本发明属于制药领域，涉及一类细胞内质网靶向纳米载药系统的构建，及其在抗肿瘤、抗代谢紊乱、抗病毒和抗炎症等领域的应用。
背景技术：
药物作用靶点涉及受体、酶、离子通道、转运体、免疫系统和基因等，而药物发挥药效需要到达作用靶点。现代给药系统要求药物能被转运至靶组织、靶细胞，甚至是特定的细胞器。目前组织及细胞靶向给药递送系统的研究已经较为成熟，三级靶向，即细胞器靶向则是目前给药系统中研究的热点和难点。三级靶向包括细胞质靶向和细胞器靶向，细胞器靶向包括线粒体靶向、内质网靶向、溶酶体靶向和细胞核靶向等。利用纳米材料作为药物载体可以提高药物的吸收利用率、实现药物的高效精准递送、延长药物的半衰期并减少药物对正常组织的毒副作用。纳米药物载体的开发包括聚合物纳米粒、胶束、脂质体、树枝状大分子、纳米乳和固体脂质纳米粒等。因此，利用纳米载体实现细胞器靶向，将药物递送到特定作用靶点则是更为高级高效的给药方式。
内质网(endoplasmicreticulum，er)是细胞内最大的微结构之一，是由细胞骨架支撑的呈线状细管和微型扁囊连接的网状膜结构。它的内层与核膜相连，由磷脂双分子层形成一个独立于细胞质基质的封闭的空间，内质网联系了细胞核、细胞质和细胞膜这三大细胞结构，是细胞内蛋白质合成、脂质合成、物质运输和糖类代谢的主要场所。其主要功能是合成蛋白质和脂类及参与细胞骨架形成和胞内物质的传送，同时内质网控制着整个细胞内膜系统的容量和范围。另外，内质网中含有多种酶，如参与糖原异代谢过程的葡萄糖-6-磷酸酶和参与各种药物代谢及解毒过程的水解酶等。肝脏、肠道细胞内质网上的细胞色素p450是人体内药物代谢的主要酶，能催化多种内源性和外源性物质的代谢，包括大多数临床药物。大量研究表明遗传或环境损伤引起的内质网功能紊乱可导致内质网应激，激活未折叠蛋白反应(upr)和内质网相关降解(erad)。在严重内质网应激或upr受损的情况下，细胞可能无法维持内质网内稳态，最终发生细胞凋亡，这与许多人类疾病的发病机制相关，如阿尔茨海默症、纤维囊泡症和糖尿病等，据此，内质网可作为多种疾病治疗的新靶点，那么内质网靶向递送就意义非凡。根据其可诱导细胞凋亡通路的特点，递送一些细胞毒性药物诱发内质网应激加速癌细胞的凋亡，可以作为治疗癌症的手段。同时也可以递送一些药物或者细胞因子来阻断疾病诱导的异常的内质网应激反应，减少甚至逆转细胞的凋亡，从而阻止一些疾病的发生。而当递送需经内质网上酶加工处理的前药时，可以降低药物使用剂量和系统毒性。
目前对于内质网的靶向给药的研究并未受到足够的重视，对其研究的相关文献相对较少。2002年costin等用ph敏感脂质体(由dope和胆甾醇半琥珀酸酯组成)递送内质网n-糖基化酶抑制剂(n-丁基脱氧野尻霉素)，成功抑制了小鼠黑色素瘤细胞酪氨酸活性，并明显降低了给药剂量，这主要基于脂质与内质网膜相似性而实现的靶向效果[bbrc293(2002):918–923]。
2019年，shieh等人发明了一种负载姜黄素的内质网靶向的plga纳米颗粒，具体实现方法是在聚合物表面缀合kdel内质网驻留信号肽，该多肽能够与位于内质网上的滞留信号受体kdel受体结合。靶向组产生的ros明显高于非靶向组和游离组，糖基化h338y-gp91phox蛋白的表达从1.3倍增至1.7倍，免疫染色和共定位结果显示靶向载体可在4min内显著定位至嗜中性粒细胞的内质网上，且不会引起线粒体受损等细胞毒性[au2019200903[p]]。
2019年，chongqiu等人使用从癌细胞中提取的内质网膜作为脂质材料制备仿生纳米载体，用于递送sirna，靶向制剂组在体外研究中获得明显更高的沉默效果，在治疗荷mcf-7人源性乳腺癌肿瘤的裸鼠时，靶向组也表现出更优的肿瘤抑制效果[natcommun.10,2702(2019).]。
罗利华等人构建了一种含有33个氨基酸残基名为pardaxin多肽修饰的纳米脂质体。在低剂量时，pardaxin入胞后可避开线粒体、高尔基体及溶酶体，定向至内质网，在递送以内质网为靶点的抗肿瘤药时，表现出显著的肿瘤抑制效果。[cn109432432a]。
由以上介绍可知，目前针对内质网靶向性载体的设计，涉及基于脂质相似相溶性、多肽修饰和仿生学原理等以获得相应内质网靶向药物递送系统。这些载体在一定程度上均表现出较好的内质网定位性，且在进行药物递送研究时，相较于非靶向组，获得了更优的效果。但是，这些载体仍然面临载体靶向性差、不易储存、成本高、潜在免疫原性和原料获取不够便利等约束，不利于放大生产。所以，探究新的更优的具有工业化生产潜力的内质网靶向药物载体就显得十分必要。
目前基于磺酰胺基及磺酰脲基化合物内质网靶向的研究主要集中在小分子荧光探针方面。与内质网特异性分子结合的荧光探针包括单纯的内质网定位荧光探针如市面上常见的er-tracker系列，包括er-trackerred、er-trackergreen以及er-trackerblue-whitedpx等，这些探针中氟硼吡咯(bodipy)等荧光团与格列本脲相连，格列本脲可以与内质网上广泛存在的钾离子通道中的磺脲受体结合，从而实现定位。2019年，watkinson等以环己基磺酰脲为内质网靶向基团设计了探针，在生理ph下表现出与zn2 浓度正相关的荧光转换能力，且与er-tracker高度共定位。磺酰胺类基团可与er中的磺酰胺受体特异性结合，也赋予了其优良的内质网定位作用，许多研究人员在此基础上设计了不同功能的内质网荧光探针，已见报道的有检测硫化氢[organic&biomolecularchemistry,2019,17(6):1436-1441.]、羧酸酯酶[anal.chem.2019,91,24,15840–15845]、氧自由基[亚细胞结构ros与极性的荧光成像研究_肖海滨]、次氯酸[journalofphotochemistryandphotobiologya:chemistry,volume384,2019,111980,issn1010-6030]；内质网微环境如ph[analyticalmethods,2018,10(47):5702-5706.]、温度[scientificreports,2014,4(1):6701.]、极性[newjournalofchemistry,2019,43(30):12103-12108.]等。由以上简介可知，目前以磺酰胺基和磺酰脲基为基础的内质网靶向荧光探针的研究已经较为成熟，但是仅仅局限于自身分子的内质网定位，这些设计还无法实现载体功能，无法将不具有内质网定位能力的活性分子(靶点在内质网部位)定向递送至内质网。本发明专利从内质网靶向药物载体设计入手，构建含磺酰胺基和磺酰脲基的化合物，并将这些化合物修饰到具有载药能力的纳米载体中，得到一类新型细胞内质网靶向纳米载药系统。这类载体具有优良的药物分子内质网靶向递送能力、制备方便、成本低廉、性质稳定、且具有良好的工业应用前景。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一类细胞内质网靶向纳米载药系统的构建方法，具体来讲，本发明内容分为两部分：
1、本发明的第一部分内容是通过化学合成和纯化过程获得内质网靶向修饰化合物，是一种具有内质网靶向性、可以修饰纳米载体的磺酰胺和磺酰脲类化合物。所述内质网靶向修饰化合物的结构特征见通式1，如下所示：
式1中：r1为c6-c18的烷基、甲苯基、c6-c18烷基苯；
r2为酰胺基、氢基、c6-c18烷基、peg化磷脂；
r3为酰胺基、氢基、c6-c18烷基、peg化磷脂。
制备方法可以归纳为：将磺酰氯类化合物与氨水、或胺类化合物(c6-c18烷胺、氨基封端磷脂化合物)或尿素以0.1-2：1的摩尔比在有机溶剂(可以是二氯甲烷、甲醇、三氯甲烷等，根据具体情况进行选择)中先在冰浴搅拌条件下反应0.5-1h后，转室温反应2-12h后经萃取(萃取溶剂可以是饱和食盐水、三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯)收集产物，通过硅胶色谱柱层析法或是萃取法纯化获得内质网靶向修饰化合物纯净产物。
具体通过以下几个方案分别获得：
方法(1)当r1为甲基苯、r2为h和r3为c6-c18烷基时，合成方法：将磺酰氯类化合物溶于适量二氯甲烷(dcm)，在冰浴搅拌下缓慢滴加到c6-c18烷胺的dcm溶液中，磺酰氯类化合物与c6-c18烷胺的摩尔比为1.2-1.5:1，以三乙胺作为缚酸剂，冰浴反应1h，转室温反应4-10h，反应结束后，用2m稀盐酸中和残余三乙酸，饱和食盐水萃取后收集有机相，真空减压蒸发去除有机溶剂，得粗产物。再经硅胶色谱柱进行纯化并收集目标产物即获得内质网靶向修饰化合物。
方法(2)当r1是c6-c18烷基苯、r2为h和r3为h时，合成方法：称量磺酰氯类化合物溶于氯仿并加到25ml三颈烧瓶中，在冰浴条件下加入浓氨水，磺酰氯类化合物与氨水摩尔比为1：3-10，磁力搅拌30min，转为室温再反应2-6h。反应结束后，使用三氯甲烷萃取并收集有机相，减压蒸发除去有机溶剂，得粗产品。再经硅胶色谱柱进行纯化并收集目标产物即获得内质网靶向修饰化合物。
方法(3)当r1是c6-c18烷基、r2为h和r3为h时，合成方法：首先量取氨水加到三颈烧瓶中，再加入适量甲醇，称取磺酰氯类化合物并溶于适量甲醇，在冰浴搅拌条件下缓慢滴加加入，反应30min，转为室温反应过夜。反应结束后，使用饱和食盐水和乙酸乙酯萃取，收集有机相，减压蒸发除去有机溶剂，得白色结晶产物即获得内质网靶向修饰化合物。
方法(4)当r1是甲基苯、r2为peg化磷脂和r3为h时，合成方法：称取含氨基的peg化磷脂化合物并溶于适量二氯甲烷(dcm)，再将磺酰氯类化合物溶于dcm，并在冰浴搅拌下缓慢滴加到含氨基的peg化磷脂化合物dcm溶液中，磺酰氯类化合物与含氨基的peg化磷脂化合物的摩尔比为1.2-2:1，以三乙胺作为缚酸剂，冰浴反应30min，再转室温磁力搅拌反应过夜，tlc检测反应过程。反应结束时，先使用2m盐酸溶液中和体系中残余的三乙胺，之后用饱和食盐水萃取，收集有机相，减压蒸发除去溶剂，即获得粗产物，再经硅胶柱层析纯化即得最终纯化产物即获得内质网靶向修饰化合物。
方法(5)当r1是c6-c18烷基苯、r2为酰胺基和r3为h时，合成方法：称取尿素加到50ml三颈烧瓶中，并加入少量水溶解，冰浴，称取c6-c18烷基苯磺酰氯类化合物，溶于甲醇并逐滴加入到体系中，再补加适量甲醇，室温下磁力搅拌；6h后，升温至50℃，加热搅拌6-12h，tlc检测反应过程。反应结束后，用饱和食盐水和乙酸乙酯萃取，收集有机相，减压蒸发除去有机溶剂，得粗产物。再经硅胶色谱柱层析方式分离纯化产物即获得内质网靶向修饰化合物。
分别采用核磁共振(nuclearmagneticresonance，nmr)和红外光谱吸收法(ftir)对合成化合物进行结构确证。这些化合物可作为制备脂质体或是其他纳米载体的原料，其长链烷基端为疏水端，可作为“锚”，锚定在脂质类载体如脂质体的双分子层膜上；磺酰胺基和磺酰脲基端为弱亲水端暴露在外，作为靶向内质网的“靶头”，实现对载体的修饰；或通过相似相溶作用与纳米粒脂质材料发生组装完成修饰；或通过电荷吸附、氢键作用等相互作用实现该化合物在纳米粒子表面的修饰，赋予这些纳米载体内质网靶向的功能。
2、本发明的第二部分内容是构建磺酰胺或磺酰脲化合物修饰的具有内质网靶向功能的载药纳米系统或空白纳米载体
将脂质材料(可以是氢化大豆卵磷脂、单硬脂酸甘油酯、中链脂肪酸甘油脂、大豆油、蛋磷脂、胆固醇、(2，3-二油酰基-丙基)三甲基氯化铵、二油酰磷脂酰乙醇胺、n-二硬脂酰磷脂酰乙酰胺peg等)和内质网靶向修饰化合物(通式1所代表化合物)，按照一定摩尔比例混合(内质网靶向修饰化合物占载体总质量的0.03％-50％)，溶解在有机溶剂(三氯甲烷、乙醇、甲醇、二氯甲烷、乙醚或其中的两种或两种以上有机溶剂的混合物)中，在45-60℃旋转蒸发形成薄膜(当需要包载脂溶性药物如醋酸地塞米松时，药物与脂质材料一同溶解于有机溶剂中)，再加水性介质(ph5.4-ph7.4的pbs溶液、去离子水、或包含水溶性药物如环磷酰胺、盐酸阿霉素、脱氧野尻霉素、蛋白质和多肽等的ph5.4-7.4的pbs水溶液)水化形成多室脂质体；或使脂溶性药物和脂质材料在有机相中(三氯甲烷、乙醇、甲醇、二氯甲烷、乙醚或其中的两种或两种以上有机溶剂的混合物)混合，直接分散至水相(ph5.4-ph7.4的pbs溶液、去离子水、或包含水溶性药物如环磷酰胺、盐酸阿霉素、脱氧野尻霉素、蛋白质、多肽和核酸等的ph5.4-7.4的pbs水溶液)中，经旋转蒸发除去有机相，再经一定功率探头超声或水浴超声后即形成目标纳米载药系统。
所载药物可以为脂溶性或水溶性抗肿瘤药物、抗炎药物、代谢调控药物、需要在内质网上进一步活化的前体药物及内质网相关疾病的治疗药物、亦或是需要通过非溶酶体途径递送的核酸类药物。水溶性抗肿瘤药物包括蛋白、多肽、核酸药物，
本发明所构建的具有内质网靶向性的纳米载药系统或载体不仅仅局限于纳米脂质体，还包括固体脂质纳米粒、纳米乳、聚合物胶束等。具体实例有：n-十二烷基-4-甲基苯磺酰胺修饰的内质网靶向脂质体、对十二烷基苯磺酰胺修饰内质网靶向脂质体、十二烷基磺酰胺修饰内质网靶向脂质体、dspe-peg-nh-so2-c6h6-ch3修饰的内质网靶向脂质体、十二烷磺酰脲修饰的内质网靶向脂质体、对十二烷基苯磺酰脲修饰的内质网靶向脂质体、对十二烷基苯磺酰胺修饰的内质网靶向环磷酰胺脂质体、对十二烷基苯磺酰修饰的内质网靶向环磷酰胺脂质纳米粒、对十二烷基苯磺酰胺修饰的内质网靶向环磷酰胺纳米乳、n-十二烷基-4-甲基苯磺酰胺修饰的内质网靶向脱氧野尻霉素脂质体、dspe-peg-nh-so2-c6h6-ch3修饰的内质网靶向阿霉素脂质体、dspe-peg-nh-so2-c6h6-ch3修饰的内质网靶向醋酸地塞米松胶束，这些载体的制备方法及处方组成在具体实施方式中均有详细介绍。
本发明的另一个目的是提供所述方法构建的纳米载药系统在药物递送中的应用。
本发明的创新性在于利用磺酰胺及磺酰脲化合物所具有的特异性内质网趋向特性，将其修饰在纳米载体中而使得纳米载体具有内质网靶向性，该纳米载体经细胞内吞后，能够避开溶酶体途径而特异性集中到内质网区域，进而将药物递送到内质网部位靶点发挥效力。本发明所构建的内质网靶向纳米载体可以装载水溶性和脂溶性药物，并快速将药物传递到内质网部位，提高药物在其作用部位的积累，增强药物治疗功效，减少毒副作用，为这些药物疗效的发挥提供了一项新的方案；另外，本发明所构建的新型内质网靶向脂质体，可以显著提高需要溶酶体逃逸的核酸药物的递送，为这类药物的疗效发挥提供了一种新的策略，本发明所述纳米载体不仅仅局限于脂质体，也可以是固体脂质纳米粒，纳米乳和聚合物胶束等。本发明提供的内质网靶向修饰纳米载体，制备方法设计方案新颖，制备方法简单，且具有良好工业生产及应用前景。
附图说明
图1是n-十二烷基-4-甲基苯磺酰胺红外吸收光谱谱图。
图2是合成化合物n-十二烷基-4-甲基苯磺酰胺对skov3和mcf7s细胞系的细胞毒性实验，在检测浓度范围内，安全无毒。
图3是对十二烷基苯磺酰胺红外吸收光谱谱图。
图4是合成化合物对十二烷基苯磺酰胺对dc2.4细胞系的细胞毒性实验，在检测浓度范围内，安全无毒。
图5是十二烷基磺酰胺红外吸收光谱谱图。
图6是dspe-peg-nh-so2-c6h6-ch3核磁共振氢谱谱图。
图7是dspe-peg-nh-so2-c6h6-ch3红外吸收光谱谱图。
图8是薄膜分散法制备时n-十二烷基-4-甲基苯磺酰胺的不同质量比对细胞摄取的影响，靶头加入量不影响细胞摄取。
图9是薄膜分散法制备时对十二烷基苯磺酰胺的不同质量比对细胞摄取的影响，可促进细胞摄取。图a为did-lipo摄取图；图b为对应视野的细胞核。
图10是薄膜分散法制备时对十二烷基苯磺酰脲的不同质量比对细胞摄取的影响，可促进细胞摄取。
图11是n-十二烷基-4-甲基苯磺酰胺修饰的内质网靶向脂质体内质网共定位共聚焦图，表现出较好的内质网共定位效果。
图12是对十二烷基苯磺酰胺修饰的内质网靶向脂质体内质网共定位共聚焦图，表现出优异的内质网共定位效果。
图13是对十二烷基苯磺酰脲化合物修饰脂质体细胞摄取2h内质网共定位图。表现出较好的内质网共定位效果。
图14是十二烷基磺酰胺修饰脂质体细胞6h摄取图，由图可以看出非靶向组摄取相对分散无章，而靶向组摄取图呈现出更好的内质网轮廓，表现出较好的内质网共定位效果。
图15是dspe-peg-nh-so2-c6h6-ch3修饰脂质体细胞6h摄取图，靶向组摄取图呈现出更好的内质网轮廓，表现出较好的内质网共定位效果。
图16是n-十二烷基-4-甲基苯磺酰胺修饰的内质网靶向脂质体所递送编码绿色荧光蛋白egfp的mrna分子在原代细胞骨髓来源树突状细胞中的转染效率。当修饰化合物占载体质量比为3％时，表现出最好的转染效果。
具体实施方式
本发明结合附图和实施实例作进一步说明。
实施例1
n-十二烷基-4-甲基苯磺酰胺修饰物的合成：称取十二烷胺溶于适量二氯甲烷(dcm)，加入三乙胺作为缚酸剂，称取并将对甲苯磺酰氯溶于适量dcm，在冰浴搅拌下缓慢滴加入到反应体系中，对甲苯磺酰氯与十二烷胺的摩尔比为1.2-1.5:1。冰浴反应1h，转室温反应4-10h，期间通过薄层色谱法(tlc)检测反应进度，体系呈澄清透明。反应结束后，用2m稀盐酸中和残余三乙酸，ph试纸检测调整ph至中性，饱和食盐水萃取后收集有机相，真空减压蒸发去除有机溶剂，得粗产物。之后通过硅胶色谱柱进行纯化，洗脱液体系为：石油醚：乙酸乙酯＝8：1，收集目标产物，减压蒸发除去有机溶剂，获得纯化的目标产物，为黄白色片状固体，称重，计算产率为62.24％。室温或4℃保存。
n-十二烷基-4-甲基苯磺酰胺合成反应方程式：
n-十二烷基-4-甲基苯磺酰胺结构确证：(1)采用核磁共振(nuclearmagneticresonance，nmr)，对n-十二烷基-4-甲基苯磺酰胺进行1h-nmr结构确证，1hnmr(500mhz，cdcl3)δ7.77–7.73(m,2h)，7.31(d,j＝7.9hz,2h)，4.36(s,1h)，2.93(t,j＝7.1hz,2h)，2.43(s,3h)，1.43(dd,j＝14.4,7.3hz,2h)，1.25(dd,j＝21.0,17.1hz,20h)，0.87(d,j＝7.1hz,3h)。在化学位移4.36ppm处，出现了一个宽的单峰信号峰，该峰归属于为磺酰胺键上的氢的特征峰；在化学位移2.93ppm处，出现了一个明显的三峰信号，该峰归属于磺酰胺键相邻的次甲基信号峰；在化学位移2.43ppm处，出现了一个明显的单峰信号，该峰归属于苯环上的甲基氢；在0.87ppm处出现的三重峰，应为烷基链末尾的甲基氢。(2)采用红外光谱吸收法(ftir)测定化合物结构。根据图谱可知(图1)：在3278.78cm-1处有一个吸收峰，表明该化合物中含有活泼氢，考虑到化合物本身结构，再结合核磁氢谱分析得知此处应为磺酰胺键上的n-h伸缩振动，且该处为单峰，佐证成功合成磺酰胺基团，且为单取代。在1328.59cm-1处的峰，可归为s＝o在指纹区的伸缩振动峰。综上，成功合成目标产物n-十二烷基-4-甲基苯磺酰胺。
细胞毒性实验：将人源性卵巢癌skov-3，人乳腺癌细胞mcf-7细胞按5×104个/ml，100μl/孔的量接种在96孔板上。待24h细胞贴壁后，把合成化合物n-十二烷基-4-甲基苯磺酰胺溶于dmso，浓度为1mg/ml，按照载体的系列浓度(通过细胞培养液稀释获得0.1μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml)加入到肿瘤细胞中，总体积为100μl。孵育24h。再每孔加入10μl的mtt水溶液(5mg/ml)，继续孵育2-4h后，弃去培养液，每孔加入200μl的dmso，摇床上振荡10-20min后，酶标仪在490nm处测定吸光值。结果见图2，表明n-十二烷基-4-甲基苯磺酰胺靶头无明显毒性，可以作为载体修饰物安全使用，该现象在两种细胞系中趋势相当，且mcf-7细胞系活力更好。
实施例2
对十二烷基苯磺酰胺修饰物的合成：称量对十二烷基苯磺酰氯溶于氯仿并加到25ml三颈烧瓶中，在冰浴条件下加入浓氨水，磁力搅拌30min，转为室温再反应2-6h，tlc检测反应过程。对十二烷基苯磺酰氯与氨水摩尔比为1：3-10反应结束后，使用三氯甲烷萃取并收集有机相，无水硫酸钠干燥后过滤，收集有机相，减压蒸发除去有机溶剂，得粗产品。之后通过硅胶色谱柱进行纯化，洗脱液体系为：庚烷：乙酸乙酯＝4：1(体积比)，收集目标产物，减压蒸发除去有机溶剂，获得纯化的目标产物，为淡黄色粘稠液体，称重，计算产率。室温或4℃保存。
对十二烷基苯磺酰胺合成反应方程式：
对十二烷苯磺酰胺结构确证：(1)采用核磁共振，对对十二烷苯磺酰胺进行1hnmr结构确证：1hnmr(500mhz,cdcl3)，δ7.83(dd,j＝8.4,2.2hz,2h)，7.29-7.20(m,2h)，5.02(s,2h)，2.62-2.40(m,1h)，1.70-1.47(m,4h)，1.30-0.99(m,15h)，0.89-0.72(m,6h)。对十二烷苯磺酰胺核磁共振氢谱图中，在化学位移5.02ppm处，出现了单个宽峰信号峰，该峰归属于为磺酰胺键的特征峰；在化学位移7.83ppm和7.29-7.20ppm处，各出现了一个明显的双峰信号，该峰归属于苯环非取代氢；在化学位移1.70-0.72ppm处的峰对应烷基链上的氢。(2)红外光谱扫描结果(图3)显示：在3300cm-1附近处有两个吸收峰，表明该化合物中至少含有两个活泼氢，考虑到化合物本身结构，再结合核磁氢谱分析得知此处应为磺酰胺键上的n-h伸缩振动，且该处为伯胺。且在1300cm-1附近出现一个锐利的峰，该峰可能为指纹区s＝o键的伸缩运动，佐证成功合成目标化合物。
细胞毒性研究：将dc2.4细胞按5×104个/ml，100μl/孔的量接种在96孔板上。待24h细胞贴壁后，把合成化合物对十二烷基苯磺酰胺溶于dmso，浓度为1mg/ml，按照载体的系列浓度(通过细胞培养液稀释获得0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml)加入到肿瘤细胞中，总体积为100μl。分别孵育48h和72h，再每孔加入10μl的mtt水溶液(5mg/ml)，继续孵育2-4h后，弃去培养液，每孔加入200μl的dmso，摇床上振荡10-20min后，酶标仪在490nm处测定吸光值。结果见图4，表明对十二烷基苯磺酰胺靶头无毒性，可以作为载体修饰物安全使用。
实施例3
十二烷磺酰胺修饰物的合成:首先量取氨水加到三颈烧瓶中，再加入适量甲醇，称取十二烷磺酰氯并溶于适量甲醇，在冰浴搅拌条件下缓慢滴加加入，反应30min，转为室温反应过夜。反应结束后，使用饱和食盐水和乙酸乙酯萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥后过滤，再收集有机相，减压蒸发除去有机溶剂，得白色结晶产物。称重，计算产率。室温或4℃保存。
十二烷基磺酰胺合成反应方程式：
十二烷磺酰胺结构确证：(1)采用核磁共振对十二烷磺酰胺进行1hnmr结构确证：1hnmr(500mhz,cdcl3)δ4.49(s,2h)，3.14-3.09(m,2h)，1.90-1.82(m,2h)，1.59(s,6h)，1.43(dd,j＝15.0,7.4hz,2h)，1.36-1.21(m,16h)，0.90-0.79(m,3h)。十二烷磺酰胺核磁共振氢谱图中，在化学位移4.49ppm处，出现了一个宽信号峰，该峰归属于为磺酰胺键上的氢的特征峰；在化学位移3.14-3.09ppm处，出现了一个明显的三重峰信号，该峰归属于磺酰胺键相邻的次甲基信号峰；在化学位移1.59ppm处，该峰为明显的单峰，考虑为杂质峰；在化学位移0.90-0.79ppm处，出现明显的三重峰，考虑为末端甲基峰。(2)红外光谱扫描(图5)结果显示：在3359cm-1和3251cm-1处有两个吸收峰，对应为磺酰胺上的两个n-h伸缩振动峰，1381.75cm-1处的峰为s＝o的伸缩振动吸收峰。综上可证明合成化合物即为目标产物。
实施例4
dspe-peg-nh-so2-c6h6-ch3修饰物的合成：通过dspe-peg-nh2和对甲苯磺酰氯之间的取代反应合成dspe-peg-nh-so2-c6h6-ch3。首先，称取并将dspe-peg-nh2和三乙胺加入到25ml三颈烧瓶中，加入适量溶剂dcm，冰浴搅拌；再称取对甲苯磺酰氯，并溶解在1mldcm中，逐滴缓慢加入到烧瓶中，冰浴反应30min，再转室温磁力搅拌反应过夜，tlc检测反应过程。反应结束时，先使用2m盐酸溶液中和体系中残余的三乙胺，之后用饱和食盐水萃取，收集有机相，减压蒸发除去溶剂，产物为黄色脂状固体。室温或4℃保存。
dspe-peg-nh-so2-c6h6-ch3合成反应方程式：
dspe-peg-nh-so2-c6h6-ch3结构确证：
(1)采用核磁共振对dspe-peg-nh-so2-c6h6-ch3进行1hnmr扫描结构确证(图6)。dspe-peg-nh-so2-c6h6-ch3核磁共振氢谱图中，相较于原料dspe-peg-nh2核磁共振结果，在化学位移7.73-7.68ppm处，出现了新的信号峰，该峰归属于为苯环上的非取代氢特征峰，且在化学位移7.91ppm处的代表氨基氢的宽峰消失，表明氨基参与反应，鉴于反应物dspe-peg-nh2不含苯环，固推测反应物即为目标产物；此外，在5.22ppm处出现了一个新的宽峰信号，该峰归属于磺酰胺键上的氢。
(2)红外光谱图谱(图7)显示：在3417cm-1处有一个吸收峰，对应为磺酰胺上的n-h伸缩振动峰，1383cm-1处的峰为s＝o的伸缩振动吸收峰。综上可证明合成化合物即为目标产物。综上，合成化合物可证明为目标产物。
实施例5
对十二烷基苯磺酰脲修饰物的合成。称取尿素加到50ml三颈烧瓶中，并加入少量水溶解，冰浴，称取对十二烷基苯磺酰氯，溶于甲醇并逐滴加入到体系中，再补加适量甲醇，室温下磁力搅拌；6h后，升温至50℃，加热搅拌6-12h，体系呈橙红色油状；tlc检测反应过程。反应结束后，用饱和食盐水和乙酸乙酯萃取，收集有机相，减压蒸发除去有机溶剂，得粗产物。通过硅胶色谱柱层析方式分离纯化产物，洗脱液为石油醚：乙酸乙酯＝8：1，收集目标产物，减压蒸发除去有机溶剂，得黄色粘稠油状液体产物，称重，计算产率，室温或4℃保存。
实施例6内质网靶向脂质体的制备及在核酸药物递送中的应用
内质网靶向mrna脂质体-1的组成：
编码egfp的mrna
内质网靶向mrna脂质体-2的组成：
编码egfp的mrna
内质网靶向mrna脂质体-3的组成：
编码egfp的mrna
内质网靶向mrna脂质体-4的组成：
编码egfp的mrna
内质网靶向mrna脂质体-5的组成：
编码egfp的mrna
内质网靶向mrna脂质体-6的组成：
编码egfp的mrna
考察本发明制备的内质网靶向脂质体的靶向及药效结果，本发明以实例6的内质网靶向mrna递送脂质体为例，进行了研究。
信使核糖核苷酸(mrna)是基因传递的信使，发挥着将基因信息传递给蛋白质的桥梁作用。近年来，随着mrna体外合成(ivtmrna)、mrna化学修饰和递送技术的发展，mrna稳定性和翻译效率大幅提高，免疫原性也逐步可控，且其在肿瘤免疫治疗领域显示出巨大的商业价值，使其成为生物制药领域的新晋宠儿，也成为了各大制药公司积极布局的重要赛道。mrna药物研究涉及到肿瘤疫苗、传染病疫苗、罕见病、蛋白替代疗法和基因编辑等领域。有研究表明，通过高尔基体-内质网途径递送sirna，可以显著提高sirna的治疗效果；通过内质网靶向途径递送核酸药物可以显著提高基因药物的转染效率。基于此，我们构建了一类新型内质网靶向性阳离子脂质体，通过静电吸附作用，对带负电的mrna分子进行装载，用于递送mrna分子。在转染效率普遍较低的骨髓源性树突状细胞系转染时，相较于非靶向组，靶向组可以显著提高转染效率。本发明首次采用内质网靶向载体递送mrna分子，并获得显著效果，并进行了处方考察、细胞摄取、内质网靶向性验证及载体递送转染效率等研究。
1)理化性质表征
首先对内质网靶向mrna脂质体-1的处方进行了探究，对阳离子脂质、辅助脂质、修饰脂质和靶头不同的质量比(0.3％-30％)制备的载体进行研究。发现在采用薄膜分散法制备该脂质体时，当靶头质量比为3％时，表现出优异的转染效果，且安全无毒。采用动态光散射法(dynamiclightscattering，dls)对其粒径和电位进行测定(结果见表1)。从表1中可以看到，内质网靶向脂质体的粒径小于200nm且分布较均一。
表1n-十二烷基-4-甲基苯磺酰胺修饰内质网靶向脂质体理化性质
2)细胞摄取研究
a)根据内质网靶向mrna脂质体-1的处方分别制备靶头占总质量比为0.3％、30％(占载体总质量)的did荧光标记的内质网靶向空白脂质体和非内质网靶向空白脂质体(不含内质网靶向修饰化合物)；小鼠永生系树突状细胞dc2.4以105个/ml的密度接种到24孔细胞培养板中，待24h贴壁后，每孔分别加入32μg/ml的脂质体，分别孵育11.5h和23.5h后吸去培养液，pbs每孔洗3遍；之后加入hochest33342染料对细胞进行核染，每孔加入浓度为10μg/ml的核染料150μl，37℃避光孵育15-20min后，吸掉染液，用pbs洗涤三遍，立刻置于荧光显微镜下观察、成像。红色代表did标记的脂质体；蓝色代表细胞核。见图8，从成像结果可以看出，内质网靶头n-十二烷基-4-甲基苯磺酰胺的加入对细胞摄取没有影响，相较于非靶向组，细胞摄取相当，无明显差异，且细胞状态和形态均正常。
b)根据内质网靶向mrna脂质体-2制备对十二烷基苯磺酰胺用量为3％、6％、9％(占载体总质量)的靶向脂质体和不含靶头的非靶向脂质体，摄取时间设为2h、6h、8h、12h、24h，实验方法同上。见图9，观察结果可知：(a)细胞对脂质体的摄取具有时间依赖性，随摄取时间延长而增加；(b)从摄取6h开始，靶向组摄取快于非靶向组；当摄取时间相当时，9％靶向组摄取量明显多于非靶向组。这可能与靶头的加入增加了载体正电性有关，或是靶头的加入改变了细胞对载体的摄取路径。总之，该现象表明，通过对十二烷基苯磺酰胺对载体进行修饰存在加快细胞对载药纳米载体摄取和递送药物内质网累积的潜力，或许在实际应用中可以减少药物剂量和毒副作用。
c)根据内质网靶向mrna脂质体-6制备did标记的对十二烷基苯磺酰脲用量为0.03％、0.3％、3％(占载体总质量)的靶向脂质体和不含靶头的非靶向空白脂质体，摄取时间设为22h，实验方法同上。见图10，观察结果可知：当摄取时间相当时，靶向组摄取量多于非靶向组。这可能与靶头的加入增加了载体正电性有关，或是靶头的加入改变了细胞对载体的摄取路径。
3)内质网靶向性验证
针对内质网靶向mrna脂质体-1和-2。将鼠源性永生系树突状细胞系dc2.4细胞或是小鼠骨髓来源树突状细胞按2.5×104个/孔接种于24孔板每孔的10mm2的玻片上。待24h贴壁后，每孔分别用1μg/ml的mcherry标记的钙网蛋白质粒转染以标记内质网，转染试剂lipofectaminetm2000transfectionreagent：plasmid＝1.5：1(质量比)，6h后换液；42h后，每孔分别加入一定量的被亲脂性荧光染料did荧光标记的空白内质网靶向脂质体和空白非靶向脂质体。分别孵育1.5h、5.5h、11.5h后吸掉孔内的培养基，每孔用pbs洗涤3次。用hochest33342染料对细胞进行核染，每孔加入浓度为10μg/ml的核染料150μl，37℃避光孵育15-20min后，吸掉染液，用pbs洗涤三遍；每孔加入4％的多聚甲醛溶液固定细胞，10-20min分钟后取出玻片进行封片，置于激光共聚焦显微镜下观察。结果见图11(n-十二烷基-4-甲基苯磺酰胺靶向修饰，占载体总质量的3％)、图12(对十二烷基苯磺酰胺靶向修饰，占载体总质量的9％)和图13(对十二烷基苯磺酰脲化合物修饰，占载体总质量的3％)；另外，采用倒置荧光显微镜分别对十二烷基磺酰胺(占载体总质量的3％)和dspe-peg-nh-so2-c6h6-ch3(占载体总质量的3％)靶向修饰化合物修饰的脂质体摄取6h后的细胞内定位进行评价，分别见图14和图15靶向组内质网荧光信号与脂质体荧光信号重合性较好，且显示出内质网轮廓，非靶向组与内质网重合度较低且分布杂乱。表明这些化合物修饰的脂质体经细胞摄取后均表现出一定的内质网定位效果。
4)载体递送转染效率研究
根据内质网靶向mrna脂质体-1处方，制备不同质量比重的n-十二烷基-4-甲基苯磺酰胺修饰的空白脂质体，分别为非靶向组(non-lipo)、0.3％质量比靶向组(er-lipo-0.3％)、3％质量比靶向组(er-lipo-3％)、30％质量比靶向组(er-lipo-30％)。提取小鼠骨髓细胞，体外诱导分化获得小鼠骨髓来源树突状细胞(bmdcs)，以105个/ml的密度种板，24h后使用编码绿色荧光蛋白的mrna分子进行转染，剂量为1μg/ml，核酸：脂质体＝1:10(质量比)，无血清摄取6h后换成完全培养基，再培养16h，荧光显微镜下成像。见图16，根据成像结果可知：相较于非靶向组，靶向组转染效果更好，而且3％质量比靶向组表现出明显更高的转染效率，这可能因为：在摄取量相当的情况下，通过内质网靶向，避免核酸药物进入溶酶体途径而被破坏，使得更多的核酸药物能够聚集到内质网区域，利用此处胞浆游离核糖体和内质网附着核糖体起始翻译，提高翻译效率。由此凸显出内质网靶向纳米载体在核酸药物递送方面的潜力，以及对作用靶点在内质网区域药物递送的优势。
实施例7
内质网靶向环磷酰胺脂质体的制备
脂质体组成：
处方量的cholesterol、hspc和对十二烷基苯磺酰胺，置于茄形瓶中，加入有机溶剂(乙醇和氯仿)溶解，55℃水浴中真空减压旋转蒸发，瓶壁形成薄膜。向茄形瓶中加入含处方量ctx的pbs水溶液，水化，薄膜脱落溶解并形成多层脂质体溶液；使用探头超声将上述溶液超声至所需粒径，即为载有ctx的内质网靶向脂质体。该脂质体将ctx选择性递送到内质网区域，提高区域药物浓度，利于其与内质网上酶结合而形成活性药物，进而有利于诱导出强烈的细胞毒作用。
环磷酰胺是光谱双功能烷化剂及细胞周期非特异性药物，可干扰dna及rna功能，尤以对前者的影响更大，它与dna发生交叉联结，抑制dna合成，对s期作用最明显。环磷酰胺在代谢前并无细胞毒作用，其活化必须依赖肝细胞微粒体酶系统中的细胞色素p450酶氧化形成4-羟基环磷酰胺，开环后再变成活性很强的磷酰胺氮芥，从而发挥细胞毒作用，临床用于恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、结肠癌、支气管癌、肺癌等。此外，环磷酰胺还具有显著免疫作用，可用于类风湿关节炎、儿童肾病综合征以及自身免疫疾病的治疗。内质网上存在许多与代谢和解毒相关的酶，其中就包含细胞色素p450酶，所以本发明采用内质网靶向纳米载体递送环磷酰胺，可降低环磷酰胺的给药剂量，降低药物毒副作用，提高药物稳定性，节约成本。
实施例8装载环磷酰胺的内质网靶向脂质纳米粒的构建
脂质纳米粒组成：
称取处方量环磷酰胺、氢化大豆卵磷脂(hspc)、单硬脂酸甘油酯、对十二烷基苯磺酰胺溶于适量无水乙醇，45℃水浴形成有机相。另取30mg泊洛沙姆188溶于相同温度水中，构成水相。将有机相在搅拌条件下缓慢逐滴加入到水相。乳化后，等温下继续搅拌15min(1000r·min-1)，除去有机溶剂。将所得半透明体系快速分散于冷水相之中，经探头超声后即得脂质纳米粒，调节超声功率，以获得目标粒径的脂质纳米粒。
实施例9装载环磷酰胺的内质网靶向纳米乳的构建
纳米乳组成：
称取处方量hspc、mct、大豆油、对十二烷基苯磺酰胺并按一定浓度溶解在乙醇中，于55℃下溶解脂质。用注射器将此乙醇溶液、在涡旋条件下逐滴注入含有环磷酰胺的水相中，利用剪切力形成纳米乳。旋蒸去除有机溶剂，使用探头超声在25％功率下探超5min，即得装载环磷酰胺的内质网靶向纳米乳。
实施例10内质网靶向脱氧野尻霉素脂质体的制备
脂质体组成：
处方量的cholesterol、e80和n-十二烷基-4-甲基苯磺酰胺，置于茄形瓶中，加入有机溶剂(乙醇和氯仿)中溶解，55℃水浴中真空减压旋转蒸发，瓶壁形成薄膜。向茄形瓶中加入含处方量脱氧野尻霉素的pbs水溶液，水化，薄膜脱落溶解并形成多层脂质体溶液。使用探头超声将上述溶液超声至所需粒径，即为载有脱氧野尻霉素的内质网靶向脂质体。该脂质体将脱氧野尻霉素选择性递送到内质网区域，提高区域药物浓度，利于其与内质网上酶结合而形成活性药物，进而有利于诱导出强烈的细胞毒作用。
脱氧野尻霉素是桑树中的一种生物碱，属于强效的α-葡萄糖苷酶抑制剂，具有降糖、降脂、抗病毒、抗肿瘤等药理作用。食物中的糖类被水解成蔗糖、麦芽糖等二糖并运送到小肠时，借助存在于小肠微纤毛膜表面细胞内质网上的α-糖苷酶水解为葡萄糖和果糖等单糖，通过肠壁吸收进入体内，导致血液中葡萄糖浓度急剧上升。因此α-糖苷酶是糖尿病治疗的首要目标。其降糖作用机理可能是脱氧野尻霉素与α-蔗糖酶表现为非竞争性抑制作用从而抑制蔗糖的水解、抑制小肠中葡萄糖吸收、保护胰岛β细胞，促进胰岛素分泌等相关。由于内质网上存在大量与代谢和解毒相关的酶，而研究表明脱氧野尻霉素也主要在内质网区域发挥作用，所以，采用内质网靶向载体递送脱氧野尻霉素利于药物在内质网区域的富集、降低药物剂量，节约成本，增强药效。
实施例11内质网靶向阿霉素脂质体的构建
脂质体组成：
处方量的hspc、cholesterol、dspe-peg2000和对十二烷基苯磺酰胺，置于茄形瓶中，加入有机溶剂(氯仿)溶解，在55℃水浴中真空减压旋转蒸发有机溶剂并成膜。之后向茄形瓶中加入ph＝5.4的硫酸铵水溶液，水化，薄膜脱落溶解并形成多层脂质体溶液。使用探头超声将上述溶液超声至粒径适宜且均一的脂质体溶液。将所得的脂质体溶液过sephadexg50柱，用pbs(ph＝7.4)洗脱，除去脂质体外相的硫酸铵溶液。内质网靶向脂质体中加入2mg/ml的阿霉素溶液，使药脂质量比为1:25，50℃水浴搅拌0.5h。再经过sephadexg50柱，除去游离的盐酸阿霉素，最终收集为载阿霉素的内质网靶向脂质体。
作为一种抗肿瘤抗生素，阿霉素可抑制rna和dna的合成，其中对rna的抑制作用最强，属广谱抗肿瘤药，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。主要适用于急性白血病，对急性淋巴细胞白血病及粒细胞白血病均有效。本发明在阿霉素脂质体的经典处方中加入内质网靶向化合物dspe-peg-nh-so2-c6h6-ch3，可将阿霉素靶向递送至内质网膜上，减少溶酶体途径对药物的破坏，可降低阿霉素的给药剂量，降低药物毒副作用，提高药物效力。
实施例12内质网靶向醋酸地塞米松胶束的制备
胶束组成
醋酸地塞米松(dex-ac)1mg
聚乙二醇磷脂(dspe-peg2000)4mg
dspe-peg-nh-so2-c6h6-ch35mg
采用透析法制备内质网靶向醋酸地塞米松胶束。处方量的dex-ac、dspe-peg2000和dspe-peg-nh-so2-c6h6-ch3加1ml无水乙醇溶解，冰水浴超声10min，然后在涡旋条件下，将该无水乙醇溶液缓慢滴加到超纯水中，持续涡旋10min后，置透析袋中，蒸馏水为透析介质，透析12h。结束透析后，冰水浴探头超声10min，即得内质网靶向醋酸地塞米松胶束。
醋酸地塞米松是一种肾上腺皮质激素药。具有抗炎、抗内毒素、抑制免疫、抗休克及增强应激反应等药理作用，广泛应用于各科治疗多种疾病，如自身免疫性疾病，过敏，炎症，哮喘及皮肤科、眼科疾病。聚合物胶束作为具有壳-核结构的纳米递药载体，能将疏水性药物包裹在其疏水内核中，增加难溶性药物的水溶性，同时可降低药物对正常组织的不良反应。利用dspe-peg-nh-so2-c6h6-ch3靶头将醋酸地塞米松制备成具有内质网靶向特性的胶束。该发明优势体现在：一方面，醋酸地塞米松的不良反应较多，将其制备成具有内质网靶向的胶束制剂可以有效地降低给药剂量，减少不良反应，控制其对肝药酶的诱导作用；另一方面，直接将药物靶向至内质网可利用内质网上的酶提高机体对醋酸地塞米松的活化效率。
1.一类细胞内质网靶向纳米载药系统的构建方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
(1)将磺酰氯类化合物与氨水、或胺类化合物或尿素以0.1-2：1的摩尔比在有机溶剂中先在冰浴搅拌条件下反应后，转室温反应后经萃取，收集产物，通过硅胶色谱柱层析法或萃取法纯化获得内质网靶向修饰化合物纯净产物；所述内质网靶向修饰化合物结构式为：
式1中：r1为c6-c18的烷基、甲苯基、c6-c18烷基苯；
r2为酰胺基、氢基、c6-c18烷基、peg化磷脂；
r3为酰胺基、氢基、c6-c18烷基、peg化磷脂；
(2)将脂质材料和内质网靶向修饰化合物，按照内质网靶向修饰化合物占载体总质量的0.03％-50％的摩尔比混合，溶解在有机溶剂中，在45-60℃旋转蒸发形成薄膜，当需要包载脂溶性药物如醋酸地塞米松时，药物与脂质材料一同溶解于有机溶剂中，再加水性介质水化形成多室脂质体，若需要包载水药物如环磷酰胺，则直接将药物溶解在水相中；或使脂溶性药物和脂质材料在有机相中混合，直接分散至水相中，经旋转蒸发除去有机相，再经探头超声或水浴超声后即形成目标纳米载药系统。
2.根据权利要求1所述的一类细胞内质网靶向纳米载药系统的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述胺类化合物选用c6-c18烷胺、氨基封端磷脂化合物，有机溶剂选用二氯甲烷、甲醇、三氯甲烷，萃取溶剂选用饱和食盐水、三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯。
3.根据权利要求1所述的一类细胞内质网靶向纳米载药系统的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述脂质材料选用氢化大豆卵磷脂、单硬脂酸甘油酯、中链脂肪酸甘油脂、大豆油、蛋磷脂、胆固醇、(2，3-二油酰基-丙基)、三甲基氯化铵、二油酰磷脂酰乙醇胺、n-二硬脂酰磷脂酰乙酰胺peg，有机相的有机溶剂选用三氯甲烷、乙醇、甲醇、二氯甲烷、乙醚或其中的两种或两种以上有机溶剂的混合物，水相为ph5.4-ph7.4的pbs溶液、去离子水、或包含水溶性药物如环磷酰胺、盐酸阿霉素、脱氧野尻霉素、蛋白质和多肽等的ph5.4-7.4的pbs水溶液。
4.根据权利要求1所述的一类细胞内质网靶向纳米载药系统的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述式1化合物通过以下方法获得：
方法1：(1)当r1为甲基苯、r2为h和r3为c6-c18烷基时，将磺酰氯类化合物溶于二氯甲烷，在冰浴搅拌下缓慢滴加到c6-c18烷胺的dcm溶液中，磺酰氯类化合物与c6-c18烷胺的摩尔比为1.2-1.5:1，以三乙胺作为缚酸剂，冰浴反应后转室温反应，然后，用2m稀盐酸中和残余三乙酸，饱和食盐水萃取后收集有机相，真空减压蒸发去除有机溶剂，得粗产物，再经硅胶色谱柱进行纯化并收集目标产物即内质网靶向修饰化合物；
方法2：当r1是c6-c18烷基苯、r2为h和r3为h时，将磺酰氯类化合物溶于氯仿并加到三颈烧瓶中，在冰浴条件下加入浓氨水，磺酰氯类化合物与氨水摩尔比为1：3-10，磁力搅拌，室温反应，反应结束后，使用三氯甲烷萃取并收集有机相，减压蒸发除去有机溶剂，得粗产品，再经硅胶色谱柱进行纯化并收集目标产物即内质网靶向修饰化合物；
方法3：当r1是c6-c18烷基、r2为h和r3为h时，首先取氨水加到三颈烧瓶中，再加入甲醇，取磺酰氯类化合物并溶于适量甲醇，在冰浴搅拌条件下缓慢滴加加入，反应30min，转为室温反应过夜，反应结束后，用饱和食盐水和乙酸乙酯萃取，收集有机相，减压蒸发除去有机溶剂，得白色结晶产物即内质网靶向修饰化合物；
方法4：当r1是甲基苯、r2为peg化磷脂和r3为h时，取含氨基的peg化磷脂化合物并溶于二氯甲烷，再将磺酰氯类化合物溶于二氯甲烷，并在冰浴搅拌下缓慢滴加到含氨基的peg化磷脂化合物dcm溶液中，磺酰氯类化合物与含氨基的peg化磷脂化合物的摩尔比为1.2-2:1，以三乙胺作为缚酸剂，冰浴反应30min，再转室温磁力搅拌反应过夜，tlc检测反应过程，反应结束时，先使用2m盐酸溶液中和体系中残余的三乙胺，之后用饱和食盐水萃取，收集有机相，减压蒸发除去溶剂，即获得粗产物，再经硅胶柱层析纯化即得内质网靶向修饰化合物；
方法5：当r1是c6-c18烷基苯、r2为酰胺基和r3为h时，称取尿素加到三颈烧瓶中，并加入少量水溶解，冰浴，取c6-c18烷基苯磺酰氯类化合物，溶于甲醇并逐滴加入到体系中，再补加适量甲醇，室温下磁力搅拌，6h后，升温至50℃，加热搅拌6-12h，tlc检测反应过程，反应结束后，用饱和食盐水和乙酸乙酯萃取，收集有机相，减压蒸发除去有机溶剂，得粗产物，再经硅胶色谱柱层析方式分离纯化产物即得内质网靶向修饰化合物。
5.根据权利要求1所述的一类细胞内质网靶向纳米载药系统的构建方法，其特征在于，所载药物为脂溶性或水溶性抗肿瘤药物、抗炎药物、代谢调控药物、需要在内质网上进一步活化的前体药物及内质网相关疾病的治疗药物、或是需要通过非溶酶体途径递送的核酸类药物。
6.根据权利要求1所述的一类细胞内质网靶向纳米载药系统的构建方法，其特征在于，所构建的纳米载药系统不局限于纳米脂质体，还包括固体脂质纳米粒、纳米乳、聚合物胶束。
7.权利要求1所述方法构建的纳米载药系统在药物递送中的应用。
技术总结