酶响应断裂单元和肿瘤靶向单元，可以被mmp-2酶切断，并具有氧化响应的能力；所述自组装硒肽纳米药物由c12-硒肽和抗肿瘤药物制备得到，可以被mmp-2酶切断减小颗粒粒径，可在氧化性环境中解聚集促进药物的释放，对肿瘤具有靶向性，对肿瘤细胞团具有良好的渗透性，可以有效杀伤肿瘤细胞，抑制体内肿瘤的生长，并延长了药物在体内的滞留时间，且具有较好的稳定性，可以在室温下稳定保存12h以上，在治疗肿瘤药物的制备中具有极其广泛的应用。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
1.一种硒肽，其特征在于，所述硒肽包括由n端到c端顺次连接的氧化响应单元、酶响应断裂单元和肿瘤靶向单元；
其中，所述氧化响应单元包括氧化响应硒氨基酸，所述氧化响应硒氨基酸为脂肪链-l-硒代半胱氨酸。
2.根据权利要求1所述的硒肽，其特征在于，所述脂肪链-l-硒代半胱氨酸中的脂肪链包括饱和烃基链和/或不饱和烃基链，优选为饱和烃基链；
优选地，所述脂肪链包括直链脂肪链、支链脂肪链或环链脂肪链中的任意一种或至少两种的组合，优选为直链脂肪链；
优选地，所述脂肪链中的碳原子数为1～18的整数；
优选地，所述脂肪链为c6、c12或c18中的任意一种饱和直链脂肪链；
优选地，所述脂肪链-l-硒代半胱氨酸包括l-sec(c6h13)-oh、l-sec(c12h25)-oh或l-sec(c18h37)-oh中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述脂肪链-l-硒代半胱氨酸为l-sec(c12h25)-oh，所述l-sec(c12h25)-oh的结构式如式i所示：
优选地，所述氧化响应单元中包括至少1个氧化响应硒氨基酸，且所述氧化响应硒氨基酸通过连接氨基酸相连；
优选地，所述氧化响应单元中包含2个氧化响应硒氨基酸；
优选地，所述连接氨基酸的数量为1个；
优选地，所述连接氨基酸为k。
3.根据权利要求1或2所述的硒肽，其特征在于，所述酶响应断裂单元包括基质金属蛋白酶ii剪切的多肽序列；
优选地，所述酶响应断裂单元的多肽序列为plgvr；
优选地，所述肿瘤靶向单元包括靶向肿瘤整合素的多肽序列；
优选地，所述肿瘤靶向单元的多肽序列为rgd；
优选地，所述氧化响应单元、酶响应断裂单元和肿瘤靶向单元通过间隔氨基酸x1和x2相连。
4.根据权利要求1～3任一项所述的硒肽，其特征在于，所述硒肽为：
[l-sec(alkyl)-oh]-k[l-sec(alkyl)-oh]-x1-plgvr-x2-rgd，其中alkyl表示脂肪链，所述硒肽的具体结构式如式ii所示：
优选地，所述间隔氨基酸包括天然氨基酸和/或非天然氨基酸，优选为g；
优选地，所述硒肽为：
[l-sec(c12h25)-oh]-k[l-sec(c12h25)-oh]-gplgvrgrgd，具体结构式如式iii所示：
5.一种如权利要求1～4任一项所述的硒肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
制备boc基团保护的氧化响应硒氨基酸，再通过固相合成，按照从c端到n端的方向，将氨基酸和氧化响应硒氨基酸依次偶联到树脂上，洗脱，得到所述硒肽。
6.根据权利要求5所述的硒肽的制备方法，其特征在于，所述制备boc基团保护的氧化响应硒氨基酸的方法包括：
硒粉与硼氢化钠反应得到二硒化二钠后，再与1-卤代烷烃混合反应，制备得到烷基二硒醚，再加入还原剂还原后得到烷基硒醇；
所述烷基硒醇与n-叔丁氧羰基-o-对甲苯磺酰基丝氨酸甲酯混合，得到boc基团保护的脂肪链-l-硒代半胱氨酸甲酯，脱去甲基，得到boc基团保护的脂肪链-l-硒代半胱氨酸；
优选地，所述1-卤代烷烃包括1-溴代烷烃；
优选地，所述1-溴代烷烃的碳原子数为1～18的整数，优选为6、12或18；
优选地，所述混合反应在油浴条件下进行；
优选地，所述油浴的温度为45～55℃，优选为50℃；
优选地，所述混合反应的时间为10～14h，优选为12h；
优选地，所述还原剂包括硼氢化钠；
优选地，所述加入还原剂前还包括冷却的步骤；
优选地，所述还原的时间为25～35min，优选为30min；
优选地，所述混合的时间为5～7h，优选为6h；
优选地，所述脱去甲基前还包括乙酸乙酯萃取和硅胶柱层析纯化的步骤；
优选地，所述脱去甲基的方法为将反应产物置于含有氢氧化锂的溶液中搅拌；
优选地，所述搅拌的时间为55～65min；
优选地，所述脱去甲基后还包括乙酸乙酯萃取的步骤；
优选地，所述固相合成的步骤包括：
溶胀树脂，脱去树脂氨基酸的fmoc基团，再将氨基酸和所述氧化响应硒氨基酸顺次偶联到树脂上；
优选地，所述溶胀树脂的步骤包括将树脂浸泡在无水dmf中，并放置在摇床上；
优选地，所述氨基酸包括fmoc基团保护的氨基酸；
优选地，所述将氨基酸偶联到树脂前还包括脱去所述氨基酸的fmoc基团的步骤；
优选地，所述将氧化响应硒氨基酸偶联到树脂前还包括脱去所述氧化响应硒氨基酸的boc基团的步骤。
7.根据权利要求5或6所述的硒肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)硒粉与硼氢化钠反应得到二硒化二钠后，再与碳原子数为1～18的1-溴代烷烃在45～55℃的油浴条件下混合反应10～14h，制备得到烷基二硒醚，冷却后，再加入硼氢化钠还原25～35min，得到烷基硒醇；
(2)所述烷基硒醇与n-叔丁氧羰基-o-对甲苯磺酰基丝氨酸甲酯混合5～7h后，进行乙酸乙酯萃取和硅胶柱层析纯化，得到boc基团保护的脂肪链-l-硒代半胱氨酸甲酯；
(3)再将所得boc基团保护的脂肪链-l-硒代半胱氨酸甲酯在含有氢氧化锂的溶液中搅拌55～65min，脱去甲基，乙酸乙酯萃取后，得到boc基团保护的脂肪链-l-硒代半胱氨酸；
(4)将树脂浸泡在无水dmf中，并放置在摇床上，溶胀树脂，并脱去树脂氨基酸的fmoc基团；
(5)脱去所述fmoc基团保护的氨基酸的fmoc基团，并将所得脱去了fmoc基团的氨基酸偶联到树脂上；
(6)脱去所述boc基团保护的氧化响应硒氨基酸的boc基团，并将所得脱去了boc基团的氧化响应硒氨基酸偶联到树脂上，洗脱，得到所述硒肽。
8.一种自组装硒肽纳米药物，其特征在于，所述自组装硒肽纳米药物包括如权利要求1～4任一项所述的硒肽和抗肿瘤药物；
优选地，所述抗肿瘤药物为疏水性药物，优选为多柔比星；
优选地，所述自组装硒肽纳米药物的水合粒径为200～250nm；
优选地，所述自组装硒肽纳米药物在基质金属蛋白酶ii的作用下，水合粒径减小至50～150nm；
优选地，所述自组装硒肽纳米药物在氧化条件下解组装。
9.一种如权利要求8所述的自组装硒肽纳米药物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将硒肽与抗肿瘤药物混合；
优选地，所述硒肽溶解于磷酸钠缓冲液中；
优选地，所述磷酸钠缓冲液的ph值为7.0～7.8，优选为7.4；
优选地，所述抗肿瘤药物溶解于二氯甲烷中；
优选地，所述混合后还包括减压蒸馏去除二氯甲烷的步骤；
优选地，所述去除二氯甲烷后还包括离心的步骤；
优选地，所述离心的转速为5000～6500rpm，优选为6000rpm；
优选地，所述自组装硒肽纳米药物的制备方法包括以下步骤：
将硒肽溶解于ph值在7.0～7.8的磷酸钠缓冲液中，将抗肿瘤药物溶解于二氯甲烷中，将溶液剧烈搅拌混合，减压蒸馏去除二氯甲烷后，在5000～6500rpm下离心，上层清液即为所述自组装硒肽纳米药物。
10.如权利要求1～4任一项所述的硒肽和/或权利要求8所述的自组装硒肽纳米药物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
技术总结