本发明涉及生物工程及医药技术领域，具体涉及一种蛋白质纳米颗粒用于制备抗vsv病毒产品的用途。
背景技术：
病毒作为细胞外的一类病原体，需要借助宿主完成一系列的生命活动。通常情况下，病毒和宿主能够共同进化，从而促进病毒与宿主的共生。病毒感染新的宿主一般被称为突发性感染事件，相比于共生的病毒而言，它不易快速鉴定分析出病毒表型，同时具有更强的病原性、致病性以及致死性。
病毒缺少增殖所需的完整系统，需要借助宿主细胞来完成复制。病毒感染宿主细胞通常包括以下六步：吸附、侵入、脱壳、生物合成、组装和释放。病毒由于其传播感染途径、特性和机制各有特点，抗病毒药物的作用机制也分为多种类型，比如直接抑制或杀灭病毒、干扰病毒吸附、阻止病毒穿入细胞、抑制病毒生物合成、抑制病毒释放、增强宿主抗病毒能力等。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种蛋白质纳米颗粒用于制备抑制vsv病毒复制和/或抗vsv病毒产品的用途，该蛋白质纳米颗粒在病毒感染的情况下，能够显著提高rig-i、mavs、p-irf3水平，促进ifn-β细胞因子的释放，从而引起了更为有效的天然免疫反应，显著抑制了病毒的复制。
为此，本发明的第一方面，提供一种蛋白质纳米颗粒，所述蛋白质纳米颗粒由蛋白质单体经金属离子诱导而自组装形成，所述蛋白质单体包括由金属硫蛋白、连接肽、谷胱甘肽硫转移酶以从氨基端到羧基端的顺序依次连接组成的融合蛋白。
进一步，所述金属离子选自下组：fe2 、mn2 、zn2 、cu2 、cr3 ，优选为fe2 。
谷胱甘肽硫转移酶(glutathiones-transferases,gst)主要包括4个家族：a、m、t、p，在本发明的技术方案中，优选gstp1。
进一步，所述gstp1可来自不同物种，在具体的实施方式中，所述gstp1包括但不限于gstp1_human、gstp1_mouse、gstp1_rat、gstp1_macmu、gstp1_xenla、gstp1_pig、gstp1_bovin、gstp1_mesau、gstp1_ponab、gstp1_crilo、gstp1_crimi、gstp1_caphi；优选为gstp1_human，其氨基酸序列见seqidno：1所示。
金属硫蛋白(metallothionein,mt)是一类低分子量、高金属含量、富含半胱氨酸，普遍存在于生物界的蛋白质。
进一步，本发明所述金属硫蛋白为mt1、mt2或mt3，优选为mt3。
进一步，所述金属硫蛋白可来自不同物种，在具体的实施方式中，所述mt1包括但不限于mt1a_human、mt1g_human、mt1_mouse、mt1e_human、mt1x_human、mt1f_human、mt1h_human、mt1_rat、mt1a_bovin、mt1b_human、mt1a_pig、mt1a_horse、mt1_danre、mt1_bovin、mt1m_human、mt1_crigr、mt1_canlf、mt1a_rabit、mt1a_sheep、mt1l_human、mt1h_bovin、mt1e_pig、mt1f_pig、mt1b_horse、mt1d_pig、mt1c_pig、mt1_caeel、mt1_canga、mt1_chlae、m1bl1_human、mt1c_sheep、mt1b_sheep、mt1_drome、mt1_tetpi、mt1_colli、apmt1_amoma、mt1_scyse、mt1_cypca、mt1a_orysj、mt1a_orysi、mt1_drosi、mt1c_arath、mt1_tetpy、mt1b_arath、mt1_droan；
所述mt2包括但不限于mt2_human、mt2_mouse、mt2_bovin、mt2_danre、mt2a_pig、mt2_rat、mt2_canlf、mt2_ponab、mt2_crigr、mt2_drome、mt2_sheep、mt2_canga、mt2_macfa、mt2_chlae、mt2_mesau、mt2_crilo、mt2_steco、mt2_caeel、mt2_colli、mt2_calsi、mt2_scyse、mt2_cypca、mt2_yarli；
所述mt3包括但不限于mt3_bosmu、mt3_human、mt3_macfa、mt3_sheep、mt3_horse、mt3_mouse、mt3_rabit、mt3_rat、mt3_bovin、mt3_pig。
进一步，所述金属硫蛋白优选为mt3_human，其氨基酸序列见seqidno：2所示。
进一步，所述连接肽为柔性连接肽或刚性连接肽；优选为柔性连接肽。
进一步，所述连接肽为(ggggs)n，n为1-4的整数；例如n为1、2、3或4。在优选的实施方式中，所述连接肽为ggggs，其氨基酸序列如seqidno：3所示。
进一步，所述蛋白质单体的氨基酸序列如seqidno：4所示。
本发明的第二方面，提供所述蛋白质纳米颗粒用于制备抑制vsv病毒复制和/或抗vsv病毒的产品方面的用途。
进一步，所述产品至少通过以下途径抑制vsv病毒复制和/或抗vsv病毒：
所述蛋白质纳米颗粒提高rig-i、mavs、p-irf3、ifn-β细胞因子中的一种或两种以上的表达和/或分泌；和/或，
所述蛋白质纳米颗粒增强天然免疫反应的强度。
水疱性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus，简称vsv病毒)是一种单链负股rna病毒，它能在牛、马、猪等天然宿主中通过昆虫进行传播，属于实验室最常用的病毒之一，被广泛用于模拟由病毒引起的人类急性细胞性死亡；用于研究病毒基因组复制与转录等行为的定量、计算研究等。通过涉及该病毒的相关研究，为人类更好地面对突发性的新型rna病毒提供了理论指导。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供了由金属离子诱导而自组装形成的蛋白质纳米颗粒gtsp1-mt的新用途，该蛋白质纳米颗粒本身对细胞活力无不良影响，经细胞水平、分子水平实验验证具有显著的抗病毒效果，进一步通过细胞因子检测发现，该蛋白质纳米颗粒在病毒感染的情况下，能够显著提高rig-i、mavs、p-irf3水平，促进ifn-β细胞因子的释放，从而引起了更为有效的天然免疫反应，显著抑制了病毒的复制。
根据本发明的技术方案，该蛋白质纳米颗粒有潜力进一步开发为抗病毒药物，具有良好的应用前景。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：
图1为金属fe2 诱导下gstp1-mt3蛋白表达的电泳图；第1泳道为蛋白质marker，第2泳道为fe2 诱导获得的蛋白质纳米颗粒gstp1-mt3(fe2 )；
图2为gstp1-mt3(fe2 )蛋白质纳米颗粒的粒径分布图；
图3为gstp1-mt3(fe2 )蛋白质纳米颗粒的sem图；
图4为gstp1-mt3(fe2 )蛋白质纳米颗粒的热稳定性测定结果；
图5为不同浓度的gstp1-mt3(fe2 )对raw264.7细胞活力的影响；
图6为经不同处理的raw264.7细胞感染vsv病毒0、6、12小时后的荧光检测结果；其中，(a)为mock处理组、(b)为0.025mg/mlgstp1处理组、(c)为0.025mg/mlgstp1-mt3(fe2 )处理组；
图7为经不同处理的raw264.7细胞感染vsv病毒0、6、12小时后的facs分析结果；
图8为经不同处理的raw264.7细胞感染vsv病毒12小时后细胞因子检测结果；
图9为经不同处理的raw264.7细胞感染vsv病毒12小时后的westernblot检测结果；
图10为经不同处理的pm细胞感染vsv病毒12小时后的荧光检测结果；
图11为经不同处理的pm细胞感染vsv病毒12小时后的facs分析结果；
图12为经不同处理的thp-1细胞感染vsv病毒12小时后的荧光检测结果；
图13为经不同处理的thp-1细胞感染vsv病毒12小时后的westernblot检测结果。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例1蛋白质纳米颗粒gstp1-mt3的氨基酸序列
基于前期实验研究，本实施例构建了蛋白质纳米颗粒gstp1-mt3的氨基酸序列，gstp1-mt3主要由gstp1和mt3两部分组成，其中mt3在氨基酸序列的n端，gstp1在氨基酸序列的c端，mt3和gstp1中间通过ggggs序列偶联。
gstp1氨基酸序列：
mppytvvyfpvrgrcaalrmlladqgqswkeevvtvetwqegslkasclygqlpkfqdgdltlyqsntilrhlgrtlglygkdqqeaalvdmvndgvedlrckyisliytnyeagkddyvkalpgqlkpfetllsqnqggktfivgdqisfadynlldlllihevlapgcldafpllsayvgrlsarpklkaflaspeyvnlpingngkq(seqidno：1)；
mt3氨基酸序列：
mdpetcpcpsggsctcadsckcegckctsckksccsccpaecekcakdcvckggeaaeaeaekcsccq(seqidno：2)；
gstp1和mt3之间的linker：
ggggs(seqidno：3)。
完整的gstp1-mt3氨基酸序列如seqidno：4所示，其分子量为30.566kda，等电点pi为5.14；gstp1-mt3的编码核苷酸序列如seqidno：5所示。
实施例2蛋白质纳米颗粒gstp1-mt3的表达载体构建
为了后续在重组细胞中表达蛋白质纳米颗粒gstp1-mt3，本实施例构建了其原核表达载体，选择pet-28a( )作为原核表达载体，利用其上的酶切位点hindiii、ndei将如seqidno：5所示编码gstp1-mt3的核苷酸序列连接到pet-28a( )中，经酶切、电泳及单克隆测序检测后成功获得重组表达载体pet-28a( )-gstp1-mt3。
实施例3蛋白质纳米颗粒gstp1-mt3的表达与纯化
本实施例采用大肠杆菌作为宿主菌进行重组表达，具体步骤如下：
1、质粒转化
取2μl42ng/μlpet-28a( )-gstp1-mt3质粒，加入到20μlbl21(de3)感受态细胞，在冰上预混15-30min，然后放在42℃水浴锅中加热90s，随后冰上再放置10min。加入800μl的无抗性的lb培养基，在37℃220rpm培养1h，然后在3500rpm离心10min，移去600μl的上清，剩余的200μl混匀后，待用。
2、抗性筛选
将步骤1中剩余的200μl菌液加入到含有卡那霉素的琼脂糖平板中，37℃培养箱中培养2h后，将平板倒置培养过夜。
3、单克隆挑选
从步骤2培养得到的平板上挑选单个克隆，加入到10ml含有卡那霉素的lb培养基中，37℃220rpm培养10h，溶液逐渐变浑浊。
4、蛋白质诱导表达
将步骤3得到的10ml菌液加入到1l含有卡那霉素的lb培养基中，37℃220rpm培养4h后，再分别加入1ml0.1mol/liptg(使iptg在培养基中终浓度为0.1mmol/l)和0.3mmol/l金属离子fe2 ，继续诱导表达过夜，4℃4000rpm离心20min，弃去上清，加入20mlgst重悬液(ph＝8.0、50mmtris/hcl、100mmnacl、60mmβ-mercaptoethanol)进行超声波碎(30％的功率,scientz，jy92-iin)，4℃12000rpm超速离心，收集上清，使用0.22μm的滤膜进行过滤，有待进一步纯化。
5、蛋白纯化
利用akta纯化系统进行纯化，首先使用5倍(5v)柱体积的pbs平衡，然后利用akta将步骤4中上清结合到gst柱子上，继续使用5v柱体积的pbs进行冲洗待基线平稳后，使用gst洗脱液(ph＝8.0、10mmol/lgsh、50mmtris/hcl、100mmnacl、60mmβ-mercaptoethanol)洗脱并收集。收集的蛋白使用10kda超滤管除去蛋白中的gsh，最后使用0.22μm的滤膜过滤。4℃短期保存(如长期-80℃保存，需要保存在10％的甘油中)。
如图1所示，经由fe2 诱导能获得分子量约30kda的蛋白质纳米颗粒gstp1-mt3(fe2 )。蛋白质纳米颗粒gstp1-mt3(fe2 )的粒径分布图如图2所示，gstp1-mt3(fe2 )蛋白质纳米颗粒的sem图如图3所示。由图2和图3可知，gstp1-mt3经由fe2 诱导后形成了大小分布均匀的纳米颗粒。将本实施例制备得到的gstp1-mt3(fe2 )用于以下实施例中。
实施例4gstp1-mt3(fe2 )蛋白质纳米颗粒的热稳定性
(1)用pbs将gstp1-mt3(fe2 )纳米颗粒配制成15mm的储液，使其吸光度a280＝0.702；
(2)将5ml200x染料orange与步骤(1)中的45ml样品储液混匀；
(3)将步骤(2)制备得到的混合液加入到不透明的8连排pcr管内，并将其置于lightcycler96仪器中，检测器熔点温度(tm值)。所使用的程序为37℃至98℃，每分钟上升2.2℃，每个样品三个生物平行。
gstp1-mt3(fe2 )蛋白质纳米颗粒的热稳定性测定结果见图4所示。
实施例5gstp1-mt3(fe2 )对raw264.7细胞活力的影响
(1)取2块孔板分别加入raw264.7细胞(105个细胞/孔)，37℃、5％co2培养过夜；
(2)分别用高糖dmem(含双抗和10％fbs)配制0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/mlgstp1-mt3(fe2 )，待用；
(3)用移液枪移除细胞上清，分别加入上述不同浓度的gstp1-mt3(fe2 )，37℃、5％co2培养24小时(每组浓度含有4个生物平行)；
(4)使用高糖dmem培养基，向其中加入mtt，使其终浓度为0.5mg/ml,待用；
(5)将步骤(3)中的上清移去，向其中缓慢加入步骤(4)中的mtt培养液，37℃、5％co2继续培养4小时；
(6)缓慢移除细胞上清，分别向各孔中加入1mldmso，37℃培养30分钟；
(7)室温冷却10分钟，随后转移至96孔板中(每个样品6个技术平行)；
(8)od450测定吸光度，计算细胞活力，结果如图5所示，根据图5可知，gstp1-mt3(fe2 )对raw264.7的细胞活力无不良影响。
实施例6gstp1-mt3(fe2 )在raw264.7细胞内的抗vsv病毒效果
(1)向6孔板中加入raw264.7细胞(106个细胞/孔)，37℃、5％co2培养过夜；
(2)准备3支干净的50ml离心管，分别标上mock、0.025mg/mlgstp1、0.025mg/mlgstp1-mt3(fe2 )；
备注：gstp1和gstp1-mt3(fe2 )均已除内毒素(lps<0.5eu/ml)，以下实施例同；
向标记mock的离心管加入10mldmem，向标记0.025mg/mlgstp1的离心管加入9.868mldmem、132μl1.9mg/mlgstp1，向标记0.025mg/mlgstp1-mt3(fe2 )的离心管加入9.900mldmem、100μl2.48mg/mlgstp1-mt3(fe2 )；将上述离心管中的液体混合均匀，待用；
(3)将步骤(1)中的细胞取出，移去培养基，每次向其中加入500μldpbs清洗细胞，一共清洗三次；
备注：6孔板不宜一次性将6孔中的培养基全部移去，需要用枪头移去2个孔(一个6孔板中的2个孔)的培养基后，立即移取1mldpbs平均加入到2个孔。
(4)向6孔板中分别加入2ml含有不同药物浓度的培养基(mock、0.025mg/mlgstp1、0.025mg/mlgstp1-mt3(fe2 ))，37℃、5％co2培养6小时；
(5)加入等量的vsv-(gfp)病毒(该vsv病毒可表达gfp绿色荧光蛋白，其结构、功能、性质与天然vsv病毒无异，来自北京大学医学部陈英玉实验室)后，分别在0小时、6小时和12小时观察荧光的变化，同时做facs分析；荧光检测结果见图6所示，facs分析结果见图7所示，由图6-7可知，gstp1-mt3(fe2 )有效抑制了vsv病毒的增殖，具有显著的抗vsv病毒效果。
实施例7检测vsv病毒感染raw264.7细胞过程中细胞因子的变化
(1)向6孔板中加入raw264.7细胞(106个细胞/孔)，37℃、5％co2培养过夜；
(2)将步骤(1)中的细胞取出，移去培养基，每次向其中加入500μldpbs清洗细胞，一共清洗三次；
(3)将步骤(2)处理后的细胞分为a、b、c、d四个组，向a组、b组加入2mldmem培养基，向c组、d组加入2ml含0.025mg/mlgstp1-mt3(fe2 )的dmem培养基；37℃、5％co2培养6小时；
(4)向b组、d组加入等量的vsv-(gfp)病毒，继续培养各组细胞12小时，检测细胞因子ifn-β的含量，检测细胞因子所用的试剂盒为humananti-virusresponse(biolegend740349)，每组做3个独立重复。
细胞因子ifn-β的检测结果如图8所示，由图8可知，加入gstp1-mt3(fe2 )后，显著提高了vsv病毒感染raw264.7细胞过程中细胞因子ifn-β的表达。这至少从一个角度揭示了gstp1-mt3(fe2 )抑制病毒复制的机理：图8的结果表明通过加入gstp1-mt3(fe2 )，并且在感染病毒的情况下，引起了更为有效的天然免疫反应，从而显著抑制了病毒复制。
实施例8蛋白水平上验证gstp1-mt3(fe2 )在raw264.7细胞中的抗vsv病毒效果
(1)向6孔板中加入raw264.7细胞(106个细胞/孔)，37℃、5％co2培养过夜；
(2)移去细胞上清，分别向各孔中加入2mldmem培养基、含0.025mg/mlgstp1的dmem培养基、含0.025mg/mlgstp1-mt3(fe2 )的dmem培养基；37℃、5％co2培养6小时；
(3)向6孔板中分别加入等量的vsv-gfp病毒后，37℃、5％co2继续培养12小时；
(4)移去培养基，将6孔板倒扣在吸水纸上，使吸水纸吸干培养液；
(5)向培养皿中分别加入200μl含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的中性ripa裂解液，于冰上放置10分钟；
(6)用细胞刮轻轻刮下细胞，并吸出液体至1.5ml离心管中；超声处理10秒，超声结束后立即放置于冰上；4℃、12000rpm离心20分钟；
(7)将离心后的上清转移倒1.5ml离心管中；
(8)使用bca进行蛋白定量；
(9)上样(每孔加入10μg样品)、电泳跑胶(80v,30分钟；120v90分钟)；
(10)转膜(70v,70分钟)、5％脱脂牛奶封闭1小时；
(11)免疫反应
a)从封闭液中取出膜，1×tbst5min3次；
b)将膜蛋白面朝上放于槽中，加入一抗，4℃过夜，次日用1×tbst在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min；
c)同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育90分钟后，用1×
tbst在室温下脱色摇床上洗三次，每次5分钟；
(12)化学发光，显影，定影
a)将a和b两种试剂等量(各350μl)在1.5ml离心管中等体积混合；
b)将1×显影液均匀铺在pvdf膜上，成像系统中成像，成像结果见图9所示。
实施例9gstp1-mt3(fe2 )在腹腔巨噬细胞内的抗vsv病毒效果
(1)将c57小鼠腹腔中的巨噬细胞(pm)转移到6孔板中，37℃、5％co2培养过夜；
(2)次日，移去细胞上清，用pbs清洗细胞3次；
(3)向各孔中分别加入2ml含有0mg/ml、0mg/ml、0.025mg/mlgstp1、0.025mg/mlgstp1-mt3(fe2 )的高糖dmem培养基，并依次标记为a、b、c以及d组；
(4)37℃、5％co2培养6小时；
(5)分别向b、c以及d组加入等量的vsv-gfp病毒后，37℃、5％co2继续培养12小时；
(6)荧光显微镜下观察gfp荧光；荧光检测结果见图10所示；
(7)用pbs清洗细胞，随后用pbs将细胞吹落，进行facs测定分析；facs分析结果见图11所示。
实施例10gstp1-mt3(fe2 )在单核巨噬细胞内的抗vsv病毒效果
(1)将单核巨噬细胞(thp-1)置于含12％fbs的1640培养基中；
(2)向其中加入30ng/ml的pma，37℃、5％co2培养48小时，诱导thp-1细胞贴壁；
(3)移去细胞上清，用pbs清洗细胞3次；
(4)向各孔中分别加入2ml含有0mg/ml、0mg/ml、0.025mg/mlgstp1、0.025mg/mlgstp1-mt3(fe2 )的12％fbs的1640培养基，并依次标记为a、b、c以及d组；
(5)37℃、5％co2培养6小时；
(6)分别向b、c以及d组加入等量的vsv-gfp病毒后，37℃、5％co2继续培养12小时；
(7)荧光显微镜下观察gfp荧光，荧光检测结果见图12所示。
实施例11蛋白水平上验证gstp1-mt3(fe2 )在单核巨噬细胞中的抗vsv病毒效果
收集实施例9步骤(6)培养得到的b、c、d组细胞培养物，按照实施例7步骤(4)-(12)的方法，对其进行westernblot检测分析，检测结果见图13所示。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110>北京大学
<120>一种蛋白质纳米颗粒用于制备抗vsv病毒产品的用途
<160>5
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>210
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tgtctgtatggccagctgcccaaattccaagacggggatctgaccctgtaccagagcaac420
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1.一种蛋白质纳米颗粒在制备抑制vsv病毒复制和/或抗vsv病毒的产品方面的用途；
所述蛋白质纳米颗粒由蛋白质单体经金属离子诱导而自组装形成，所述蛋白质单体包括由金属硫蛋白、连接肽、谷胱甘肽硫转移酶以从氨基端到羧基端的顺序依次连接组成的融合蛋白。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述金属离子选自下组：fe2 、mn2 、zn2 、cu2 、cr3 ，优选为fe2 。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述谷胱甘肽硫转移酶为gstp1；
优选地，所述谷胱甘肽硫转移酶的氨基酸序列如seqidno：1所示。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述金属硫蛋白为mt1、mt2或mt3。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述金属硫蛋白为mt3；
优选地，所述金属硫蛋白的氨基酸序列如seqidno：2所示。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述连接肽为柔性连接肽或刚性连接肽；优选为柔性连接肽。
7.如权利要求6所述的通途，其特征在于，所述连接肽为(ggggs)n，n为1-4的整数；
优选地，所述连接肽的氨基酸序列如seqidno：3所示。
8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述蛋白质单体的氨基酸序列如seqidno：4所示。
9.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述产品至少通过以下途径抑制病毒复制和/或抗病毒：
所述蛋白质纳米颗粒提高rig-i、mavs、p-irf3、ifn-β细胞因子中的一种或两种以上的表达和/或分泌；和/或，
所述蛋白质纳米颗粒增强天然免疫反应的强度。
技术总结