本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种评价间充质干细胞是否能够引起机体免疫反应的方法。
背景技术：
近两年来，在干细胞临床转化方面国家不断给予各项政策支持，加大投入人力财力支持干细胞临床转化。现如今，中国干细胞监管政策试行“双轨制”，一是以医疗机构为主体，将干细胞应用作为医疗技术，报国家卫健委备案，即医疗机构/项目备案途径；二是以干细胞生产企业为主体，将干细胞作为药品，申报国家药监局，即药品评审审批途径。在干细胞新药方面，制定了《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则(试行)》与“60天临床试验默示许可”的新药审批新制度，给我国干细胞新药的研发和申报提供了新的发展机遇。同时，还设立国家“干细胞及转化研究”重点专项推动干细胞治疗药物的研制。而在提交新药审批之前，应该对此药完成安全性评价，指采用大于临床用药剂量，或长于临床用药时间给动物用药，发现并评价药物对动物机体潜在毒性作用，毒性表现，靶器官损伤的可逆性。
药物的安全性评价一般分为毒理性研究和药理性研究，在毒理性研究中，免疫毒性是较为重要的一部分，免疫毒性实验的结果揭示了此款药品使用到机体后是否会引起免疫系统的特异性免疫反应，从而可推测使用人群和使用安全性。免疫毒性实验主要包括了免疫组织和病理形态学、免疫组织化学、免疫化学(elisas,igg,c3)、蛋白毒代动力学、免疫原性、抗药抗体、中和抗体、细胞因子定量、流式细胞术、活组织检测(biopsy)、tdar(t细胞依赖的抗体反应)、体外溶血、血管刺激、主动过敏实验等内容。
间充质干细胞是干细胞的一种，因能分化为间质组织而得名，具有亚全能分化潜能，在特定的体内外环境下，能够诱导分化成为多种组织细胞；是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。在临床应用也最多，与造血干细胞联合应用，可以提高移植的成功率，加速造血重建。当患者接受大剂量化疗后，将间充质干细胞与造血干细胞一同输入，可明显加速患者血细胞恢复时间，且安全无不良反应。间充质干细胞不仅存在于骨髓中，也存在于骨骼肌、骨外膜和骨小梁中。
间充质干细胞的安全性评价不同传统化药，干细胞的动物安全性评价还属于新兴领域，其属于生物制品，并且具有生物活性、种属特异性及无法预料的多种组织亲和性，在使用和储存时和传统的药物或疫苗等生物制剂有很大程度的不同，并且其来源于人体，培养过程中添加了人源的添加物和多种化学重组物质，综上各种因素，对其临床前安全评价尚有较大的难度，现有常规的临床前安全评价方法更加适合的是可量产的化药，常规实验方法的设计不适合于间充质干细胞的安评实验。
鉴于此，申请此专利。
技术实现要素：
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种评价间充质干细胞是否能够引起机体免疫反应的方法，是针对于“间充质干细胞”的免疫毒性和特异性免疫反应的安全性评价，本发明的评价方法设计区别于传统药品的评价方案和评价指标，设计了几种检测实验、并做了针对性的检测和选择了合适的模式动物，具有客观合理的评价结果，对进一步的临床试验具有指导意义。
本发明的目的是提供一种评价间充质干细胞是否能够引起机体免疫反应的方法。
根据本发明的具体实施方式的评价间充质干细胞是否能够引起机体免疫反应的方法，所述评价间充质干细胞是否能够引起机体免疫反应的方法包括免疫毒性指标检测、血管刺激性检测、体外溶血检测和全身主动过敏检测。
根据本发明的具体实施方式的评价间充质干细胞是否能够引起机体免疫反应的方法，其中，所述间充质干细胞以生理盐水为溶剂，且添加2％人血白蛋白制剂。
根据本发明的具体实施方式的评价间充质干细胞是否能够引起机体免疫反应的方法，进一步的，所述免疫毒性指标检测采用食蟹猴为试验动物。
更进一步的，所述免疫毒性指标检测包括淋巴细胞分型测定，补体、免疫球蛋白、循环免疫复合物测定和细胞因子含量测定。
根据本发明的具体实施方式的评价间充质干细胞是否能够引起机体免疫反应的方法，其中，所述淋巴细胞分型测定的指标为：cd45 cd3 、cd45 cd3 cd4 、cd45 cd3 cd8 。
根据本发明的具体实施方式的评价间充质干细胞是否能够引起机体免疫反应的方法，其中，所述淋巴细胞分型测定方法包括：对食蟹猴进行第1、3、5次给药后1天及恢复期第84天分别进行采血，采用流式细胞分析仪按照流式细胞术进行检测。
优选的，所述采血部位为猴下肢隐静脉或其它适宜部位。
更优选的，所述采血得到的血液样品用肝素钠抗凝；血液样品在15-25℃存放48小时内完成检测，或者，在2-8℃存放3天内完成检测。
根据本发明的具体实施方式的评价间充质干细胞是否能够引起机体免疫反应的方法，其中，所述补体、免疫球蛋白、循环免疫复合物测定的指标为免疫球蛋白g、免疫球蛋白m、免疫球蛋白a、补体3、补体4和循环免疫复合物；优选的，所述补体、免疫球蛋白、循环免疫复合物测定方法包括：对食蟹猴进行第1、3、5次给药后1天及恢复期第84天分别进行采血，然后进行检测；更优选的，将补体、免疫球蛋白的待测血液样品室温进行1800×g离心10分钟，分离血清进行检测或直接采用相应时间点所采集的血液样品进行检测；将循环免疫复合物的待测血液样品在2-8℃下进行1800×g离心10分钟，分离血清在-24至-18℃冻存待检。
根据本发明的具体实施方式的评价间充质干细胞是否能够引起机体免疫反应的方法，其中，所述细胞因子含量测定中检测的细胞因子为il-4、il-6和ifn-γ；优选的，所述细胞因子含量测定方法包括：对食蟹猴进行第1、3、5次给药，每次给药前及给药后6小时和24小时，恢复期第84天分别进行采血，然后进行检测；采血检测前食蟹猴禁食至少12小时，不禁水；自猴下肢隐静脉或其他适宜部位采血；更优选的，细胞因子含量测定的待测血液样品在2-8℃下进行1800×g离心10分钟，分离血清用于检测或于-66℃以下保存待用；采用电化学发光系统进行检测。
根据本发明的具体实施方式的评价间充质干细胞是否能够引起机体免疫反应的方法，其中，所述血管刺激性检测以食蟹猴为试验动物；优选的，在末次给药后7天和恢复期结束日分别解剖剩余的存活食蟹猴，将解剖得到的组织或脏器经10％中性福尔马林固定、脱水、包埋、切片机苏木精-伊红染色后，进行组织病理学检查。
根据本发明的具体实施方式的评价间充质干细胞是否能够引起机体免疫反应的方法，其中，所述体外溶血检测采用大耳白兔为试验动物；优选的，所述体外溶血检测包括以下步骤：
(1)大耳白兔以戊巴比妥钠麻醉后，自心脏采血20ml转移至经0.9％氯化钠注射液润洗的锥形瓶；
(2)在锥形瓶中放入玻璃珠，搅拌均匀，除去血液中的纤维蛋白原，制得脱纤血液；
(3)向步骤(2)得到的脱纤血液中加9-11倍量的0.9％氯化钠注射液，摇匀后分装至离心管离心，除去上清液，得到沉淀；
(4)将步骤(3)得到的沉淀红细胞以0.9％氯化钠注射液洗涤至上清液不显红色；
(5)将步骤(4)洗涤后得到的红细胞用0.9％氯化钠注射液配制成2％红细胞悬液；
(6)在试管中依次加入步骤(5)得到的2％红细胞悬液、0.9％氯化钠注射液、灭菌注射用水、含2％人血白蛋白的0.9％氯化钠注射液和间充质干细胞，混匀后置于恒温箱中静置，并观察是否溶血。
根据本发明的具体实施方式的评价间充质干细胞是否能够引起机体免疫反应的方法，其中，所述全身主动过敏检测以豚鼠为试验动物。
根据本发明的具体实施方式的评价间充质干细胞是否能够引起机体免疫反应的方法，其中，阳性对照组是给予4mg/只卵清白蛋白溶液，试验组包括两组，一组为不添加人血白蛋白的间充质干细胞溶液，另一组为添加了人血白蛋白的间充质干细胞溶液。
优选的，间充质干细胞溶液的浓度为2×106细胞/ml。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明有针对性的设计了淋巴细胞分型分析、免疫补体和炎症相关细胞因子的检测实验，可以有效的评估干细胞对健康机体的可能造成的免疫毒性反应；
(2)增加了血管刺激性实验是因为考虑到干细胞和其他生物制剂的不同，间充质干细胞的直径约15-30μm，当一定数量的干细胞回输至机体后，为确定给药局部和全身血管是否会发生应激反应，本方法中添加了血管刺激性的观察；
(3)增加了体外溶血实验是考虑到和一般生物制剂不同，不同生产企业的间充质干细胞回输制剂的配方也不同，因此，间充质干细胞制剂与人体液相比是否属于等渗溶液，是否会引起溶血，属于安评中比较重要的一个检测项目；
(4)本发明的主动全身过敏实验采用的模式动物是豚鼠，普通化药的安评都是用此动物做过敏实验的检测，但因为间充质干细胞属于人源细胞，有很强的种属特异性，并且本发明的制剂的配制配方中含有2％的人血白蛋白，属于强致敏剂，常规分组方法和实验方法一定会得到强阳性的结果，因此，为了检验过敏阳性原因究竟是干细胞或是白蛋白，本发明加了一组不含人血白蛋白的实验组，并且通过结果得知，制剂配方中含有人血白蛋白实验组过敏反应为强阳性，而不含人血白蛋白的间充质干细胞实验组不会引起豚鼠过敏反应，从而得知间充质干细胞的安全性。
(5)本发明将淋巴细胞分析、免疫补体分析、炎症细胞因子分析、病理学评估、溶血检测及过敏反应检测多项技术联合，可从多个角度评估间充质干细胞回输的免疫反应安全性
附图说明
图1为体外溶血检测试验中加液混匀，37±0.5℃静置180分钟后的观察结果之一；
图2为体外溶血检测试验中加液混匀，37±0.5℃静置180分钟后的观察结果之二；
图3为体外溶血检测试验中加液混匀，37±0.5℃静置180分钟后的观察结果之三；
图1-3中编号1号管为阴性对照组，2号管为阳性对照组，3号管为溶剂对照组，4～8号管为hpc-msc人胎盘绒毛膜间充质干细胞组。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
在一些较为具体的实施例中，所述评价间充质干细胞是否能够引起机体免疫反应的方法包括免疫毒性指标检测、血管刺激性检测、体外溶血检测和全身主动过敏检测，所述间充质干细胞以生理盐水为溶剂，且添加2％人血白蛋白制剂，所述免疫毒性指标检测采用食蟹猴为试验动物，所述免疫毒性指标检测包括淋巴细胞分型测定，补体、免疫球蛋白、循环免疫复合物测定和细胞因子含量测定，所述淋巴细胞分型测定的指标为：cd45 cd3 、cd45 cd3 cd4 、cd45 cd3 cd8 。
在另一些较为具体的实施例中，所述评价间充质干细胞是否能够引起机体免疫反应的方法包括免疫毒性指标检测、血管刺激性检测、体外溶血检测和全身主动过敏检测，所述间充质干细胞以生理盐水为溶剂，且添加2％人血白蛋白制剂，所述免疫毒性指标检测采用食蟹猴为试验动物，所述免疫毒性指标检测包括淋巴细胞分型测定，补体、免疫球蛋白、循环免疫复合物测定和细胞因子含量测定，所述淋巴细胞分型测定的指标为：cd45 cd3 、cd45 cd3 cd4 、cd45 cd3 cd8 ；
其中，所述淋巴细胞分型测定方法包括：对食蟹猴进行第1、3、5次给药后1天及恢复期第84天分别进行采血，采用流式细胞分析仪按照流式细胞术进行检测，所述采血部位为猴下肢隐静脉或其它适宜部位，所述采血得到的血液样品用肝素钠抗凝；血液样品在15-25℃存放48小时内完成检测，或者，在2-8℃存放3天内完成检测，所述补体、免疫球蛋白、循环免疫复合物测定的指标为免疫球蛋白g、免疫球蛋白m、免疫球蛋白a、补体3、补体4和循环免疫复合物；优选的，所述补体、免疫球蛋白、循环免疫复合物测定方法包括：对食蟹猴进行第1、3、5次给药后1天及恢复期第84天分别进行采血，然后进行检测；更优选的，将补体、免疫球蛋白的待测血液样品室温进行1800×g离心10分钟，分离血清进行检测或直接采用相应时间点所采集的血液样品进行检测；将循环免疫复合物的待测血液样品在2-8℃下进行1800×g离心10分钟，分离血清在-24至-18℃冻存待检；
所述细胞因子含量测定中检测的细胞因子为il-4、il-6和ifn-γ；优选的，所述细胞因子含量测定方法包括：对食蟹猴进行第1、3、5次给药，每次给药前及给药后6小时和24小时，恢复期第84天分别进行采血，然后进行检测；采血检测前食蟹猴禁食至少12小时，不禁水；自猴下肢隐静脉或其他适宜部位采血；更优选的，细胞因子含量测定的待测血液样品在2-8℃下进行1800×g离心10分钟，分离血清用于检测或于-66℃以下保存待用；采用电化学发光系统进行检测，所述血管刺激性检测以食蟹猴为试验动物；优选的，在末次给药后7天和恢复期结束日分别解剖剩余的存活食蟹猴，将解剖得到的组织或脏器经10％中性福尔马林固定、脱水、包埋、切片机苏木精-伊红染色后，进行组织病理学检查；
所述体外溶血检测采用大耳白兔为试验动物；优选的，所述体外溶血检测包括以下步骤：
(1)大耳白兔以戊巴比妥钠麻醉后，自心脏采血20ml转移至经0.9％氯化钠注射液润洗的锥形瓶；
(2)在锥形瓶中放入玻璃珠，慢速搅拌10分钟，除去血液中的纤维蛋白原，制得脱纤血液；
(3)向步骤(2)得到的脱纤血液中加9-11倍量的0.9％氯化钠注射液，摇匀后分装至离心管离心，除去上清液，得到沉淀；
(4)将步骤(3)得到的沉淀红细胞以0.9％氯化钠注射液洗涤至上清液不显红色；
(5)将步骤(4)洗涤后得到的红细胞用0.9％氯化钠注射液配制成2％红细胞悬液；
(6)在试管中依次加入步骤(5)得到的2％红细胞悬液、0.9％氯化钠注射液、灭菌注射用水、含2％人血白蛋白的0.9％氯化钠注射液和间充质干细胞，混匀后置于恒温箱中静置，并观察是否溶血；
其中，所述全身主动过敏检测以豚鼠为试验动物，阳性对照采用不添加人血白蛋白的间充质干细胞的生理盐水溶液；优选的，间充质干细胞以2×106细胞/ml作为受试浓度。
实施例1
本实施例提供了一种评价间充质干细胞是否能够引起机体免疫反应的方法，包括免疫毒性指标检测、血管刺激性检测、体外溶血检测和全身主动过敏检测，所述间充质干细胞以生理盐水为溶剂，且添加2％人血白蛋白制剂；
1、免疫毒性指标检测
采用食蟹猴为试验动物，免疫毒性指标检测包括淋巴细胞分型测定，补体、免疫球蛋白、循环免疫复合物测定和细胞因子含量测定；
(1)淋巴细胞分型测定的指标为：cd45 cd3 、cd45 cd3 cd4 、cd45 cd3 cd8 ；所述淋巴细胞分型测定方法包括：对食蟹猴进行第1、3、5次给药后1天及恢复期第84天分别进行采血，采用流式细胞分析仪(cytomicsfc500)按照流式细胞术进行检测，所述采血部位为猴下肢隐静脉或其它适宜部位，所述采血得到的血液样品用肝素钠抗凝；血液样品在15-25℃存放48小时内完成检测，或者，在2-8℃存放3天内完成检测；
检验结果见表1：
表1雄性食蟹猴免疫指标各给药组与溶剂对照组相比均数的变化率(％)
*与溶剂对照组相比，均数的差异有统计学意义(p≤0.05)。
从表1中可以看出：
第5次给药后1天
3.1×106细胞/kg组：cd45 cd3 、cd45 cd3 cd8 降低；
9.3×106细胞/kg组：cd45 cd3 cd8 降低；
上述指标与溶剂对照组相比差异有统计学意义(p≤0.05)。但上述指标改变未见剂量相关性，改变幅度也不大，多无明显毒理学意义。
除此以外，试验第1、3、5次给药后1天，各剂量组雌、雄猴cd45 cd3 cd4 与溶剂对照组相比差异均无统计学意义(p>0.05)。恢复期结束，各组猴各淋巴细胞分型指标未见明显异常改变。
(2)补体、免疫球蛋白、循环免疫复合物测定的指标为免疫球蛋白g、免疫球蛋白m、免疫球蛋白a、补体3、补体4和循环免疫复合物；
补体、免疫球蛋白、循环免疫复合物测定方法包括：对食蟹猴进行第1、3、5次给药后1天及恢复期第84天分别进行采血1.5ml，平均分成三份，分别用于补体、免疫球蛋白和循环免疫复合物的检测；检测前，将补体、免疫球蛋白的待测血液样品室温进行1800×g离心10分钟，分离血清进行检测(也可以直接采用相应时间点所采集的血液样品进行检测)；将循环免疫复合物的待测血液样品(不抗凝)在2-8℃下进行1800×g离心10分钟，分离血清在-24至-18℃冻存待检；具体的检测方法和设备见表2：
表2补体、免疫球蛋白、循环免疫复合物检测
检验结果见表3：
表3静脉滴注给予hpc-msc人胎盘绒毛膜间充质干细胞对雄性食蟹猴免疫指标的影响
注：细胞因子各指标第1次给药前～第5次给药后约24小时检测动物为5只，恢复期第84天各组检测动物为2只。因低于定量下限数据blq不纳入统计，故纳入统计样本量减少。“/”表示该组数据均低于定量下限，纳入统计样本量为0。
从表3中可以看出：
第3次给药后1天
3.1×107细胞/kg组：igm升高；
第5次给药后1天
3.1×107细胞/kg组：igm升高；
雌猴
第1次给药后1天
3.1×106细胞/kg组：igg降低；
上述指标与溶剂对照组相比差异有统计学意义(p≤0.05)。上述指标与给药前自身相比无明显变化，无明显毒理学意义。
除此以外，试验第1、3、5次给药后1天，各剂量组雌、雄猴补体(c3、c4)、免疫球蛋白(iga)、循环免疫复合物(cic)等其余指标与溶剂对照组相比差异均无统计学意义(p>0.05)。恢复期结束，各组猴各指标未见明显异常改变。
(3)细胞因子含量测定中检测的细胞因子为il-4、il-6和ifn-γ；测定方法包括：对食蟹猴进行第1、3、5次给药，每次给药前及给药后6小时和24小时，恢复期第84天分别进行采血，然后进行检测；采血检测前食蟹猴禁食至少12小时，不禁水；自猴下肢隐静脉或其他适宜部位采血；检测前，先将待测血液样品(不抗凝)在2-8℃下进行1800×g离心10分钟，分离血清；分成3管，第1管200μl，用于il-4检测；第2管200μl，用于il-6、ifn-γ检测；剩余血清存于另一管在-66℃以下保存待检；检测方法：采用电化学发光系统进行检测，试剂盒品牌为msd，ifn-γ、il-6的试剂盒货号为k156a0h-2，il-4的试剂盒货号为k156twk-2。上述检测方法按其试剂盒说明书进行操作。检测信号值导入watsonlims软件进行分析；
试验结果见表4：
表4静脉滴注给予hpc-msc人胎盘绒毛膜间充质干细胞对雌性食蟹猴免疫指标的影响
注：细胞因子各指标第1次给药前～第5次给药后约24小时检测动物为5只，恢复期第84天各组检测动物为2只。因低于定量下限数据blq不纳入统计，故纳入统计样本量减少。“/”表示该组数据均低于定量下限，纳入统计样本量为0。
从表4中可以看出，试验第1、3、5次给药前及给药后约6、24小时，各剂量组雌、雄猴il-6与溶剂对照组相比差异无统计学意义(p>0.05)或部分猴低于定量下限无法进行统计学检验，均未见明显异常改变。各剂量组雌、雄猴il-4、inf-γ检测值基本低于定量下限或未见明显异常改变。
恢复期结束，各组猴上述细胞因子未见异常改变。
2、血管刺激性检测
试验动物为食蟹猴；
(1)一般状态观察
观察时间：给药当天给药后观察2次，其余试验期间每天观察1次；
观察指标：死亡及摄食、饮水；包括但不限于猴外观体征、被毛、一般行为活动、精神状态、腺体分泌、皮肤和粘膜颜色、呼吸状态、粪便性状、生殖器、死亡等情况及其它毒性症状。，重点关注注射部位(有无出血、红肿、瘀紫、硬结、化脓、溃烂)及给药过程中动物状态；
试验结果：
给药期间及恢复期间，各组所有存活猴注射部位未见红肿、淤血等异常反应，其一般状况良好，自主活动正常、皮肤被毛清洁，粪尿正常，也未见其它毒性反应。
(2)大体解剖和组织病理学检查
解剖时间：在末次给药后7天和恢复期结束日分别解剖剩余的存活食蟹猴
解剖方法：末次给药后7天，每组分别解剖6只猴，雌雄各半；恢复期结束日，每组分别解剖剩余存活猴，其中溶剂对照及低、中剂量组各4只，雌雄各半，高剂量组3只，2雌1雄；
检查组织：给药部位；
固定方法：保存于10％中性缓冲福尔马林固定液中；将解剖得到的组织或脏器经10％中性福尔马林固定、脱水、包埋、切片及苏木精-伊红染色后，检查；
制片及染色：对各组上述组织或脏器均按组织病理学技术标准操作进行取材、石蜡包埋、切片苏木精-伊红染色后，采用显微镜进行组织病理学检查。
试验结果：
从大体解剖来看，给药期结束及恢复期结束，各组雌、雄猴给药部位未见明显异常改变。
给药期结束及恢复期结束计划解剖，各组猴给药部位未发现可能与hpc-msc人胎盘绒毛膜间充质干细胞相关的改变。
3、体外溶血检测
参照《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》(2014年05月)，溶血试验应包括临床拟用最高浓度，故本试验hpc-msc人胎盘绒毛膜间充质干细胞组以临床拟用最高浓度(2×106细胞/ml)作为受试浓度；
采用大耳白兔为试验动物；
ⅰ：红细胞悬液制备包括以下步骤：
(1)大耳白兔以戊巴比妥钠麻醉后(静脉注射30mg/kg)，自心脏采血20ml转移至经0.9％氯化钠注射液润洗的锥形瓶；
(2)在锥形瓶中放入玻璃珠，慢速搅拌10分钟，除去血液中的纤维蛋白原，制得脱纤血液；
(3)向步骤(2)得到的脱纤血液中加10倍量的0.9％氯化钠注射液，摇匀后分装至离心管离心(离心力800g、离心15分钟)，除去上清液，得到沉淀；
(4)将步骤(3)得到的沉淀红细胞以0.9％氯化钠注射液洗涤至上清液不显红色；
(5)将步骤(4)洗涤后得到的红细胞用0.9％氯化钠注射液配制成2％红细胞悬液；
ⅱ：取洁净试管进行编号，1号管为阴性对照组管，2号管为阳性对照组管，3号管为溶剂对照组管，4～8号管为hpc-msc人胎盘绒毛膜间充质干细胞组管。在1-8试管中按照表5的配比量分别依次加入步骤(5)得到的2％红细胞悬液、0.9％氯化钠注射液、灭菌注射用水、含2％人血白蛋白的0.9％氯化钠注射液、hpc-msc人胎盘绒毛膜间充质干细胞，混匀后置于恒温箱中在37±0.5℃温度范围内静置，并观察是否溶血；分别于0、15、30、45、60、120、180分钟各观察一次，平行测定3次，观察结束后拍照；
表5间充质干细胞体外溶血实验配比量
试验结果：
37±0.5℃静置180分钟后，阴性对照组管未出现溶血和凝聚现象，阳性对照组管全溶血；溶剂对照组管(3号管)和hpc-msc人胎盘绒毛膜间充质干细胞组管(4～8号管)均未出现溶血和凝聚现象。
具体结果见表6和图1-3。
表6hpc-msc人胎盘绒毛膜间充质干细胞体外溶血试验结果
备注：“－”代表“无溶血或凝聚”，“ ”代表“部分溶血”，“ ”代表“全溶血”。
以上试验可以看出，在本试验条件下，hpc-msc人胎盘绒毛膜间充质干细胞在2×106细胞/ml浓度下对兔红细胞未见溶血或凝聚作用，体外溶血试验结果为阴性。
4、全身主动过敏检测
以豚鼠为试验动物，参照《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》(2014年05月)，主动全身过敏试验应包括临床拟用最高浓度或剂量。委托方提供的资料显示，临床拟用最高浓度为2×106细胞/ml，人临床药效学有效剂量为1×106细胞/kg。发明人前期预试结果显示：英国种豚鼠按2、4ml/kg单次静脉注射浓度为2×106细胞/ml的w0568(给药剂量分别为4×106、8×106细胞/kg)，各组豚鼠给药后连续观察。3天均未见任何异常反应。
在以上信息的基础上，本试验将hpc-msc人胎盘绒毛膜间充质干细胞以2×106细胞/ml作为受试浓度，hpc-msc人胎盘绒毛膜间充质干细胞低、高剂量组分别按0.1ml/只、0.5ml/只致敏。另设阴性对照组，给予0.5ml/只0.9％氯化钠注射液；设阳性对照组，给予4mg/只卵清白蛋白溶液；设溶剂对照低、高剂量组，分别按0.1ml/只、0.5ml/只给予含2％人血白蛋白的0.9％氯化钠注射液；设hpc-msc人胎盘绒毛膜间充质干细胞(不含人血白蛋白)低、高剂量组，分别按0.1ml/只、0.5ml/只给予2×106细胞/ml不含人血白蛋白的hpc-msc人胎盘绒毛膜间充质干细胞；
激发阶段，按致敏剂量的2倍量进行激发；
具体致敏剂量设计见表7，激发剂量设计见表8：
表7致敏剂量设计表
表8激发剂量设计表
试验结果：
致敏期间，各组豚鼠一般状况良好、自主活动正常、皮肤被毛洁净、无异常分泌物、体重正常，未见其它异常症状出现。
首次激发
首次激发后，阴性对照组和hpc-msc人胎盘绒毛膜间充质干细胞(不含人血白蛋白)低、高剂量组豚鼠均正常，未见过敏反应；阳性对照组豚鼠均出现过敏症状，并于给药后7分钟内全部死亡，过敏反应极强阳性；溶剂对照低剂量组所有豚鼠均出现过敏症状，其中3只豚鼠(3/6比例)于给药后8分钟内死亡，过敏反应极强阳性；溶剂对照高剂量组所有豚鼠均出现过敏症状，其中2只豚鼠(2/6比例)于给药后8分钟内死亡，过敏反应极强阳性；hpc-msc人胎盘绒毛膜间充质干细胞低剂量组所有豚鼠均出现过敏症状，其中1只豚鼠(1/6比例)于给药后约5分钟死亡，过敏反应极强阳性；hpc-msc人胎盘绒毛膜间充质干细胞高剂量组所有豚鼠均出现过敏症状，其中1只豚鼠(1/6比例)于给药后约8分钟死亡，过敏反应极强阳性。以上各组豚鼠出现的过敏症状主要表现为不安宁、搔鼻、呼吸困难、步态不稳、跳跃、喘息等，出现过敏症状且未死亡豚鼠于给药后1小时22分钟内全部恢复正常。
各组过敏症状观察结果见表9。
表9首次激发后全身过敏试验观察结果
备注：*过敏反应动物数按该动物出现的过敏反应最高级数计。表7同。
末次激发
末次激发后，阴性对照组、溶剂对照低剂量组、hpc-msc人胎盘绒毛膜间充质干细胞低剂量组及hpc-msc人胎盘绒毛膜间充质干细胞(不含人血白蛋白)低、高剂量组豚鼠均正常，未见过敏反应；溶剂对照高剂量组有2只(2/4比例)豚鼠出现过敏症状，主要表现为不安宁、咳嗽，于给药后36分钟内恢复正常；hpc-msc人胎盘绒毛膜间充质干细胞高剂量组有2只(2/5比例)豚鼠出现过敏症状，主要表现为不安宁、咳嗽，于给药后25分钟内恢复正常。
各组过敏症状观察结果见表10。
表10末次激发后全身过敏试验观察结果
综上所述，在本试验条件下，英国种豚鼠按0.1、0.5ml/只静脉注射2×106细胞/ml的hpc-msc人胎盘绒毛膜间充质干细胞致敏，主动全身过敏试验结果为阳性；英国种豚鼠按0.1、0.5ml/只静脉注射2×106细胞/ml的hpc-msc人胎盘绒毛膜间充质干细胞(不含人血白蛋白)致敏，主动全身过敏试验结果为阴性。
本实施例对hpc-msc人胎盘绒毛膜间充质干细胞进行检测，经过①免疫毒性指标检测(淋巴细胞分型、免疫原性指标、细胞因子含量)②血管刺激性实验③体外溶血实验④豚鼠全身主动过敏实验四个试验的检测，结果显示，hpc-msc人胎盘绒毛膜间充质干细胞不能引起机体的异常免疫反应，指导今后在临床使用上有较高的安全性。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
1.一种评价间充质干细胞是否能够引起机体免疫反应的方法，其特征在于，所述评价间充质干细胞是否能够引起机体免疫反应的方法包括免疫毒性指标检测、血管刺激性检测、体外溶血检测和全身主动过敏检测。
2.根据权利要求1所述的评价间充质干细胞是否能够引起机体免疫反应的方法，其特征在于，所述间充质干细胞以生理盐水为溶剂，且添加2％人血白蛋白制剂。
3.根据权利要求2所述的评价间充质干细胞是否能够引起机体免疫反应的方法，其特征在于，所述免疫毒性指标检测采用食蟹猴为试验动物，所述免疫毒性指标检测包括淋巴细胞分型测定，补体、免疫球蛋白、循环免疫复合物测定和细胞因子含量测定。
4.根据权利要求3所述的评价间充质干细胞是否能够引起机体免疫反应的方法，其特征在于，所述淋巴细胞分型测定的指标为：cd45 cd3 、cd45 cd3 cd4 、cd45 cd3 cd8 。
5.根据权利要求4所述的评价间充质干细胞是否能够引起机体免疫反应的方法，其特征在于，所述淋巴细胞分型测定方法包括：对食蟹猴进行第1、3、5次给药后1天及恢复期第84天分别进行采血，采用流式细胞分析仪按照流式细胞术进行检测；优选的，所述采血部位为猴下肢隐静脉或其它适宜部位；更优选的，所述采血得到的血液样品用肝素钠抗凝；血液样品在15-25℃存放48小时内完成检测，或者，在2-8℃存放3天内完成检测。
6.根据权利要求3所述的评价间充质干细胞是否能够引起机体免疫反应的方法，其特征在于，所述补体、免疫球蛋白、循环免疫复合物测定的指标为免疫球蛋白g、免疫球蛋白m、免疫球蛋白a、补体3、补体4和循环免疫复合物；优选的，所述补体、免疫球蛋白、循环免疫复合物测定方法包括：对食蟹猴进行第1、3、5次给药后1天及恢复期第84天分别进行采血，然后进行检测；更优选的，将补体、免疫球蛋白的待测血液样品室温进行1800×g离心10分钟，分离血清进行检测或直接采用相应时间点所采集的血液样品进行检测；将循环免疫复合物的待测血液样品在2-8℃下进行1800×g离心10分钟，分离血清，在-24至-18℃冻存待检。
7.根据权利要求3所述的评价间充质干细胞是否能够引起机体免疫反应的方法，其特征在于，所述细胞因子含量测定中检测的细胞因子为il-4、il-6和ifn-γ；优选的，所述细胞因子含量测定方法包括：对食蟹猴进行第1、3、5次给药，每次给药前及给药后6小时和24小时，恢复期第84天分别进行采血，然后进行检测；采血检测前食蟹猴禁食至少12小时，不禁水；自猴下肢隐静脉或其他适宜部位采血；更优选的，细胞因子含量测定的待测血液样品在2-8℃下进行1800×g离心10分钟，分离血清用于检测或于-66℃以下保存待用；采用电化学发光系统进行检测。
8.根据权利要求2所述的评价间充质干细胞是否能够引起机体免疫反应的方法，其特征在于，所述血管刺激性检测以食蟹猴为试验动物；优选的，在末次给药后7天和恢复期结束日分别解剖剩余的存活食蟹猴，将解剖得到的组织或脏器经10％中性福尔马林固定、脱水、包埋、切片机苏木精-伊红染色后，进行组织病理学检查。
9.根据权利要求2所述的评价间充质干细胞是否能够引起机体免疫反应的方法，其特征在于，所述体外溶血检测采用大耳白兔为试验动物；优选的，所述体外溶血检测包括以下步骤：
(1)大耳白兔以戊巴比妥钠麻醉后，自心脏采血20ml转移至经0.9％氯化钠注射液润洗的锥形瓶；
(2)在锥形瓶中放入玻璃珠，搅拌均匀，除去血液中的纤维蛋白原，制得脱纤血液；
(3)向步骤(2)得到的脱纤血液中加9-11倍量的0.9％氯化钠注射液，摇匀后分装至离心管离心，除去上清液，得到沉淀；
(4)将步骤(3)得到的沉淀红细胞以0.9％氯化钠注射液洗涤至上清液不显红色；
(5)将步骤(4)洗涤后得到的红细胞用0.9％氯化钠注射液配制成2％红细胞悬液；
(6)在试管中依次加入步骤(5)得到的2％红细胞悬液、0.9％氯化钠注射液、灭菌注射用水、含2％人血白蛋白的0.9％氯化钠注射液和间充质干细胞，混匀后置于恒温箱中静置，并观察是否溶血。
10.根据权利要求2所述的评价间充质干细胞是否能够引起机体免疫反应的方法，其特征在于，所述全身主动过敏检测以豚鼠为试验动物，阳性对照组是给予4mg/只卵清白蛋白溶液，试验组包括两组，一组为不添加人血白蛋白的间充质干细胞溶液，另一组为添加了人血白蛋白的间充质干细胞溶液；优选的，间充质干细胞溶液的浓度为2×106细胞/ml。
技术总结