本发明属于生物材料领域，具体涉及一种共载阿霉素和吲哚菁绿的多糖基纳米粒子及其制备方法和应用。
背景技术：
癌症是人类面临的一个重大挑战，而化疗是癌症治疗的主要手段之一。阿霉素是一种广谱抗肿瘤化疗药，其通过插入和抑制dna的生物合成来杀死肿瘤细胞，适用于多种肿瘤治疗。然而，阿霉素与其他化疗药物一样，存在毒副作用大、易诱导癌细胞耐药等问题，从而导致癌症治疗失败。为克服这些缺陷，基于不同治疗模式的联合治疗为癌症治疗提供了新的思路。
光疗具有无创性、远程时空可控等优势，近些年引起广泛关注。光疗主要包括光热疗法和光动力疗法两种。光热疗法是利用光热制剂将光能转换成热能，通过提升局部温度促使细胞凋亡，从而杀死肿瘤细胞；光动力疗法涉及光、光敏剂和氧气，光敏剂在特定波长光激发下，发生氧依赖性光化学反应，产生高细胞毒性的活性氧，从而引发肿瘤细胞氧化应激反应并导致其死亡。吲哚菁绿是目前唯一被美国食品药物管理局批准用于临床的近红外成像试剂。同时，其能够在光激发时产生热量用于光热治疗，并产生活性氧用于光动力治疗。因此，吲哚菁绿可同时作为光热剂和光敏剂来实现光热治疗和光动力学疗法的协同治疗。然而，吲哚菁绿存在水稳定性差、浓度依赖性聚集、易从体内排出等问题，其临床应用受到很大限制。因此，研发一种具有靶向功能、毒副作用小、能克服吲哚菁绿的缺陷，并能联合阿霉素的抗肿瘤联合治疗体系具有极其重要的意义。
利用纳米粒子作为药物载体以提高癌症治疗效果、减少毒副作用是已被公认的有效方法。然而，多数纳米粒子在递送药物过程中会出现泄漏，且难以实现药物的快速可控释放。近年来，利用聚电解质层层自组装方法制备的纳米粒子，既可以使荷电药物载于载体表面而不影响内部药物的负载，又可经过表面功能化设计赋予载体肿瘤靶向性和药物刺激响应性释放功能，并可通过多层结构保护负载药物，从而避免其在递送过程中提前泄露。在聚电解质研究中，天然多糖具有来源丰富、无毒、生物相容性和生物可降解性好等优点，对其研究备受关注。其中，壳聚糖作为天然多糖，电离常数pka约为6.5，在中性条件下呈现阳离子特性，常用于不同物质的表面修饰；透明质酸作为阴离子型多糖，常用于层层自组装法构建复合物。因此，透明质酸、壳聚糖及其水溶性衍生物在层层自组装法构建聚电解质复合物及药物递送领域开发潜力大。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种共载阿霉素和吲哚菁绿的多糖基纳米粒子及其制备方法和应用，该制备方法制得的纳米粒子具有生物相容性好、粒径可调、ph刺激响应性及肿瘤主动靶向功能，可用于多种实体肿瘤的光疗/化疗联合治疗。
为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现：
一种共载阿霉素和吲哚菁绿的多糖基纳米粒子的制备方法，将共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米颗粒置于pbs缓冲液中，在冰浴超声条件下滴加醛基化透明质酸溶液，反应0.5～24小时后经离心水洗后重悬于去离子水中，再在冰浴超声条件下滴加水溶性壳聚糖溶液，反应0.5～24小时后进行离心水洗、重悬于pbs缓冲液中，最后滴加带靶向配体的醛基化透明质酸溶液，反应0.5～24小时后离心水洗，得到共载阿霉素和吲哚菁绿的多糖基纳米粒子。
本发明进一步的改进在于，醛基化透明质酸溶液的浓度为1～10mg/ml，醛基化透明质酸溶液中醛基化透明质酸的氧化度为40％～100％；水溶性壳聚糖溶液的浓度为1～10mg/ml；水溶性壳聚糖溶液的ph值为6.0～6.4。
本发明进一步的改进在于，带靶向配体的醛基化透明质酸溶液的浓度为1～10mg/ml；
醛基化透明质酸、水溶性壳聚糖或带靶向配体的醛基化透明质酸与载阿霉素和吲哚菁绿的纳米颗粒的质量比例均为(0.1～1)：1；
靶向配体为半乳糖胺、rgd肽或irgd肽；
带靶向配体的醛基化透明质酸溶液中的醛基化透明质酸的氧化度为5％～20％。
本发明进一步的改进在于，带靶向配体的醛基化透明质酸的制备方法是：按靶向配体和醛基化透明质酸上醛基物质的量比为1:(2～10)，将靶向配体加入到醛基化透明质酸溶液中，然后加入配体物质的量1.1～1.5倍量的氰基硼氢化钠，将配体上氨基与醛基形成的亚胺键还原成稳定的c-n键，经3000da透析袋对水透析24～72小时后在零下20摄氏度进行冷冻干燥，得到带靶向配体的醛基化透明质酸。
本发明进一步的改进在于，共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米颗粒通过以下过程制得：
(1)利用高碘酸钠氧化法合成氧化度为40％～100％的醛基化透明质酸，经纯化处理后配制成溶液，然后滴加阿霉素水溶液，反应0.5～24小时后进行离心水洗，得到载阿霉素的透明质酸纳米粒；其中，阿霉素与醛基化透明质酸的质量比例为1：(1-10)；
(2)将水溶性壳聚糖溶于ph值为6.0～6.4的pbs缓冲液中制成水溶液，然后与吲哚菁绿溶液混合均匀，反应0.5～24小时后进行离心水洗，得到载吲哚菁绿的水溶性壳聚糖纳米粒；其中，吲哚菁绿与水溶性壳聚糖的质量比为1：(1-10)；
(3)共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米颗粒的制备：将载阿霉素的透明质酸纳米粒悬于纯水中，得到溶液a，将载吲哚菁绿的水溶性壳聚糖纳米粒悬于ph值为6.0～6.4的pbs缓冲液中，得到溶液b，将溶液a与溶液b混合，经冰浴超声混合后反应0.5～24小时，离心水洗，得到共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米颗粒；其中，载吲哚菁绿的水溶性壳聚糖纳米粒与载阿霉素的醛基化透明质酸纳米粒的质量比例为1：(2-10)。
本发明进一步的改进在于，步骤(1)中，利用高碘酸钠氧化法合成氧化度为40％～100％的醛基化透明质酸的具体过程为：在质量浓度为0.1～10％透明质酸水溶液中加入透明质酸中重复结构单元摩尔数0.4～1.0的高碘酸钠，室温下避光反应2～24h，然后加入与高碘酸钠摩尔比≥1:1的乙二醇终止反应，在去离子水中透析纯化24～72h，得到理论氧化度为40～100％醛基化透明质酸。
本发明进一步的改进在于，透明质酸的分子量为2kda～200kda；
步骤(1)中溶液的浓度为1～10mg/ml，阿霉素水溶液的浓度为1～10mg/ml。
本发明进一步的改进在于，步骤(2)中水溶性壳聚糖为羟乙基壳聚糖与羟丙基壳聚糖、羧甲基壳聚糖或羧丙基壳聚糖，水溶性壳聚糖的分子量为2kda～200kda，脱乙酰度为60％～90％，水溶液的浓度为1～10mg/ml，吲哚菁绿溶液的浓度为1～10mg/ml；
步骤(3)中溶液a与溶液b的浓度均为2.0mg/ml。
一种根据上述方法制备的共载阿霉素和吲哚菁绿的多糖基纳米粒子，其特征在于，该纳米粒子粒径范围100-200nm，具有ph刺激响应性和主动靶向肿瘤功能。
一种如上所述的共载阿霉素和吲哚菁绿的多糖基纳米粒子在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明制备的共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米粒子的粒径在100～200nm范围内可调，且粒径分布均一、形貌呈近球形；
(2)本发明提供的多糖基纳米粒子的载体成分为水溶性壳聚糖和透明质酸，均为天然高分子材料，具有生物相容性好、可生物降解、无毒等优点；
(3)本发明制得的纳米粒子中的阿霉素和吲哚菁绿分别经希夫碱和静电作用装载于载体上，可响应肿瘤弱酸性微环境而释放药物，既可防止药物在递送过程中的泄露，又可在靶点处快速释放药物；
(4)本发明制得的纳米粒子可实现多种实体瘤的光疗/化疗联合治疗，且其配体可实现主动靶向肿瘤的功能，有望显著改善肿瘤治疗效果和降低毒副作用；
(5)本发明制得的纳米粒子是通过自组装过程形成的，制备方法简单、原料来源丰富、药物装载和纳米粒形成同步实现，并且纳米粒子在中性条件下稳定性好、纯化工艺简单。
附图说明
图1是实施例1合成的醛基化透明质酸和羟乙基壳聚糖的1h-nmr谱图，其中，a为醛基化透明质酸，b为羟乙基壳聚糖。
图2是实施例1合成的共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米粒子的粒径分布图。
图3是实施例1合成的共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米粒子的透射电镜图。
图4是实施例1合成的共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米粒子在不同ph值下阿霉素和吲哚菁绿的释放行为。
图5是实施例1合成的共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米粒子的光热效果。
图6是实施例1合成的共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米粒子处理hepg2细胞后细胞内活性氧的产生效果。
图7是实施例1合成的共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米粒子对细胞增殖的抑制效果。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步描述，但本发明并不限于此。
本发明的一种共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米粒子的制备方法，首先阿霉素和吲哚菁绿分别经席夫碱键和静电作用装载于醛基化透明质酸和水溶性壳聚糖上，将它们按一定比例混合后形成载阿霉素和吲哚菁绿的纳米颗粒，然后再经层层自组装过程修饰上醛基化透明质酸、水溶性壳聚糖和带靶向配体的醛基化透明质酸，得到共载阿霉素和吲哚菁绿的多糖基纳米粒子。具体包括如下步骤：
(1)载阿霉素的醛基化透明质酸纳米粒的制备：利用高碘酸钠氧化法合成氧化度为40％～100％或5％～20％的醛基化透明质酸，其中氧化度为40％～100％的醛基化透明质酸经纯化处理后配制成1～10mg/ml的溶液，然后滴加浓度为1～10mg/ml的阿霉素水溶液，在室温反应0.5～24小时后进行离心水洗，得到载阿霉素的透明质酸纳米粒。
(2)载吲哚菁绿的水溶性壳聚糖的制备：将水溶性壳聚糖溶于ph值为6.0～6.4的pbs缓冲液中制成浓度为1～10mg/ml的水溶液，将其与浓度为1～10mg/ml的吲哚菁绿溶液混合均匀，在室温反应0.5～24小时后进行离心水洗，得到载吲哚菁绿的水溶性壳聚糖纳米粒。
(3)共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米颗粒的制备：将步骤(1)和步骤(2)中形成的纳米颗粒分别用纯水和ph值为6.0～6.4的pbs缓冲液配制成2.0mg/ml的悬浮液，然后按照体积比为(2～10):1进行混合，经冰浴超声混合后反应0.5～24小时后进行离心水洗，得到共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米颗粒。
(4)层层自组装法制备多糖基纳米粒子：将步骤(3)得到的纳米颗粒置于ph值为6.0～6.4的pbs缓冲液中，在冰浴超声条件下滴加浓度为1～10mg/ml、氧化度为40％～100％的醛基化透明质酸溶液(溶液与纳米颗粒相比为过量)，反应0.5～24小时后经离心水洗后重悬于去离子水中，再在冰浴超声条件下滴加浓度为1～10mg/ml的水溶性壳聚糖溶液(ph值为6.0～6.4)，反应0.5～24小时后进行离心水洗、重悬于ph值为6.0～6.4的pbs缓冲液中，最后滴加浓度为1～10mg/ml的带靶向配体的、氧化度为5～20％的醛基化透明质酸溶液，反应0.5～24小时后离心水洗，得到共载阿霉素和吲哚菁绿的多糖基纳米粒子。
所述步骤(1)中的高碘酸钠氧化法的具体过程为在质量浓度为0.1～10％透明质酸水溶液中加入与透明质酸重复结构单元(由β-1.3糖苷键将d葡萄糖醛酸与n-乙酰-d-氨基葡萄糖胺相连构成的双糖单元)摩尔数0.4～1.0或0.05～0.2倍的高碘酸钠，室温下避光反应2～24h，然后加入与高碘酸钠摩尔比≥1:1的乙二醇终止反应，去离子水中透析纯化24～72h，得到氧化度为40～100％或者5～20％的醛基化透明质酸。
所述步骤(1)中的阿霉素与醛基化透明质酸的质量比为1：(1-10)。
所述步骤(2)中的水溶性壳聚糖为羟烷基壳聚糖，如羟乙基壳聚糖和羟丙基壳聚糖，以及羧基化壳聚糖，如羧甲基壳聚糖和羧丙基壳聚糖等。
所述步骤(2)中的吲哚菁绿与水溶性壳聚糖的质量比为1：(1-10)。
所述步骤(3)中的载吲哚菁绿的水溶性壳聚糖与载阿霉素的醛基化透明质酸的质量比为1：(2-10)。
步骤(4)中的醛基化透明质酸、水溶性壳聚糖与带有靶向配体的醛基化透明质酸中的一种与载阿霉素和吲哚菁绿的纳米颗粒的质量比为(0.1～1)：1。
所述步骤(4)中的靶向配体为半乳糖胺、rgd肽或irgd肽等。
所述步骤(4)中的带有靶向配体的醛基化透明质酸的制备方法是，按配体和醛基化透明质酸上醛基比例为1:(2～10)将配体加入醛基化透明质酸溶液中，然后加入配体物质的量1.1～1.5倍量的氰基硼氢化钠，将配体氨基与醛基形成的亚胺键还原成稳定的c-n键，经3000da透析袋对水透析24～72小时后在零下20摄氏度进行冷冻干燥透，得到所需的带有靶向配体的醛基化透明质酸。
所述的透明质酸的分子量为2kda～200kda，所述的水溶性壳聚糖的分子量为2kda～200kda，脱乙酰度为60％～90％。
所述步骤(4)的带有靶向配体的醛基化透明质酸的氧化度为5％～20％。
所述的离心的转速为8000转/分钟、时间为5分钟、次数为3次。
所述步骤(1)至(4)中涉及阿霉素或者吲哚菁绿时，均在避光条件下进行。
采用上述方法获得的一种共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米粒子，该纳米粒子生物相容性好、粒径范围100-200nm、具有ph刺激响应性和主动靶向肿瘤功能，可用于多种肿瘤的光疗/化疗联合治疗目的。
下面为具体实施例。
实施例1
(1)载阿霉素的醛基化透明质酸纳米粒的制备：利用高碘酸钠氧化法合成氧化度为40％的醛基化透明质酸(mw＝8kda)，其具体过程为在质量浓度为1.0％透明质酸水溶液中加入透明质酸结构单元0.4倍摩尔量的高碘酸钠，室温下避光反应8h，然后加入2ml乙二醇终止反应，去离子水中透析纯化48h，得到理论氧化度为40％的醛基化透明质酸；
将此醛基化透明质酸配制成浓度为6mg/ml的溶液，然后按照阿霉素与醛基化透明质酸的质量比例为1：6的比例滴加浓度为2mg/ml的阿霉素水溶液，室温反应0.5小时后进行离心水洗，得到载阿霉素的透明质酸纳米颗粒。
(2)载吲哚菁绿的羟乙基壳聚糖的制备：将羟乙基壳聚糖(mw＝170kda)溶于ph值为6.0的pbs缓冲液中制成浓度为6mg/ml的水溶液，然后按照吲哚菁绿与羟乙基壳聚糖的质量比例为1：6的比例将其与浓度为2mg/ml的吲哚菁绿溶液混合均匀，在室温反应0.5小时后进行离心水洗，得到载吲哚菁绿的羟乙基壳聚糖纳米颗粒。
(3)共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米颗粒的制备：将载阿霉素的醛基化透明质酸悬于纯水中，得到悬液a，浓度为2.0mg/ml，将载吲哚菁绿的羟乙基壳聚糖纳米颗粒悬于ph值为6的pbs缓冲液中，得到悬液b，浓度为2.0mg/ml，然后将溶液a和溶液b按照体积比为3：1进行混合，经冰浴超声混合后反应0.5小时后进行离心水洗，得到共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米颗粒。
(4)层层自组装法制备多糖基纳米粒子：将共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米颗粒置于ph值为6.0的pbs缓冲液中，在冰浴超声条件下滴加浓度为1mg/ml、氧化度为40％的醛基化透明质酸溶液，反应0.5小时后经离心水洗后重悬于去离子水中，再在冰浴超声条件下滴加浓度为1mg/ml的水溶性壳聚糖溶液(ph值为6.0)，反应0.5小时后进行离心水洗、重悬于ph值为6.0的pbs缓冲液中，最后滴加浓度为1mg/ml的半乳糖胺修饰的、氧化度为8％的醛基化透明质酸溶液，反应0.5小时后离心水洗，最终得到共载阿霉素和吲哚菁绿的多糖基纳米粒子。
其中，醛基化透明质酸、水溶性壳聚糖、半乳糖胺修饰的醛基化透明质酸与共载阿霉素和吲哚菁绿的多糖基纳米粒子的质量比例均为0.2：1；半乳糖胺修饰的醛基化透明质酸的制备方法是，按半乳糖胺和醛基化透明质酸上醛基摩尔比例为1:10，将半乳糖胺加入醛基化透明质酸溶液中，然后加入半乳糖胺物质的量1.5倍量的氰基硼氢化钠，将半乳糖胺中氨基与醛基形成的亚胺键还原成稳定的c-n键，经3000da透析袋对水透析24小时后在零下20摄氏度进行冷冻干燥透，得到半乳糖胺修饰的醛基化透明质酸。
从图1中的a和b可以看出，1h-nmr谱图表明醛基化透明质酸和羟乙基壳聚糖各个组分质子的化学位移均得到了很好地鉴定，说明它们的合成是成功的。
从图2可以看出，所合成的共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米粒子粒径均集中于180nm附近，符合纳米药物载体对粒径的要求。
从图3可以看出，合成的共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米粒子呈现出近球形结构。
体外药物释放行为的研究。采用透析法评估本实施例合成的共载阿霉素和吲哚菁绿的多糖基纳米粒的体外药物释放能力。具体操作如下：通过超声分散，配制浓度为1mg/ml的载药纳米粒子分散液，分别取5ml分散液装入四个截留分子量为1000da的透析袋中，将透析袋分别放入100ml含谷胱甘肽的ph＝5.5和ph＝7.4以及单纯ph＝5.5和ph＝7.4的pbs溶液中，置于摇床上振荡。在设定的时间节点，取出2ml透析液，并换入2ml新鲜的pbs缓冲溶液，用紫外及可见光分光光度计测取出液体在480nm处的吸光度，即阿霉素的吸光值，在780nm处的吸光度，即吲哚菁绿的吸光值。
图4表示合成的共载阿霉素和吲哚菁绿的多糖基纳米粒在不同ph环境下的体外药物释放曲线图；可以看到，在ph＝5.5的条件下，席夫碱键和静电相互作用易被破坏，从而将包裹于内部的阿霉素和吲哚菁绿快速地释放出来。说明合成的共载阿霉素和吲哚菁绿的多糖基纳米粒具有ph响应性。
体外光热性质研究。采用在近红外辐照期间纳米粒子温度的变化评估其光热性质。首先将pbs、游离吲哚菁绿、未修饰半乳糖胺的共载阿霉素和吲哚菁绿的多糖基纳米粒和共载阿霉素和吲哚菁绿的多糖基纳米粒悬液用808nm的近红外光(1.0w/cm2)辐照5min，监控各自温度变化。
从图5可以看出，在最初的3min内，游离吲哚菁绿、未修饰半乳糖胺的共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米粒子以及共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米粒子溶液温度均迅速提升，之后由于游离吲哚菁绿分子间的淬灭，游离吲哚菁绿组温度缓慢下降；而未修饰半乳糖胺的共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米粒子以及共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米粒子的溶液温度继续上升达到55.9℃和57.7℃后才开始缓慢下降，这说明纳米粒子改善了游离吲哚菁绿的稳定性。并且纳米粒子包埋吲哚菁绿反而比游离吲哚菁绿溶液能够更有效地产生近红外依赖的温度增加。另外，作为对照，pbs在近红外辐照时，仅有轻微的温度增加。这些都说明了所合成的共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米粒子具有良好的光热效应。
细胞内活性氧(ros)的产生(光动力性质)。采用dcfh-da法对人肝肿瘤细胞(hepg2)产生ros进行染色。将hepg2细胞按密度为5×104个/孔接种于6孔培养板中，在37℃含5％co2的培养箱中培养24小时，再与游离吲哚菁绿、未修饰半乳糖胺的共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米粒和共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米粒孵育24小时，加入20μmdcfh-da孵育20分钟，用808纳米、1.0w/cm2近红外辐照射6孔板5min。随后用流式细胞仪记录dcf的荧光强度来量化ros的产生。
从图6可以看出相较于游离吲哚菁绿组和未修饰半乳糖胺的共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米粒子组，共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米粒子诱导的hepg2细胞组显示出更强的荧光强度，说明其能够诱导产生更多的活性氧。说明了所合成的共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米粒子具有光动力治疗癌症的潜力。
共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米粒的细胞毒性测试。采用常规的四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(mtt法)来检测共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米粒抑制人肝肿瘤细胞(hepg2)增殖的能力。首先把hepg2细胞接种到96孔培养板上进行培养。将其放置于37℃，5％co2条件下培养12h后加入不同浓度的纳米粒子溶液继续培养48h。在培养板的每个小孔中加入20μl的mtt溶液(5mg/ml)，培养了4h后吸走上清液并加入200μl的二甲基亚砜去溶解形成的甲瓒晶体。采用酶标仪检测每个孔在492nm处的吸光度(od)。测试结果见图7，从图7可以看到，相较游离药物和未修饰半乳糖胺的共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米粒子组，共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米粒子处理hepg2细胞组显示出更好的肿瘤细胞抑制效果。
实施例2
(1)载阿霉素的醛基化透明质酸纳米粒的制备：利用高碘酸钠氧化法合成氧化度为40％的醛基化透明质酸(mw＝8kda)，其具体过程为在质量浓度为1.0％透明质酸水溶液中加入透明质酸重复结构单元摩尔数0.4倍的高碘酸钠，室温下避光反应24h，然后加入2ml乙二醇终止反应，去离子水中透析纯化72h，得到理论氧化度为40％的醛基化透明质酸；
将此醛基化透明质酸配制成浓度为6mg/ml的溶液，然后按照阿霉素与醛基化透明质酸的质量比例为1：5的比例滴加浓度为2mg/ml的阿霉素水溶液，在室温反应24小时后进行离心水洗，得到载阿霉素的透明质酸纳米颗粒。
(2)载吲哚菁绿的羟乙基壳聚糖的制备：将羟乙基壳聚糖(mw＝170kda)溶于ph值为6.0的pbs缓冲液中制成浓度为6mg/ml的水溶液，然后按照吲哚菁绿与羟乙基壳聚糖的质量比例为1：5的比例将其与浓度为2mg/ml的吲哚菁绿溶液混合均匀，在室温反应0.5小时后进行离心水洗，得到载吲哚菁绿的羟乙基壳聚糖纳米粒。
(3)共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米颗粒的制备：将载阿霉素的醛基化透明质酸悬于纯水中，得到溶液a，浓度为2.0mg/ml，将载吲哚菁绿的羟乙基壳聚糖纳米颗粒悬于ph值为6的pbs缓冲液中，得到溶液b，浓度为2.0mg/ml，然后将溶液a和溶液b按照体积比为4：1进行混合，经冰浴超声混合后反应24小时后进行离心水洗，得到共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米颗粒。
(4)层层自组装法制备多糖基纳米粒子：将共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米颗粒置于ph值为6.0的pbs缓冲液中，在冰浴超声条件下滴加浓度为2mg/ml、氧化度为40％的醛基化透明质酸溶液，反应24小时后经离心水洗后重悬于去离子水中，再在冰浴超声条件下滴加浓度为2mg/ml的水溶性壳聚糖溶液(ph值为6.0)，反应24小时后进行离心水洗、重悬于ph值为6.0的pbs缓冲液中，最后滴加浓度为2mg/ml的、氧化度为10％的半乳糖胺修饰的醛基化透明质酸溶液，反应24小时后离心水洗，最终得到共载阿霉素和吲哚菁绿的多糖基纳米粒子。
其中，醛基化透明质酸、水溶性壳聚糖、靶向配体半乳糖胺修饰的醛基化透明质酸中的一种与共载阿霉素和吲哚菁绿的多糖基纳米粒子的质量比例均为0.2：1；靶向配体半乳糖胺修饰的醛基化透明质酸的制备方法是，按半乳糖胺和醛基化透明质酸上醛基比例为1:10将半乳糖胺加入醛基化透明质酸溶液中，然后加入半乳糖胺物质的量1.5倍量的氰基硼氢化钠，将半乳糖胺氨基与醛基形成的亚胺键还原成稳定的c-n键，经3000da透析袋对水透析24小时后在零下20摄氏度进行冷冻干燥，得到所需的靶向配体半乳糖胺修饰的醛基化透明质酸。
实施例3
(1)载阿霉素的醛基化透明质酸纳米粒的制备：利用高碘酸钠氧化法合成氧化度为40％的醛基化透明质酸(mw＝170kda)，其具体过程为在质量浓度为1.0％透明质酸水溶液中加入与透明质酸中重复结构单元摩尔数0.4倍的高碘酸钠，室温下避光反应24h，然后加入2ml乙二醇终止反应，去离子水中透析纯化72h，得到理论氧化度为40％的醛基化透明质酸；
将此醛基化透明质酸配制成浓度为6mg/ml的溶液，然后按照阿霉素与醛基化透明质酸的质量比例为1：5的比例滴加浓度为2mg/ml的阿霉素水溶液，按照在室温反应24小时后进行离心水洗，得到载阿霉素的透明质酸纳米颗粒。
(2)载吲哚菁绿的羟乙基壳聚糖的制备：将羟乙基壳聚糖(mw＝170kda)溶于ph值为6.0的pbs缓冲液中制成浓度为6mg/ml的水溶液，然后按照吲哚菁绿与羟乙基壳聚糖的质量比例为1：5的比例将其与浓度为2mg/ml的吲哚菁绿溶液混合均匀，在室温反应0.5小时后进行离心水洗，得到载吲哚菁绿的羟乙基壳聚糖纳米颗粒。
(3)共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米颗粒的制备：将载阿霉素的醛基化透明质酸悬于纯水中，得到溶液a，浓度为2.0mg/ml，将载吲哚菁绿的羟乙基壳聚糖纳米颗粒悬于ph值为6的pbs缓冲液中，得到溶液b，浓度为2.0mg/ml，然后将溶液a和溶液b按照体积比为4：1进行混合，经冰浴超声混合后反应24小时后进行离心水洗，得到共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米颗粒。
(4)层层自组装法制备多糖基纳米粒子：将共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米颗粒置于ph值为6.0的pbs缓冲液中，在冰浴超声条件下滴加浓度为2mg/ml、氧化度为40％的醛基化透明质酸溶液，反应24小时后经离心水洗后重悬于去离子水中，再在冰浴超声条件下滴加浓度为2mg/ml的水溶性壳聚糖溶液(ph值为6.0)，反应24小时后进行离心水洗、重悬于ph值为6.0的pbs缓冲液中，最后滴加浓度为2mg/ml的、氧化度为20％的半乳糖胺修饰的醛基化透明质酸溶液，反应24小时后离心水洗，最终得到共载阿霉素和吲哚菁绿的多糖基纳米粒子。
其中，醛基化透明质酸、水溶性壳聚糖、半乳糖胺修饰的醛基化透明质酸中的一种与共载阿霉素和吲哚菁绿的多糖基纳米粒子的质量比例均为0.2：1；半乳糖胺修饰的醛基化透明质酸的制备方法是，按半乳糖胺和醛基化透明质酸上醛基比例为1:10将半乳糖胺加入醛基化透明质酸溶液中，然后加入配体物质的量1.5倍量的氰基硼氢化钠，将配体氨基与醛基形成的亚胺键还原成稳定的c-n键，经3000da透析袋对水透析24小时后在零下20摄氏度进行冷冻干燥透，得到所需的半乳糖胺修饰的醛基化透明质酸。
1.一种共载阿霉素和吲哚菁绿的多糖基纳米粒子的制备方法，其特征在于，将共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米颗粒置于pbs缓冲液中，在冰浴超声条件下滴加醛基化透明质酸溶液，反应0.5～24小时后经离心水洗后重悬于去离子水中，再在冰浴超声条件下滴加水溶性壳聚糖溶液，反应0.5～24小时后进行离心水洗、重悬于pbs缓冲液中，最后滴加带靶向配体的醛基化透明质酸溶液，反应0.5～24小时后离心水洗，得到共载阿霉素和吲哚菁绿的多糖基纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的一种共载阿霉素和吲哚菁绿的多糖基纳米粒子的制备方法，其特征在于，醛基化透明质酸溶液的浓度为1～10mg/ml，醛基化透明质酸溶液中醛基化透明质酸的氧化度为40％～100％；水溶性壳聚糖溶液的浓度为1～10mg/ml；水溶性壳聚糖溶液的ph值为6.0～6.4。
3.根据权利要求1所述的一种共载阿霉素和吲哚菁绿的多糖基纳米粒子的制备方法，其特征在于，带靶向配体的醛基化透明质酸溶液的浓度为1～10mg/ml；
醛基化透明质酸、水溶性壳聚糖或带靶向配体的醛基化透明质酸与载阿霉素和吲哚菁绿的纳米颗粒的质量比例均为(0.1～1)：1；
靶向配体为半乳糖胺、rgd肽或irgd肽；
带靶向配体的醛基化透明质酸溶液中的醛基化透明质酸的氧化度为5％～20％。
4.根据权利要求1所述的一种共载阿霉素和吲哚菁绿的多糖基纳米粒子的制备方法，其特征在于，带靶向配体的醛基化透明质酸的制备方法是：按靶向配体和醛基化透明质酸上醛基物质的量比为1:(2～10)，将靶向配体加入到醛基化透明质酸溶液中，然后加入配体物质的量1.1～1.5倍量的氰基硼氢化钠，将配体上氨基与醛基形成的亚胺键还原成稳定的c-n键，经3000da透析袋对水透析24～72小时后在零下20摄氏度进行冷冻干燥，得到带靶向配体的醛基化透明质酸。
5.根据权利要求1所述的一种共载阿霉素和吲哚菁绿的多糖基纳米粒子的制备方法，其特征在于，共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米颗粒通过以下过程制得：
(1)利用高碘酸钠氧化法合成氧化度为40％～100％的醛基化透明质酸，配制成溶液，然后滴加阿霉素水溶液，反应0.5～24小时后进行离心水洗，得到载阿霉素的透明质酸纳米粒；其中，阿霉素与醛基化透明质酸的质量比例为1：(1-10)；
(2)将水溶性壳聚糖溶于ph值为6.0～6.4的pbs缓冲液中制成水溶液，然后与吲哚菁绿溶液混合均匀，反应0.5～24小时后进行离心水洗，得到载吲哚菁绿的水溶性壳聚糖纳米粒；其中，吲哚菁绿与水溶性壳聚糖的质量比为1：(1-10)；
(3)共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米颗粒的制备：将载阿霉素的透明质酸纳米粒悬于纯水中，得到溶液a，将载吲哚菁绿的水溶性壳聚糖纳米粒悬于ph值为6.0～6.4的pbs缓冲液中，得到溶液b，将溶液a与溶液b混合，经冰浴超声混合后反应0.5～24小时，离心水洗，得到共载阿霉素和吲哚菁绿的纳米颗粒；其中，载吲哚菁绿的水溶性壳聚糖纳米粒与载阿霉素的醛基化透明质酸纳米粒的质量比例为1：(2-10)。
6.根据权利要求5所述的一种共载阿霉素和吲哚菁绿的多糖基纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，利用高碘酸钠氧化法合成氧化度为40％～100％的醛基化透明质酸的具体过程为：在质量浓度为0.1～10％透明质酸水溶液中加入透明质酸中重复结构单元摩尔数0.4～1.0的高碘酸钠，室温下避光反应2～24h，然后加入与高碘酸钠摩尔比≥1:1的乙二醇终止反应，在去离子水中透析纯化24～72h，得到理论氧化度为40～100％醛基化透明质酸。
7.根据权利要求6所述的一种共载阿霉素和吲哚菁绿的多糖基纳米粒子的制备方法，其特征在于，透明质酸的分子量为2kda～200kda；
步骤(1)中溶液的浓度为1～10mg/ml，阿霉素水溶液的浓度为1～10mg/ml。
8.根据权利要求5所述的一种共载阿霉素和吲哚菁绿的多糖基纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤(2)中水溶性壳聚糖为羟乙基壳聚糖与羟丙基壳聚糖、羧甲基壳聚糖或羧丙基壳聚糖，水溶性壳聚糖的分子量为2kda～200kda，脱乙酰度为60％～90％，水溶液的浓度为1～10mg/ml，吲哚菁绿溶液的浓度为1～10mg/ml；
步骤(3)中溶液a与溶液b的浓度均为2.0mg/ml。
9.一种根据权利要求1-8中任意一项所述方法制备的共载阿霉素和吲哚菁绿的多糖基纳米粒子，其特征在于，该纳米粒子粒径范围100-200nm，具有ph刺激响应性和主动靶向肿瘤功能。
10.一种如权利要求9所述的共载阿霉素和吲哚菁绿的多糖基纳米粒子在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。
技术总结