技术领域：
本发明涉及组织工程技术领域，具体涉及一种用于组织工程骨支架及其制备方法和应用。
背景技术：
：
感染性大段骨缺损是临床骨组织损伤救治的一大难题，至今尚无理想的治疗手段，其中的重要原因之一在于缺乏有效可靠的兼顾抗感染及组织重建功能的骨修复材料。在骨修复、抗炎以及血管生成的过程中炎症因子的序贯释放扮演着重要的角色。前期研究表明，当宿主巨噬细胞缺失时，移植物内的血管生成无法进行，也有研究表明当宿主巨噬细胞募集被阻断时，宿主内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells，epc)的募集效应显著减弱，且teb成骨修复能力显著降低。在骨折早期炎症因子的释放可加速骨重建过程，但长期的炎症反应会导致损伤部位血管化水平降低延长骨愈合时间。
技术实现要素：
：
本发明的目的就是提供一种用于治疗感染性大段骨缺损，可序贯释放炎症因子促进组织工程骨血管化的组织工程骨支架。
本发明提供了一种用于治疗感染性大段骨缺损的组织工程骨支架的制备方法，包括：
1)将脱钙骨基质支架浸泡于氯化钙溶液中；
2)将含有ifn-γ的海藻酸钠溶液与适量万古霉素溶液混合均匀，得到黏稠溶液；
3)将黏稠溶液缓慢滴注至步骤1)所述脱钙骨基质的孔隙中，静置，形成复合支架；
4)以去离子水将所述复合支架洗净后，于-70～-80℃冻存6h后再低压冻干6～8h，直至重量不再变化；
5)将步骤4)得到的材料浸入含40-60mg/ml纤维蛋白原的kh2po4溶液中缓慢搅动一段时间后，再浸入300-4ooiu/ml凝血酶溶液中缓慢搅动一段时间，取出并于室温风干，即得组织工程骨支架。
在根据本发明的一个实施方案中，步骤1)中在浸泡于氯化钙溶液中之前还包括：
将脱钙骨基质浸泡于亲和素溶液中一段时间，然后再浸泡于生物素化的il-4溶液中一段时间。
在根据本发明的一个实施方案中，所述亲和素溶液的浓度为100-250μg/ml。
在根据本发明的一个实施方案中，所述脱钙骨基质支架是通过包括下述步骤的方法制备得到的：
将所述松质骨块投入0.6m盐酸的密闭玻璃容器中，常温浸泡24小时，每8小时更换一次盐酸，直到皮质骨呈半透明能弯曲的弹性状态，松质骨块呈海绵状压缩后自动恢复原状时，将所述松质骨块取出，以无菌蒸馏水反复冲洗、浸泡，直至ph值为7得到脱钙骨基质支架。
在根据本发明的一个实施方案中，所述浸泡后的得到的脱钙骨基质支架的还进一步包括以下处理步骤：
低速离心后进行辐照处理以灭菌，通过真空冷冻干燥机干燥后，分别浸泡在10mmbiotin-sulfo-lc-lc-nhs中1小时，pbs冲洗三遍后浸泡在pbs中，4℃浸泡24h后备用。
在根据本发明的一个实施方案中，ifn-γ浓度1-2mg/ml，海藻酸钠浓度60-90mg/ml，万古霉素溶液浓度为40-60mg/ml。
在根据本发明的一个实施方案中，纤维蛋白原浓度为50-70mg/ml，所述kh2po4溶液浓度为0.05mol/l。
本发明还提供了根据上述的制备方法制备得到的用于治疗感染性大段骨缺损的组织工程骨支架。
本发明进一步提供了上述用于治疗感染性大段骨缺损的组织工程骨支架在制备用于治疗感染性骨缺损的材料中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明提供的用于治疗感染性大段骨缺损的组织工程骨支架通过纤维蛋白凝胶修饰的藻酸盐-万古霉素-ifn缓释微球在早期释放ifn-γ促进巨噬细胞向经典激活途径巨噬细胞(m1型)极化并持续释放万古霉素达到抗感染的作用。通过链霉素-亲和素系统与il-4结合构建炎症因子缓释系统，在后期释放il-4诱导巨噬细胞向替代激活途径巨噬细胞(m2型)极化，从而可序贯释放炎症因子，可促进血管生成并预防感染。
附图说明
图1材料大体观与扫描电镜结果示意图；
图2万古霉素缓释动力示意图；
图3ifn-γ及il-4缓释动力示意图；
图4mp细胞mrna表达变化图；
图5为mp细胞蛋白表达变化图。
具体实施方式：
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易被本领域人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
材料与方法
材料与试剂
epc购自美国atcc公司(pcs-800-012)
人外周血来源单核巨噬细胞购自美国atcc公司(crl-9855)
内皮细胞培养基(ecm)，0.25％胰蛋白酶,特优胎牛血清，dmem培养基(hyclone)。
人脱钙骨基质购自北京大清生物
海藻酸钠、dil-ac-ldl、fitc-uea-1、biotin-sulfo-lc-lc-nhs、万古霉素、凝血酶、纤维蛋白原(sigma)、重组人il-4蛋白、重组人ifn-γ蛋白(peprotech)均通过商购获得。
实施例1脱钙骨基质(decalcifiedbonematrix，dbm)材料制备及生物素化
1、制备支架：
依托西南医院骨库，以云南小香猪胫骨、股骨近远端松质骨块，制备dbm支架，是支架大小约3x3x3mm3。首先对dbm进行脱钙，在密闭玻璃容器中加入0.6m盐酸，将dbm支架投入其中浸泡。常温浸泡24小时，每8小时更换盐酸一次，当皮质骨呈半透明能弯曲的弹性状态，松质骨块呈海绵状压缩后自动恢复原状，将骨块取出，以无菌蒸馏水反复冲洗、浸泡，直至ph值为7，吸出浸泡液将脱钙的dbm支架材料置于离心管中，300g离心5min，对脱钙的dbm进行辐照处理以灭菌真空冷冻干燥机干燥后分装后将dbm浸泡在在10mmbiotin-sulfo-lc-lc-nhs中1小时，pbs冲洗三遍后浸泡在pbs中，4℃浸泡24h后备用。
2、蛋白生物素化及支架偶联
il4(2mg/ml)浸泡在10mmbiotin-sulfo-ls-ls-nhs1小时完成蛋白生物素化，室温放置1小时后，pbs透析移除未附着的生物素，无菌过滤后存于4℃备用。而后，根据分组需要(表1)，制备含重组人ifn的海藻酸钠溶液(ifn-γ浓度1-2mg/ml，海藻酸钠浓度80mg/ml)
dbm首先浸泡在172μg/ml的亲和素溶液中1小时，pbs冲洗三次。il4、il4 ifn与combo组dbm浸泡在生物素化il4溶液中1小时后pbs冲洗三次，control组与ifn组则浸泡在pbs溶液中1小时。然后ifn组、ifn-il4组与combo组浸泡在ifn-γ溶液中1h，il4组与control组则浸泡在pbs中1小时。上述复合材料浸泡于10.1mg/ml氯化钙溶液中。
将海藻酸钠溶液(160mg/ml)与等体积万古霉素溶液(50mg/ml)混合，搅拌10分钟后，形成均一地黏稠溶液。将复合材料从氯化钙溶液中取出，并马上用注射器抽取上述黏稠溶液后，通过注射器针头，加压使黏稠溶液缓慢滴注入vanco组与combo组复合材料孔隙中，其他组复合材料注射海藻酸钠溶液(80mg/ml)。10分钟后，收集复合材料，去离子水洗净后，-70℃冻存6h后再低压冻干6～8h，直至重量不再变化。将上述材料浸入含60mg/ml纤维蛋白原的kh2po4(0.05mol/l)溶液中缓慢搅动10分钟，再浸入4ooiu/ml凝血酶溶液中缓慢搅动，促进凝胶在微球及支架材料表面形成一层膜，捞出室温风干，分装备用。
表1dbm分组
实施例2缓释动力检测
将第2和第3组复合材料放置在l0ml的dmem/f12培养基中，放置在37℃恒温箱中，每天更换液体，并收集培养基，以10000r/min离心10分钟，取上清液在高效液相色谱仪上测定万古霉素浓度，通过elisa测定il-4与ifn-γ释放量。
实施例3复合材料对巨噬细胞极化的影响
取m-csf刺激5天的巨噬细胞，以1×106/ml的浓度采用双面静置接种法接种于各组材料，加入培养基，培育3天后更换培养基。分别在培养1、4、7天取培养基，通过elisa检测其中蛋白含量。相同时间点取各组材料，液氮研磨后提取mrna，按takara反转录试剂盒说明书进行逆转录后行real-timepcr。引物序列及扩增产物长度见表2。扩增条件为95℃30s，[95℃5s(变性)，57℃，20s(退火)，72℃15s(延伸)]×40个循环，95℃30s，57℃，30s，95℃30s。
表2rt-pcr引物序列
实施例4transwell实验
取epc，消化后以ecm重悬制备单细胞悬液，调整细胞浓度为1×104/ml。在24孔板中组装transwell小室，于下室按照实验分组，分别加入700μl各组培育3天后的培养基。按照实验分组于transwell上室中分别加入200μl含epc的溶液、含axinitib预处理epc的溶液或含sb225002(il-8抑制剂)预处理epc的溶液。将transwell小室置于5％co2、37℃的孵箱内，迁移6小时后终止。以无菌棉签擦拭碳酸酯膜上层以去除未迁移的细胞。用pbs冲洗碳酸酯膜3遍，每遍10分钟。以4％的多聚甲醛固定15分钟，pbs冲洗3遍，每遍10分钟。0.5％triton-x100破膜10分钟，pbs冲洗3遍，每遍10min配置好的dapi工作液(1μg/ml)避光染色5-8分钟。pbs冲洗3遍，每遍10分钟。荧光显微镜下每个碳酸酯膜随机选取10个高倍视野(200×)分别计数，计算并比较每组细胞迁移数量。
数据以均值±标准误表示，采用spss11.0统计软件，进行单因素方差分析及leastsignificantdifference(lsd)，p<0.05为差异具有统计学意义。
实施例5材料性状
观察dbm外观，ifn-γ藻酸盐混合溶液与氯化钙溶液反复浸泡后可在支架孔隙表面形成浅白色胶状物，万古霉素藻酸盐混合溶液滴注在dbm孔隙中即可形成浅白色的球状物，随着时间延长，微球颜色逐渐加深，变成浅黄色，球体及支架材料的硬度增加。扫描电镜结果显示ctrl组支架孔隙率均一，il-4、ifn-γ、il-4 ifn-γ与combo组可见蛋白基质均匀皱缩分布在支架表面，参见图1。
实施例6复合材料的缓释动力
万古霉素对金黄色葡萄球菌(atcc25923)的最小抑菌浓度和杀菌浓度分别为1.20mg/l和2.10mg/l，药物敏感的折点值为5mg/l。以万古霉素敏感的折点值作为最低浓度标准，复合材料释放的万古霉素的浓度超过此值的连续天数为14天(图2)。
如图3所示，尽管ifn-γ的释放总量并无明显差异，无万古霉素缓释微球的复合材料中ifn-γ在前3天稳定释放，而包含万古霉素缓释微球的复合材料ifn-γ缓释时间可延长至4天。万古霉素缓释微球的存在对il-4的缓释并无明显影响，两种复合材料均在第3-7天快速稳定释放。
实施例7复合材料对mp极化状态的影响
pcr结果显示(图4)，在培育第1天，ifn-γ可诱导mp释放tnf-α，表现出m1型极化的部分特征；第4天，ifn-γ的释放使得mp表达m1标志物ccr7、tnf-α以及il-1β。第7天，m1型标志物表达量相比对照物无显著性差异。万古霉素的释放可促进m1型标志物ccr7、il-1β以及趋化因子il-8的表达。在培育第1天，il-4组细胞高表达m2型标志物cd206，证实il-4可诱导m2型细胞极化；在第4天和第7天，复合材料组由于il-4的释放导致m2型标志物ccl18、cd206以及pdgf-bb表达量显著升高。可能由于复合材料中万古霉素持续释放的原因，其vegf表达含量从第一天至第七天持续高表达而万古霉素的持续释放对于m2型细胞极化几乎无影响。
elisa结果显示(图5)，在培育第4天，ifn-γ的释放导致mp高表达m1型标志物tnf-α、il-1β以及趋化因子il-8；il4的释放导致mp高表达m2型标志物组ccl18、pdgf-bb；在第4天和第7天，由于il-4的释放，复合材料显著促进mp的m2型极化。万古霉素的释放可促进m1型标志物tnf-α、il-1β以及趋化因子il-8的表达。
上述发明内容及具体实施方式意在证明本发明所提供技术方案的实际应用，不应解释为对本发明保护范围的限定。本领域技术人员在本发明的精神和原理内，当可作各种修改、等同替换、或改进。本发明的保护范围以所附权利要求书为准。
序列表
<110>中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院
<120>一种用于治疗感染性大段骨缺损组织工程骨支架及其制备方法和应用
<141>2020-11-23
<160>18
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>肿瘤坏死因子(tnf)
<400>1
tccttcagacaccctcaacc20
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>肿瘤坏死因子(tnf)
<400>2
aggccccagtttgaattctt20
<210>3
<211>25
<212>dna
<213>白细胞介素-1(il1)
<400>3
aaacagatgaagtgctccttccagg25
<210>4
<211>24
<212>dna
<213>白细胞介素-1(il1)
<400>4
tggagaacaccacttgttgctcca24
<210>5
<211>20
<212>dna
<213>内生肌酐清除率7(ccr7)
<400>5
aggctattgtcccctaaacc20
<210>6
<211>20
<212>dna
<213>内生肌酐清除率7(ccr7)
<400>6
ggaggagagtgaagaaaacg20
<210>7
<211>20
<212>dna
<213>白细胞介素-8(il8)
<400>7
atggctgctgaaccagtaga20
<210>8
<211>20
<212>dna
<213>白细胞介素-8(il8)
<400>8
ctagtcttcgttttgaacag20
<210>9
<211>21
<212>dna
<213>cd206(cd206)
<400>9
ttcggacacccatcggaattt21
<210>10
<211>18
<212>dna
<213>cd206(cd206)
<400>10
cacaagcgctgcgtggat18
<210>11
<211>20
<212>dna
<213>ccl18(ccl18)
<400>11
ctttcccctttcccttcaac20
<210>12
<211>20
<212>dna
<213>ccl18(ccl18)
<400>12
gtgctgagcaaaaccattca20
<210>13
<211>20
<212>dna
<213>血小板生长因子(pdgf)
<400>13
tcagcagcaaggacaccatg20
<210>14
<211>20
<212>dna
<213>血小板生长因子(pdgf)
<400>14
ccgagcaggtcagaacgaag20
<210>15
<211>19
<212>dna
<213>血管内皮细胞生长因子(vegf)
<400>15
accaaggccagcacatagg19
<210>16
<211>20
<212>dna
<213>血管内皮细胞生长因子(vegf)
<400>16
acgctccaggacttataccg20
<210>17
<211>21
<212>dna
<213>肌动蛋白丝(actin)
<400>17
tcctgtggcatccacgaaact21
<210>18
<211>21
<212>dna
<213>肌动蛋白丝(actin)
<400>18
gaagcatttgcggtggacgat21
1.一种用于治疗感染性大段骨缺损的组织工程骨支架的制备方法，其特征在于，包括：
1)将脱钙骨基质支架浸泡于氯化钙溶液中；
2)将含有ifn-γ的海藻酸钠溶液与适量万古霉素溶液混合均匀，得到黏稠溶液；
3)将黏稠溶液缓慢滴注至步骤1)所述脱钙骨基质的孔隙中，静置，形成复合支架；
4)以去离子水将所述复合支架洗净后，于-70～-80℃冻存6h后再低压冻干6～8h，直至重量不再变化；
5)将步骤4)得到的材料浸入含40-60mg/ml纤维蛋白原的kh2po4溶液中缓慢搅动一段时间后，再浸入300-4ooiu/ml凝血酶溶液中缓慢搅动一段时间，取出并于室温风干，即得组织工程骨支架。
2.如权利要求1所述的组织工程骨支架的制备方法，其特征在于，步骤1)中在浸泡于氯化钙溶液中之前还包括：
将脱钙骨基质浸泡于亲和素溶液中一段时间，然后再浸泡于生物素化的il-4溶液中一段时间。
3.如权利要求2所述的组织工程骨支架的制备方法，其特征在于，所述亲和素溶液的浓度为100-250μg/ml。
4.如权利要求1或2所述的组织工程骨支架的制备方法，其特征在于，所述脱钙骨基质支架是通过包括下述步骤的方法制备得到的：
取猪胫骨或股骨近远端松质骨块，将所述松质骨块投入0.6m盐酸的密闭玻璃容器中，常温浸泡24小时，每8小时更换一次盐酸，直到皮质骨呈半透明能弯曲的弹性状态，松质骨块呈海绵状压缩后自动恢复原状时，将所述松质骨块取出，以无菌蒸馏水反复冲洗、浸泡，直至ph值为7得到脱钙骨基质支架。
5.如权利要求4所述的组织工程骨支架的制备方法，其特征在于，所述浸泡后的得到的脱钙骨基质支架的还进一步包括以下处理步骤：
低速离心后进行辐照处理以灭菌，通过真空冷冻干燥机干燥后，分别浸泡在10mmbiotin-sulfo-lc-lc-nhs中1小时，pbs冲洗三遍后浸泡在pbs中，4℃浸泡24h后备用。
6.如权利要求1所述的组织工程骨支架的制备方法，其特征在于，ifn-γ浓度1-2mg/ml，海藻酸钠浓度60-90mg/ml，万古霉素溶液浓度为40-60mg/ml。
7.如权利要妹1所述的组织工程骨支架的制备方法，其特征在于，纤维蛋白原浓度为50-70mg/ml，所述kh2po4溶液浓度为0.05mol/l。
8.如权利要求1-7中任一项所述的制备方法制备得到的组织工程骨支架。
9.如权利要求8所述的组织工程骨支架在制备用于治疗感染性骨缺损的材料中的应用。
技术总结