本发明属于功能性诊疗一体化杂化纳米材料及其制备和应用领域，特别涉及一种金钆杂化树状大分子复合物及其制备和应用。
背景技术：
近年来，免疫治疗已逐渐发展成为继手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗手段。不同于传统治疗手段，免疫治疗通过激活人体免疫系统，依靠自身免疫机能杀灭癌细胞和肿瘤组织，进行精准的免疫杀伤，其特异性高，毒性小，且具有免疫记忆杀伤效应，因而逐渐成为当下肿瘤研究的焦点。在肿瘤免疫过程中，t细胞介导的免疫反应和肿瘤排斥中起着核心作用，但是由于t细胞在正常衰老和肿瘤微环境多因子刺激下产生的衰竭现象极大限制了t细胞的正常功能，从而对实体瘤进行有效的治疗。t细胞衰竭过程中的一大特征是免疫抑制性受体——程序性死亡蛋白1(programmeddeath-1，pd-1)的表达增多，pd-1与肿瘤细胞表面表达的程序性死亡蛋白受体1(programmeddeath-ligand1，pd-l1)会相互识别并结合，引发t细胞功能衰竭，介导肿瘤细胞的免疫逃逸，降低免疫治疗的效率。因此，研究者们探寻t细胞的基因改造方法用于增强肿瘤免疫，其中sirna介导的基因沉默是一种高效可行的手段。可以通过寻找一种安全、稳定、高效的纳米载体体系负载sirna诱导pd-1基因沉默，从而抗t细胞功能衰竭，克服肿瘤微环境的抑制作用，实现对更为高效的免疫治疗。
选择合适的纳米载体选择对于实现sirna的高效递送至关重要。pamam树状大分子是一类具有纳米级的尺寸，结构大小可控、无免疫原性、性质稳定、毒性小、生物可降解的枝化大分子。其表面具有大量的端基，可以进行不同的功能化，能够与其他分子产生物理或化学的作用，内部有空腔可以负载药物或无机纳米颗粒。另外，pamam属于阳离子型的聚合物，表面带正电荷，sirna等基因药物则带负电荷，两者可以产生静电相互作用压缩结合成复合物，从而使得基因更容易被细胞所摄取继而发挥作用。已有研究者尝试将pamam树状大分子作为sirna的载体，通过不同的化学修饰方法，实现了高效、靶向性的递送应用于肿瘤治疗。2016年，已有文章报道(kongl,etal.nanomedicine,2016,12(23):3103-3115.)使用第五代的pamam树状大分子，聚乙二醇(peg)化后修饰rgd肽，实现了vegf和bcl-2sirna的良好负载和靶向递送，对于小鼠神经胶质瘤的基因沉默治疗获得了较好的效果。另有2018年的报道(qiuj,etal.nanomaterials,2018,8(3):131.)使用β-环糊精同样对聚乙二醇(peg)化后的第五代pamam树状大分子进行了修饰，也能较好地靶向递送vegf和bcl-2sirna，实现有效的治疗。但这些研究都选择肿瘤部位作为直接靶点，未尝试进行对于免疫细胞的基因转染和基因改造，并进一步应用于肿瘤的免疫治疗。
根据国内外文献检索结果，目前尚未发现关于金钆杂化树状大分子pd-1sirna复合物的制备及其在抗t细胞衰竭和免疫治疗等应用中的相关报道。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种金钆杂化树状大分子复合物及其制备和应用，填补现有树状大分子纳米平台基因转染改造t细胞，用于增强肿瘤免疫的技术空白。
本发明的一种金钆杂化树状大分子材料，所述材料为第五代聚酰胺-胺pamam树状大分子g5.nh2表面修饰两性离子1,3-丙磺酸内酯1,3-ps和gd-dota螯合物、内部包裹金au纳米颗粒。
本发明的一种金钆杂化树状大分子材料的制备方法，包括
(1)将dota-nhs溶液加入第五代聚酰胺-胺pamam树状大分子g5.nh2溶液中，水浴搅拌12-24小时，然后经透析纯化、冷冻干燥，得到dota修饰的g5.nh2-dota；
(2)将步骤(1)所得g5.nh2-dota溶于超纯水中，加入溶有两性离子1,3-ps的超纯水溶液，水浴搅拌反应12-24小时，得到主要成分两性离子修饰的g5.nh2-dota-ps溶液；
(3)将步骤(2)所得g5.nh2-dota-ps溶液置于冰浴中搅拌，加入haucl4·4h2o水溶液，搅拌15-30分钟后，迅速加入含nabh4冰水溶液，反应2-3小时，得到主要成分为dota修饰的第五代树状大分子包裹纳米金颗粒，即{(au0)25-g5.nh2-dota10-ps10}denps的水溶液；
(4)将步骤(3)所得主要成分{(au0)25-g5.nh2-dota10-ps10}denps的水溶液，用盐酸hcl调至ph＝6±0.1，加入含gd(no3)3·6h2o的水溶液，搅拌反应12-24小时后经透析纯化、冷冻干燥，得到金钆杂化树状大分子gdaudenp-ps。
所述步骤(1)中溶液的溶剂均为二甲基亚砜dmso；所述g5.nh2和dota-nhs的摩尔比为1:10.5～1:11；
所述水浴温度为30℃±1℃；透析采用截留分子量为8000～14000的纤维素透析膜在超纯水中透析2-3天。
所述步骤(2)中g5.nh2-dota与1,3-ps摩尔比为1:11～1:13，30℃±1℃。
所述步骤(3)中g5.nh2-dota-ps与haucl4·4h2o摩尔比为1:25，haucl4·4h2o与nabh4的摩尔比为1:4～1:6。
所述步骤(4)中{(au0)25-g5.nh2-dota10-ps10}denps与gd(no3)3·6h2o的摩尔比为1:15～20，反应温度为室温，透析采用截留分子量为8000～14000的纤维素透析膜在超纯水中透析1-3天。
本发明的一种金钆杂化树状大分子复合物，所述复合物为所述金钆杂化树状大分子材料与pd-1sirna的复合物。
本发明的一种金钆杂化树状大分子复合物的制备方法，包括：
将所述金钆杂化树状大分子材料溶于缓冲溶液中，然后与pd-1sirna溶液混匀后共孵育，得到金钆杂化树状大分子复合物。
所述pd-1sirna的意义链序列为5'-gcucacuucagguuuaccatt-3'，pd-1sirna溶于焦碳酸二乙酯预处理过的超纯水depc水中，gdaudenp-ps与pd-1sirna的用量比为氮磷比n/p＝0.25～25，共孵育时间为20-30分钟。
本发明提供一种所述金钆杂化树状大分子复合物在制备体外t细胞基因转染，沉默pd-1表达药物中的应用。
本发明提供一种所述金钆杂化树状大分子复合物在制备体内抗t细胞衰竭或肿瘤免疫治疗药物中的应用。
本发明提供一种所述金钆杂化树状大分子复合物在制备体内ct/mr成像试剂中的应用。
本发明方法包括：(1)功能化修饰的树状大分子({(au0)25-g5.nh2-dota10-ps10}denp)的制备；(2)三价钆离子螯合的金钆杂化树状大分子载体(gd-audenp-ps)的制备；(3)gd-audenp-ps/pd-1sirna复合物(drc)的制备。
本发明基于第五代聚酰胺-胺树状大分子，表面修饰两性离子1,3-丙磺酸内酯(1,3-ps)、gd-dota螯合物、内部包裹金(au)纳米颗粒，最终通过静电吸附形成pd-1sirna的复合物drc，实验结果表明，通过对小鼠静脉注射drc，可以有效缓解正常衰老和肿瘤发生过程中的t细胞功能衰竭，增强肿瘤免疫，同时能够实现体内ct/mr双模态成像功能。
本发明使用核磁共振氢谱(1hnmr)、紫外可见吸收光谱(uv-vis)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(icp-oes)、zeta电势测试、动态光散射(dls)测试和透射电镜(tem)等方法表征了制备得到的纳米材料和sirna复合物，通过体外蛋白吸附试验评价了材料抗非特异性蛋白吸附性能，并采用细胞吞噬实验和酶联免疫吸附(elisa)法评价该纳米材料的对于t细胞的影响，利用cck-8法在体外验证了材料的生物相容性，采用凝胶阻滞实验、绿色荧光蛋白表达实验等初步研究了材料的基因递送能力，再利用流式细胞仪、共聚焦显微镜来评价该复合物在t细胞吞噬和胞内定位情况，采用了rt-pcr、westernblot评价pd-1sirna介导的基因沉默情况，最后在小鼠体内评价了其ct/mr成像功能，及抗t细胞衰竭及由此介导的抗肿瘤效果。具体测试结果如下：
(1)1hnmr表征结果
氢谱分析结果如图2所示，图2a为乙酰化g5(g5.nhac)和乙酰化g5.nh2-dota(g5.nhac-dota)的核磁共振氢谱，1.89ppm处为乙酰基的特征峰，通过差量法可计算得出每个g5上连接的dota为10.4个。图2b为g5.nh2-dota-ps的核磁共振氢谱，1.93ppm处为1,3-ps的特征归属，通过积分计算可得每个g5上连接的1,3-ps为9.1个。
(2)uv-vis测试结果
uv-vis测试结果如图3所示，分析结果可知，合成的gd-audenp-ps在520nm左右处有紫外吸收，相比之下，g5.nh2-dota则无此特征吸收峰，说明成功合成了有独特吸收峰的纳米金颗粒。
(3)透射电镜(tem)测试
tem测试结果如图4a-b所示，可以发现gd-audenp-ps的单分散性良好，粒径统计结果表明包裹的金纳米颗粒尺寸在2.0nm左右。
(4)体外抗蛋白吸附实验
对gd-audenp-ps进行蛋白吸附实验测试，测定两性离子抗非特异性蛋白吸附的效果。以牛血清白蛋白为模式蛋白，如附图5a所示，bsa在278nm处有吸收峰。将gd-audenp-ps，分别配置成不同浓度的pbs溶液测试与bsa蛋白共孵育前后278nm处的吸光度差值。从附图5b可以看出，在最高浓度时，孵育前后的紫外吸收差值也仅有0.100。从而说明材料经过1,3-ps的修饰能够很好地降低材料的非特异性蛋白吸附。
(5)材料稳定性测试
取实施例1中的gd-audenp-ps分别溶于水、pbs和培养基中配置成0.2mg/ml的溶液，拍照如图6，显示了材料在不同溶剂中良好分散性。另通过纳米激光粒度仪，在1-10天之内每天测试材料的水合粒径来研究材料的稳定性。结果如图7所示，随着时间的推移，gd-audenp-ps在不同溶液中的粒径没有明显的变化，证明了合成的材料具有良好的稳定性。
(6)t细胞吞噬实验结果
如图8a所示，将t细胞与gd-audenp-ps的培养基共孵育4小时后离心、洗涤并收集，icp-oes测定细胞中的au含量，计算得细胞吞噬效率。结果表明t细胞对gd-audenp-ps有较好的吞噬效率。
(7)t细胞细胞因子检测结果
将t细胞制备的gd-audenp-ps的培养基共孵育4小时后离心、洗涤、更换新鲜的培养基继续培养24小时。随后离心取细胞上清液进行elisa检测il-2细胞因子的含量。如图8b所示，可以发现gd-audenp-ps对t细胞活力无负面影响。
(8)凝胶阻滞实验结果
取gd-audenp-ps采用定氮试剂盒测定氨基的个数，然后将gd-audenp-ps与egfppdna或pd-1sirna按照不同的氮磷比(0、0.25、0.5、1、2、3、4)孵育30分钟，孵育完之后进行琼脂糖凝胶电泳(如图9a和图10b所示)，实验结果表明gd-audenp-ps在n/p大于等于1的条件下就可以完全压缩egfppdna，而在n/p大于等于2的条件下能完全压缩pd-1sirna，说明该材料具有很好的基因压缩能力。
(9)zeta电势及水动力学直径测试
将本发明制备的gd-audenp-ps与egfppdna和pd-1sirna按不同n/p比(n/p＝0、0.25、0.5、1、2、3、4)复合，室温孵育30分钟，然后加入1ml的pbs进行zeta电势和水动力学直径测试(如图9b-c和图10b-c所示)。测试结果同样表明gd-audenp-ps在n/p大于等于1的条件下就可以完全压缩egfppdna，而在n/p大于等于2的条件下能完全压缩pd-1sirna。
(10)egfp蛋白表达实验
将本发明制备的gd-audenp-ps与egfppdna于不同n/p下(0、5、10、15、20、25)复合，转染t细胞，24小时后通过荧光显微镜观测蛋白表达情况。如图9d所示，在n/p＝15时，egfp表达量最多，转染效率最高。
(11)流式细胞仪检测吞噬情况
收集t细胞，在将带有cy3标记的pd-1sirna按照不同的n/p值(n/p＝0、5、10、15、20、25)共同孵育30分钟，然后用此复合物分别在有血清和无血清的培养条件下与t细胞共培养4h。之后将细胞消化、离心、收集，用流式细胞仪检测样品的荧光强度(如图10d所示)。实验结果表明，在n/p＝15的时候，荧光强度最高，同时表明在有血清存在下gd-audenp与pd-1sirna的细胞内吞效果更好。
(12)b16细胞毒性实验结果
利用cck-8细胞活力实验验证了材料对b16细胞的毒性。如图11所示，gd-audenp-ps或gd-audenp-ps/sipd-1复合物本身均不影响b16细胞的活力。
(13)细胞定位实验结果
将带有cy3标记的pd-1sirna按照n/p＝15于室温孵育30分钟，制得复合物drc。将t细胞与pbs、freesirna或drc的完全培养基条件下共培养4h。培养结束后用pbs清洗三次，然后fitc标记的cd3抗体标记t细胞，随后用戊二醛固定后用dapi染色。使用共聚焦显微镜的油镜下观察细胞的荧光信号(如图12所示)。结果表明，相比于pbs和单独的sirna组，drc处理的细胞显示了较高的荧光强度。说明本发明制备的drc能很好的被t细胞内吞于细胞质中。
(14)体外rt-pcr实验结果
小鼠脾脏中提取并收集t细胞后，种于12孔细胞培养板中，加入含pbs、gd-audenp/阴性对照sirna(sinc)复合物或gd-audenp/pd-1sirna(sipd-1)复合物，即drc(每孔2μgsirna)的培养基孵育4小时后，更换为含/不含cona的培养基刺激12小时，最后更换为新鲜不含cona的培养基继续培养24小时后，提取总蛋白、反转录进行实时荧光定量pcr(rt-pcr)测试。如图13所示，cona刺激t细胞表达了更多的pd-1mrna，drc介导的基因转染有效降低了pd-1的表达，相对于pbs组，mrna水平的pd-1沉默效率为39.6％。与此同时，gd-audenp/阴性对照sirna(sinc)复合物则对pd-1mrna的表达无明显影响。
(15)体外pd-1流式检测结果
取t细胞种于12孔细胞培养板中，加入含pbs、gd-audenp/阴性对照sirna(sinc)复合物或gd-audenp/pd-1sirna(sipd-1)复合物，即drc(每孔2μgsirna)的培养基孵育4小时后，更换为含/不含的cona的培养基刺激12小时，最后更换为新鲜不含cona的培养基继续培养48小时后收集t细胞。重悬t细胞余1mlpbs中置于冰上，加入fitc绿色荧光标记pd-1抗体孵育30分钟，洗涤、收集、重悬于pbs中，进行流式细胞术测试。如图14a所示，drc介导的基因转染在蛋白水平也能有效降低t细胞pd-1的表达。如图14b的定量数据所示，相比于pbs组，蛋白水平沉默效率在47.8％。gd-audenp/阴性对照sirna(sinc)复合物仍无显著影响，表明材料本身对t细胞pd-1表达无影响。
(16)体内ct/mr成像结果
取gd-audenp-ps和吞噬了相近浓度gd-audenp-ps的t细胞pbs悬液，对小鼠进行静脉注射。在注射前和注射后30、60/90分钟时分别进行ct和mr成像扫描。如图15a-b所示，gd-audenp-ps和t细胞负载的gd-audenp-ps都能得到增强的mr信号，且在60分钟时达到肿瘤部位信噪比(snr)的峰值。如图16a-b所示，gd-audenp-ps和t细胞负载的gd-audenp-ps也都能得到增强的ct信号，同样在60分钟时达到肿瘤部位ct值信号的峰值。相比之下，gd-audenp-ps的ct/mr成像效果更佳，可能是由于gd-audenp-ps尺寸更小，比t细胞负载的材料更易在小鼠体内循环达到肿瘤部位。
(17)体内抗肿瘤效果评价
将皮下种植b16黑色素瘤的小黑鼠随机分成6组用于评价抗肿瘤效果。第一组：静脉注射pbs；第二组：ido酶抑制剂epacadostat(ep)口服给药；第三组：静脉注射drc；第四组：静脉注射t细胞负载的drc；第五组：ep口服给药 静脉注射drc，第六组：ep口服给药 静脉注射t细胞负载的drc。
如图17a所示，随着时间推移小鼠年龄增长且肿瘤体积增加，尤其是pbs组，小鼠体重也有所增加。如图17b所示，各个治疗组中的肿瘤抑制效果排序为：pbs＜ep＜drc-t＜drc＜drc-t ep＜drc ep，其中drc ep和drc-t ep两组的肿瘤抑制效果较好，肿瘤抑制效率在33.48％和26.17％。将治疗最后一天的肿瘤取出切片进行tunel染色，如图18所示，drc ep和drc-t ep两组的凋亡细胞数最多。定量数据如图19所示，drc ep和drc-t ep两组的tunel荧光强度相比于pbs分别增强了6.5和6.0倍。将治疗第10天的小鼠心、肝、脾、肺、肾、肿瘤取出进行h&e染色测试，如图20所示，不同治疗组的小鼠心、肝、脾、肺、肾、肿瘤均无明显异常病理出现，表明了drc的良好生物相容性，但与此同时，治疗组尤其是drc ep和drc-t ep两组肿瘤的切边染色中可以观测到更多的细胞质泄露和细胞核破裂，佐证了治疗组的体内抗肿瘤效果。
为验证免疫治疗及drc抗t细胞衰竭的功能，治疗过程中的第8天，如图21a所示，各组小鼠脾脏中的t细胞被提取并收集，与此同时，3周龄幼年鼠的脾脏t细胞被收集作为对照。按实施例11中的方法标记pd-1、cd4、cd8抗体后使用流式细胞仪对各组t细胞进行检测分析。如图21b-c所示，各个治疗组的t细胞pd-1表达量排序为：pbs＞ep＞drc-t＞drc＞drc-t ep＞drc ep；如图21d-g所示，drc-t ep和drc ep组的cd4 及cd8 效应t细胞表达最多，其中drc ep组的cd8 /cd4 的比值最高。这些结果表明治疗组使用静脉注射drc，在荷瘤鼠体内能有效地降低t细胞pd-1的表达，抗t细胞衰竭，同时产生更多的效应t细胞和关键性的肿瘤杀伤性t细胞，联合ido抑制剂能增强肿瘤免疫治疗。
同样在第8天，取小鼠的血清进行了细胞因子il-2，ifn-γ，tnf-α和kyn的检测，如图22所示，治疗组能有效增强t细胞活力，增强抗肿瘤促炎因子的产生，帮助更好的杀伤肿瘤细胞。另一方面，所有使用ep的治疗组，ido酶催化的下游产物kyn均有所下调，同时发现使用t细胞的实验组组本身对于kyn一定的下调作用。
(18)正常小鼠体内抗t细胞衰竭功能评价
将健康的小鼠随机分为两组，第一组：不作处理；第二组：静脉注射drc，每只小鼠在第1、2、3周每周静脉注射一次drc(sirna用量为1mg/kg)。于第8周(56天)时，对小鼠进行处死、提取脾脏t细胞进行pd-1表达的流式细胞术分析，及心、肝、脾、肺、肾h&e染色检测。如图23a-b所示，随着小鼠的正常衰老，t细胞的pd-1表达也有所增强，但连续三周注射了drc的小鼠组pd-1增加较未处理组减少了41.66％，说明drc在正常小鼠衰老过程中也能发挥一定的抗t细胞衰竭功能。与此同时，如图24所示，第56天未处理组和drc组的心、肝、脾、肺、肾h&e染色结果均无异常病理情况，进一步佐证了drc的良好生物安全性。
有益效果
(1)本发明操作工艺简单，反应条件温和，易于纯化，所用的合成原料均为环境友好型材料，具有产业化的实施前景；
(2)本发明制备的金钆杂化树状大分子pd-1sirna复合物诊疗试剂，能高效被t细胞所吞噬并不影响t细胞活力，能实现血清存在条件下的t细胞转染并沉默pd-1的表达；
(3)本发明制备的复合物drc具有多功能性，可以用于体外、体内的t淋巴细胞的pd-1基因沉默改造，抗t细胞在机体肿瘤发生过程和正常衰老过程中的功能衰竭，用于增强肿瘤免疫治疗，与此同时具备实现体内ct/mr双模态成像功能；
(4)本发明制备的复合物drc在纳米医学、肿瘤免疫治疗和分子影像学领域具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为本发明金钆杂化树状大分子pd-1sirna复合物的合成示意图。
图2为本发明制备的g5.nhac、g5.nhac-dota(a)和g5.nh2-dota-ps(b)的1hnmr谱图。
图3为本发明制备的g5.nhac-dota和gd-audenp-ps的uv-vis图。
图4为本发明制备的gd-audenp-ps的高分辨透射电镜图片(a)以及对应的粒径分布图(b)。
图5为本发明bsa蛋白的uv-vis光谱图(a)，不同浓度的gd-audenp-ps和与bsa(1mg/ml)孵育离心前后(b)紫外吸收值。
图6为本发明制备的gd-audenp-ps溶解在水、pbs、rpmi1640培养基中的照片。
图7为本发明制备的gd-audenp-ps溶于水、pbs、rpmi1640培养基中，在不同天数通过纳米激光粒度仪测得的水动力学直径图。
图8为本发明制备的gd-audenp-ps按不同金浓度与t细胞共孵育后的(a)吞噬效率和(b)il-2细胞因子释放结果。
图9为本发明制备的gd-audenp-ps复合egfp质粒dna后在不同n/p下的(a)凝胶阻滞实验电泳图谱(m：dnamarker；条带1：裸pd-1sirna；条带2：n/p＝0.25:1；条带3:n/p＝0.5:1；条带4:n/p＝1:1；条带5:n/p＝2:1；条带6:n/p＝3:1；条带7:n/p＝4:1)，(b)zeta电势和(c)水动力学直径结果，以及按不同n/p复合转染t细胞后egfp绿色荧光表达的(d)荧光显微镜照片及定量结果。
图10为本发明制备的gd-audenp-ps与pd-1sirna在不同n/p下的凝胶阻滞实验电泳图谱(条带1：裸pd-1sirna；条带2：n/p＝0.25:1；条带3：n/p＝0.5:1；条带4：n/p＝1:1；条带5：n/p＝2:1；条带6：n/p＝3:1；条带7：n/p＝4:1)，(b)zeta电势和(c)水动力学直径结果，以及按不同n/p的gd-audenp-ps与cy3标记的pd-1sirna复合后与t细胞在有/无血清条件下共孵育，经流式细胞仪测定的(d)吞噬结果图。
图11为本发明制备的gd-audenp-ps和gd-audenp-ps/sipd-1复合物与b16细胞共培养后的cck-8细胞活力检测结果。
图12为pbs、freepd-1sirna、以及实施例10中cy3标记的pd-1sirna与gd-audenp-ps在n/p＝15形成复合物drc后处理t细胞4h，经荧光染色后的激光共聚焦显微镜图片。
图13为pbs、gd-audenp/sinc和gd-audenp/sipd-1在有/无cona处理条件下转染t细胞24小时后的rt-pcr结果图。
图14为pbs、gd-audenp/sinc和gd-audenp/sipd-1在有/无cona处理条件下转染t细胞48小时后的(a)流式细胞仪结果图和(b)pd-1蛋白表达定量结果图。
图15为c57bl/6小鼠静脉注射材料或负载材料的t细胞后的(a)mr成像图和(b)信噪比。
图16为c57bl/6小鼠静脉注射材料或负载材料的t细胞后的(a)ct成像图和(b)ct值。
图17为b16黑色素瘤荷瘤小鼠在接受pbs、ep、drc、drc-t、drc ep、drc-t ep处理10天过程中的(a)体重变化和(b)肿瘤体积变化。
图18为接受pbs、ep、drc、drc-t、drc ep、drc-t ep处理10天后荷瘤小鼠肿瘤切片的tunel荧光染色结果。
图19为接受pbs、ep、drc、drc-t、drc ep、drc-t ep处理10天后荷瘤小鼠肿瘤切片的tunel荧光染色定量数据。
图20为接受pbs、ep、drc、drc-t、drc ep、drc-t ep处理10天后荷瘤小鼠心、肝、脾、肺、肾、肿瘤切片的h&e染色结果图。
图21为接受pbs、ep、drc、drc-t、drc ep、drc-t ep处理8天后荷瘤小鼠脾脏t细胞的pd-1、cd4、cd8检测结果；(a)t细胞提取示意图；(b)pd-1表达流式图和(c)定量结果；(d)cd4、cd8表达和(e、f)定量结果及(g)cd8 /cd4 比值。
图22为接受pbs、ep、drc、drc-t、drc ep、drc-t ep处理8天后荷瘤小鼠血清中的白细胞介素-2(il-2)(a)、干扰素-γ(ifn-γ)(b)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)(c)、犬尿氨酸(kyn)(d)细胞因子的酶联免疫吸附(elisa)检测结果。
图23为未经处理和drc连续注射三周后第56天小鼠t细胞pd-1表达的(a)流式细胞仪结果图和(b)定量数据。
图24为未经处理和drc连续注射三周后第56天小鼠心、肝、脾、肺、肾切片的h&e染色结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)称取20mg的dota-nhs和60mg第五代pamam树状大分子(g5.nh2)(购自美国dendritech公司)，分别溶解于5ml二甲基亚砜(dmso)和20mldmso中，将dota-nhs(购自法国chematech公司)溶液加入g5.nh2溶液中，30℃下水浴搅拌反应24小时。反应结束后，使用截留分子量为8000～14000的纤维素透析袋在纯水(3l)中透析3天(每日换水3-4次)后冷冻干燥，得到g5.nh2-dota粉末；
(2)称取60mg的g5.nh2-dota粉末溶解于20ml超纯水中，加入2.7mg的1,3-ps(购自上海百灵威科技有限公司)，在30℃水浴搅拌反应24小时，得到主要成分g5.nh2-dota-ps的水溶液。随后，将g5.nh2-dota-ps溶液置于冰浴中搅拌，加入634μl的haucl4·4h2o(购自国药集团化学试剂有限公司)水溶液(30mg/ml)，搅拌15分钟后，迅速加入5ml含8.73mgnabh4的冰水溶液，反应3小时，得到主要成分为{(au0)25-g5.nh2-dota10-ps10}denps的水溶液。随后使用ph计监测，取适量盐酸(hcl)将反应液ph调至ph＝6，加入2ml含15mggd(no3)3·6h2o(购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)的超纯水溶液，室温搅拌反应24小时后，使用截留分子量为8000～14000的纤维素透析袋在纯水(3l)中透析3天(每日换水3-4次)，冷冻干燥，得到gdaudenp-ps粉末。
(3)称取gdaudenp-ps，配置成2mg/ml的超纯水溶液，将pd-1sirna(pd-1sirna购自上海吉玛基因公司，含19个碱基对，其意义链序列为5'-gcucacuucagguuuaccatt-3')溶解于depc水中配置成0.5μg/ml的溶液，取2μlpd-1sirna(即1μg)，与gdaudenp-ps溶液按n/p＝15充分混匀后共孵育30分钟，即得到复合物drc。
实施例2
对实施例1步骤(1)中制备的g5.nh2-dota进行表征：
分别称取10mg的g5.nh2和g5.nh2-dota充分溶解于5ml超纯水中，随后在g5.nh2和g5.nh2-dota溶液中分别加入50μl三乙胺，室温搅拌30分钟，随后加入29μl乙酸酐室温搅拌反应24小时。反应结束后，使用截留分子量为8000～14000的纤维素透析袋在纯水(3l)中透析3天(每日换水3-4次)，冷冻干燥，得到乙酰化的g5.nhac和g5.nhac-dota粉末。称取2-3mg的g5.nhac和g5.nhac-dota粉末，加入600μl的氘代水(d2o)进行1hnmr测试。如图2a所示，通过1.89ppm处乙酰基的甲基质子峰，经差量法计算得每个g5.nh2上连接的dota个数为10.4个。
实施例3
对实施例1步骤(2)中制备的gdaudenp-ps及制备过程中的相关中间产物进行表征。
(1)取实施例1步骤(2)中的g5.nh2-dota-ps溶液适量，使用截留分子量为8000～14000的纤维素透析袋在纯水(3l)中透析3天(每日换水3-4次)，冷冻干燥，得到g5.nh2-dota-ps粉末。称取3-4mg加入600μl的d2o，进行1hnmr测试。如图2b所示，2.25-3.4ppm处的质子峰代表g5.nh2的亚甲基质子峰，1.93ppm处则为1,3-ps的亚甲基质子峰，表明1,3-ps的成功接枝，积分计算可得每个g5.nh2连接有9.1个1,3-ps。
(2)称取g5.nh2-dota和gdaudenp-ps粉末，分别配置成0.2mg/ml的水溶液，进行紫外可见光谱(uv-vis)测试。如图3所示，gdaudenp-ps在520nm处左右出现了明显的吸收峰，为au纳米颗粒的等离子体共振峰，而g5.nh2-dota则无此特征吸收峰，表明了au纳米颗粒的成功合成。
取0.2mg/ml的gdaudenp-ps水溶液进行水动力学直径和zeta电势测试，如表一所示，gdaudenp-ps水动力学直径在108.8nm，zeta电势为27.3mv，单分散性系数较小为0.422。
称取0.5mg的gdaudenp-ps粉末加入1ml王水(浓硝酸:浓盐酸＝1:3配置)消化2小时后加入3ml超纯水稀释进行原子发射光谱icp-oes测试，如表一所示，每摩尔gdaudenp-ps约含25.0mol和9.8mol的au和gd元素。
称取gdaudenp-ps粉末，配置成2mg/ml的超纯水溶液，滴于超薄碳膜上，烘干进行透射电镜(tem)测试。如图4a-b所示，gdaudenp-ps单分散性好，内部包裹的金纳米颗粒尺寸均一，在2.0nm左右。
表1gdaudenp-ps的zeta电势、水动力学直径和元素含量
实施例4
对实施例1步骤(2)制备的gdaudenp-ps进行抗非特异性蛋白吸附性能测试。
选用牛血清白蛋白(bsa)为模式蛋白，称取1mg的bsa溶解于2mlpbs中，使用紫外吸收光谱仪对其进行扫描，得到的结果如附图5a所示，bsa在278nm处有吸收峰。然后称取实施1中制备的gd-audenp-ps，分别配置成浓度为0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml和1mg/ml的pbs溶液，吸取0.5ml的bsa溶液分别加入刚刚配置好的gd-audenp-ps的溶液中，充分混匀后，分别测试其在278nm处的紫外吸收值(即为0h时的吸收值)。随后将混合溶液放置于37℃培养箱中2h后8000rpm离心5分钟，然后去除沉淀，再次测量其在278nm处的紫外吸收值(即为2h时的吸收值)，将所对应的孵育离心前后紫外吸收值相减即得紫外吸收差值。从附图5b可以看出，在最高浓度时，孵育前后的紫外吸收差值也仅有0.100。从而说明材料经过1,3-ps的修饰能够较好地降低材料的非特异性蛋白吸附。
实施例5
对实施例1步骤(2)制备的gdaudenp-ps进行材料稳定性测试。
将实施例1步骤(2)制备的gdaudenp-ps溶解于超纯水、pbs和rpmi1640培养基中配置成0.2mg/ml的溶液。如图6所示，可以发现，材料在三种不同的介质中都具有良好的分散性、溶解性。进一步测试三种介质中的gdaudenp-ps在10天内水动力学直径。如图7所示，可以发现10天内，gdaudenp-ps的水动力学直径无明显变化，表明所合成的材料稳定性良好。
实施例6
测试实施例1步骤(2)制备的gdaudenp-ps对t细胞的影响。
从小鼠脾脏中提取并收集t细胞后将t细胞按照5×105的密度种于12孔板中，与含gd-audenp-ps的培养基共孵育4小时(gd-audenp-ps浓度按金浓度计分别为10、25、50、75、100μm)，随后将细胞离心、洗涤并收集，icp-oes测定细胞中的au含量，计算得细胞吞噬效率。如图8a所示，t细胞对gd-audenp-ps有较好的吞噬效率，在au浓度为100μm，吞噬量为14.74pg/细胞。
从小鼠脾脏中提取并收集t细胞后将t细胞按照5×105的密度种于12孔板中，与含gd-audenp-ps的培养基共孵育4小时(gd-audenp-ps浓度按金浓度计算分别为0、10、50、100μm)后离心、洗涤、更换新鲜的培养基继续培养24小时。随后离心取细胞上清液进行elisa检测il-2细胞因子的含量。如图8b所示，gd-audenp-ps经验证不影响t细胞活力，一定浓度的gd-audenp-ps有助于刺激t细胞il-2细胞因子的产生。
实施例7
选取egfp质粒dna初探实施例1步骤(2)制备的gdaudenp-ps压缩基因和转染t细胞的能力。
首先进行凝胶阻滞实验，取gd-audenp-ps，将其配置成浓度为2mg/ml的超纯水溶液，采用定氮试剂盒测定gd-audenp-ps的氨基的个数，然后将gd-audenp-ps与egfppdna或pd-1sirna按照不同的氮磷比(0、0.25、0.5、1、2、3、4)孵育30分钟，孵育完之后进行琼脂糖凝胶电泳(100v，35分钟)。如图9a所示，gd-audenp-ps在n/p大于等于1的条件下就可以完全压缩egfppdna，具有很好的基因压缩能力。
将gd-audenp-ps与egfppdna(n/p＝0、0.25、0.5、1、2、3、4)复合，室温孵育30分钟，然后加入至1ml的pbs进行zeta电势和水动力学直径测试。如图9b-c，测试结果同样表明gd-audenp-ps在n/p大于等于1的条件下就可以完全压缩egfppdna。
最后进行egfp蛋白表达实验，从小鼠脾脏中提取并收集t细胞后将t细胞按5×105的密度种于12孔细胞培养板中，将gd-audenp-ps与egfppdna于不同n/p下(0、5、10、15、20、25)复合，与t细胞在有血清条件下，共孵育4小时(每孔1μgpdna)后更换新鲜培养基，转染24小时，使用荧光显微镜观测蛋白表达情况。如图9d所示，在n/p＝15时，转染效果最好，egfp表达量最多。
实施例8
实施例1步骤(3)中复合物drc的制备条件确立、表征和转染能力评价。
按与实施例6中一致的方法，取gd-audenp-ps与pd-1sirna(pd-1sirna购自上海吉玛基因公司，含19个碱基对，其意义链序列为5'-gcucacuucagguuuaccatt-3')按照不同的氮磷比(0、0.25、0.5、1、2、3、4)孵育30分钟后行凝胶阻滞实验。如图10a所示，实验结果表明gd-audenp-ps在n/p大于等于2的条件下能完全压缩pd-1sirna。
同样将gd-audenp-ps与pd-1sirna按不同n/p比(n/p＝0、0.25、0.5、1、2、3、4)复合，室温孵育30分钟，然后加入1ml的pbs进行zeta电势和水动力学直径测试。如图10b-c所示，测试结果同样表明gd-audenp-ps在n/p大于等于2的条件下能完全压缩pd-1sirna。
从小鼠脾脏中提取并收集t细胞，按照细胞以每孔1×105密度种植于24孔细胞培养板中，在将带有cy3标记的pd-1sirna按照不同的n/p值(n/p＝0、5、10、15、20、25)共同孵育30分钟，然后用此复合物分别在有血清和无血清下的培养液在37℃培养箱中培养4h。之后将所有孔板的细胞消化、离心、收集，用流式细胞仪检测样品的荧光强度(如图10d所示)。实验结果表明，在n/p＝15的时候，荧光强度最高，同时表明在有血清存在下gd-audenp-ps与pd-1sirna的t细胞内吞效果更好。
实施例9
将b16细胞按照每孔6×103的密度种植与96孔细胞培养板中，过夜、贴壁后更换成含au浓度为0、10、24、50、100、150、200μm的gd-audenp-ps或gd-audenp-ps/sipd-1(sirna含量均为1μg/孔)后培养24小时后，更换培养基为含10％cck-8溶液的无血清培养基，37℃培养箱中培养2h后用酶标仪在450nm波长下测定吸光度值，计算细胞活力。如图11所示，实施例1步骤(2)制备gd-audenp-ps及gd-audenp-ps/sipd-1复合物本身均不影响b16细胞的活力。
实施例10
对实施例1步骤(3)中复合物drc进行细胞内定位实验。
从小鼠脾脏中提取并收集t细胞，按照细胞以每孔1×105密度种植于24孔细胞培养板中，在含pbs、freesirna或drc的完全培养基条件下37℃培养箱中培养4h。培养结束后用pbs清洗三次，然后fitc标记的cd3抗体标记t细胞，随后用4％的戊二醛4℃固定15分钟，固定后用dapi染色15分钟，然后在共聚焦显微镜的油镜下观察细胞的荧光信号。如图12所示，实验结果表明，相比于pbs和单独的sirna组，drc处理的细胞的细胞质中显示了较强cy3的红色荧光强度。说明本发明制备的drc能很好的被t细胞内吞，进一步使得sirna发挥作用。
实施例11
评价实施例1步骤(3)中复合物drc转染t细胞后的pd-1基因沉默效果。
从小鼠脾脏中提取并收集t细胞后，按1×106种于12孔细胞培养板中，加入含pbs、gd-audenp/阴性对照sirna(sinc)复合物或gd-audenp/pd-1sirna(sipd-1)复合物，即drc(每孔2μgsirna)的rpmi1640培养基孵育4小时后，更换为含/不含5μg/ml的cona(一种能刺激t细胞活化并表达更多pd-1的有丝分裂原)的培养基刺激12小时，最后更换为新鲜不含cona的培养基继续培养24小时后，提取总蛋白、反转录进行实时荧光定量pcr(rt-pcr)测试。如图13所示，cona刺激t细胞表达了更多的pd-1mrna，drc介导的基因转染有效降低了pd-1的表达，相对于pbs组，mrna水平的pd-1沉默效率为39.6％。与此同时，gd-audenp/阴性对照sirna(sinc)复合物则对pd-1mrna的表达无明显影响。
另取t细胞1×106种于12孔细胞培养板中，加入含pbs、gd-audenp/阴性对照sirna(sinc)复合物或gd-audenp/pd-1sirna(sipd-1)复合物，即drc(每孔2μgsirna)的rpmi1640培养基孵育4小时后，更换为含/不含5μg/ml的cona(一种能刺激t细胞活化并表达更多pd-1的有丝分裂原)的培养基刺激12小时，最后更换为新鲜不含cona的培养基继续培养48小时后收集t细胞。重悬t细胞余1mlpbs中置于冰上，加入fitc绿色荧光标记pd-1抗体孵育30分钟，洗涤、收集、重悬于pbs中，进行流式细胞术测试。如图14a所示，drc介导的基因转染在蛋白水平也能有效降低t细胞pd-1的表达。如图14b的定量数据所示，相比于pbs组，蛋白水平沉默效率在47.8％。gd-audenp/阴性对照sirna(sinc)复合物仍无显著影响，表明材料本身对t细胞pd-1表达无影响。
实施例12
评价实施例1步骤(2)中gd-audenp-ps和t细胞负载的gd-audenp-ps在b16黑色素瘤荷瘤小鼠体内的ct/mr双模态成像效果。
取gd-audenp-ps配置成au浓度约为25μm，gd约为10μmpbs溶液，另收集吞噬了相近浓度gd-audenp-ps的t细胞pbs悬液，对小鼠进行静脉注射。在注射前和注射后30、60/90分钟时分别进行ct和mr成像扫描。
如图15a-b所示，gd-audenp-ps和t细胞负载的gd-audenp-ps都能得到增强的mr信号，且在60分钟时达到肿瘤部位信噪比(snr)的峰值。如图16a-b所示，gd-audenp-ps和t细胞负载的gd-audenp-ps也都能得到增强的ct信号，同样在60分钟时达到肿瘤部位ct值信号的峰值。相比之下，gd-audenp-ps的ct/mr成像效果更佳，可能是由于gd-audenp-ps尺寸更小，比t细胞负载的材料更易在小鼠体内循环达到肿瘤部位。
实施例13
评价实施例1步骤(3)中的drc、t细胞负载的drc及联合ido酶抑制剂epacadostat(ep)后对于b16黑色素瘤的抑制效果。
将取5-6周龄的雌性c57bl/6小黑鼠，每只皮下种植1.5×106的b16黑色素瘤，构建肿瘤模型至肿瘤体积达到0.4-0.6cm3后将小黑鼠随机分成6组，其中第一组：静脉注射pbs；第二组：ep口服给药；第三组：静脉注射drc；第四组：静脉注射t细胞负载的drc；第五组：ep口服给药 静脉注射drc，第六组：ep口服给药 静脉注射t细胞负载的drc。在治疗的第一天对各组小鼠静脉注射pbs、drc或t细胞负载的drc，其中pd-1sirna用量为1mg/kg每只小鼠。24小时后，进行ep的灌胃给药，每只小鼠用量在100mg/kg。10天的治疗周期中，每天测量和记录小鼠的体重变化，并测算相对肿瘤体积，计算公式如下：
肿瘤体积(v)＝a×b2/2(1)
*a和b分别代表肿瘤直径的最大值和最小值。
相对肿瘤体积＝v/v0(2)
*v和v0分别代表给药后的肿瘤体积和给药前的肿瘤体积。
如图17a所示，随着时间推移小鼠年龄增长且肿瘤体积增加，尤其是pbs组，小鼠体重也有所增加。如图17b所示，各个治疗组中的肿瘤抑制效果排序为：pbs＜ep＜drc-t＜drc＜drc-t ep＜drc ep，其中drc ep和drc-t ep两组的肿瘤抑制效果较好，肿瘤抑制效率在33.48％和26.17％。将治疗最后一天的肿瘤取出切片进行tunel染色，如图18所示，drc ep和drc-t ep两组的凋亡细胞数最多。定量数据如图19所示，drc ep和drc-t ep两组的tunel荧光强度相比于pbs分别增强了6.5和6.0倍。将治疗第10天的小鼠心、肝、脾、肺、肾、肿瘤取出进行h&e染色测试，如图20所示，不同治疗组的小鼠心、肝、脾、肺、肾、肿瘤均无明显病理出现，表明了drc的良好生物相容性，但与此同时，治疗组尤其是drc ep和drc-t ep两组肿瘤的切边染色中可以观测到更多的细胞质泄露和细胞核破裂，佐证了治疗组的体内抗肿瘤效果。
为验证免疫治疗及drc抗t细胞衰竭的功能，治疗过程中的第8天，如图21a所示，各组小鼠脾脏中的t细胞被提取并收集，与此同时，3周龄幼年鼠的脾脏t细胞被收集作为对照。按实施例11中的方法标记pd-1、cd4、cd8抗体后使用流式细胞仪对各组t细胞进行检测分析。如图21b-c所示，各个治疗组的t细胞pd-1表达量排序为：pbs＞ep＞drc-t＞drc＞drc-t ep＞drc ep；如图21d-g所示，drc-t ep和drc ep组的cd4 及cd8 效应t细胞表达最多，其中drc ep组的cd8 /cd4 的比值最高。这些结果表明治疗组使用静脉注射drc，在荷瘤鼠体内能有效地降低t细胞pd-1的表达，抗t细胞衰竭，同时产生更多的效应t细胞和关键性的肿瘤杀伤性t细胞，联合吲哚-2,3双加氧酶(ido)抑制剂——艾卡哚司他(epacadostat)能增强肿瘤免疫治疗。
同样在第8天，取小鼠的血清进行了细胞因子il-2，ifn-γ，tnf-α和kyn的检测，如图22所示，治疗组能有效增强t细胞活力，增强抗肿瘤促炎因子的产生，帮助更好的杀伤肿瘤细胞。另一方面，所有使用ep的治疗组，ido酶催化的下游产物kyn均有所下调，同时发现使用t细胞的实验组组本身对于kyn一定的下调作用。
实施例14
评价实施例1步骤(3)中的drc在正常小鼠衰老过程中的抗t细胞衰竭功能。
将取5-6周龄的雌性c57bl/6小黑鼠，随机分为两组，第一组：不作处理；第二组：静脉注射drc，每只小鼠在第1、2、3周每周静脉注射一次drc(sirna用量为1mg/kg)。于第8周(56天)时，对小鼠进行处死、提取脾脏t细胞进行pd-1表达的流式细胞术分析，及心、肝、脾、肺、肾h&e染色检测。如图23a-b所示，随着小鼠的正常衰老，t细胞的pd-1表达也有所增强，但连续三周注射了drc的小鼠组pd-1增加较未处理组减少了41.66％，说明drc在正常小鼠衰老过程中也能发挥一定的抗t细胞衰竭功能。与此同时，如图24所示，第56天未处理组和drc组的心、肝、脾、肺、肾h&e染色结果均无异常病理情况，进一步佐证了drc的良好生物安全性。
1.一种金钆杂化树状大分子材料，其特征在于，所述材料为第五代聚酰胺-胺pamam树状大分子g5.nh2表面修饰两性离子1,3-丙磺酸内酯1,3-ps和gd-dota螯合物、内部包裹金au纳米颗粒。
2.一种金钆杂化树状大分子材料的制备方法，包括：
(1)将dota-nhs溶液加入第五代聚酰胺-胺pamam树状大分子g5.nh2溶液中，水浴搅拌12-24小时，然后经透析纯化、冷冻干燥，得到dota修饰的g5.nh2-dota；
(2)将步骤(1)所得g5.nh2-dota溶于超纯水中，加入溶有两性离子1,3-ps的超纯水溶液，水浴搅拌反应12-24小时，得到两性离子修饰的g5.nh2-dota-ps溶液；
(3)将步骤(2)所得g5.nh2-dota-ps溶液置于冰浴中搅拌，加入haucl4·4h2o水溶液，搅拌15-30分钟后，迅速加入含nabh4冰水溶液，反应2-3小时，得到dota修饰的第五代树状大分子包裹纳米金颗粒，即{(au0)25-g5.nh2-dota10-ps10}denps的水溶液；
(4)将步骤(3)的{(au0)25-g5.nh2-dota10-ps10}denps的水溶液，用盐酸hcl调至ph＝6±0.1，加入含gd(no3)3·6h2o的水溶液，搅拌反应12-24小时后经透析纯化、冷冻干燥，得到金钆杂化树状大分子gdaudenp-ps。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中溶液的溶剂均为二甲基亚砜dmso；所述g5.nh2和dota-nhs的摩尔比为1:10.5～1:11；
所述水浴温度为30℃±1℃；透析采用截留分子量为8000～14000的纤维素透析膜在超纯水中透析2-3天。
4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中g5.nh2-dota与1,3-ps摩尔比为1:11～1:13，水浴温度为30℃±1℃；所述步骤(3)中g5.nh2-dota-ps与haucl4·4h2o摩尔比为1:25，haucl4·4h2o与nabh4的摩尔比为1:4～1:6。
5.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中{(au0)25-g5.nh2-dota10-ps10}denps与gd(no3)3·6h2o的摩尔比为1:15～20，反应温度为室温，透析采用截留分子量为8000～14000的纤维素透析膜在超纯水中透析1-3天。
6.一种金钆杂化树状大分子复合物，其特征在于，所述复合物为权利要求1所述金钆杂化树状大分子材料与pd-1sirna的复合物。
7.一种金钆杂化树状大分子复合物的制备方法，包括：
将权利要求1所述金钆杂化树状大分子材料溶于缓冲溶液中，然后与pd-1sirna溶液混匀后共孵育，得到金钆杂化树状大分子复合物。
8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，所述pd-1sirna的意义链序列为5'-gcucacuucagguuuaccatt-3'，pd-1sirna溶于焦碳酸二乙酯预处理过的超纯水中，gdaudenp-ps与pd-1sirna的用量氮磷比n/p为0.25～25，共孵育时间为20-30分钟。
9.一种权利要求6所述金钆杂化树状大分子复合物的应用，其特征在于，所述金钆杂化树状大分子复合物在制备体外t细胞基因转染，沉默pd-1表达药物、抗t细胞衰竭或肿瘤免疫治疗药物中的应用。
10.一种权利要求6所述金钆杂化树状大分子复合物制备ct/mr成像试剂中的应用。
技术总结