本发明涉及组织工程生物材料领域，具体涉及人工微粒皮的制备方法及应用。
背景技术：
重度烧伤创面修复一直是烧伤医学研究的难点，皮源匮乏是其根本问题。目前使用的微粒皮移植、meek微型皮片移植及自异体皮镶嵌移植等技术临床应用可达到1：14(取皮面积1％，可扩增覆盖14％创面)创面封闭的需要。但这种传统“拆东墙补西墙”的治疗策略需要牺牲大量正常皮肤，以及重度烧伤往往需要进行多次手术封闭创面，重症监护治疗时间长，生命风险高。此外，已有采用皮肤层纤维细胞、脐带间充质干细胞、多能干细胞和脱细胞真皮基质混合培养后修复创面的研究，但这些研究结果都没有解决临床特重症烧伤患者应用的需求。为此，避免牺牲正常皮肤同时提供足够皮源的创面封闭方式是现代烧伤医学的研究重点。
cn111407929a公开了一种新型人工皮肤及其制备方法。该新型人工皮肤制备方法具体如下：取新鲜动物离体皮肤，通过氢氧化钠、dna酶、胰蛋白酶、十二烷基硫酸钠、过氧乙酸、pbs等一系列处理后获得脱细胞真皮基质，超声混合将氧化石墨烯与脱细胞真皮基质溶液混匀，再通过富集处理后得到一种新型人工皮肤。其在修复创面的过程中只能起到生物敷料的作用，不具有形成完整皮肤结构的功能。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种人工微粒皮的制备方法及应用，其能够实现真皮基质与表皮干细胞的融合，制得的人工微粒皮具有快速促进创面愈合、提高创面愈合质量的作用。
本发明所述的人工微粒皮的制备方法，其包括如下步骤：
s1，脱细胞真皮基质微粒的制备；
s11，取动物离体皮肤消化、分离，去表皮组织保留真皮组织；
s12，将真皮组织粉碎为微粒并加入edta-胰蛋白酶溶液，进行震荡脱细胞处理，得到脱细胞真皮基质微粒；
s2，表皮干细胞分离培养；
s21，取术后皮肤消化、分离，去真皮组织保留表皮组织；
s22，将表皮组织粉碎、消化、过滤、离心，收集细胞；
s23，以k-sfm或epilife培养液调整细胞浓度为(1～2)×106个细胞/25cm2，接种于采用ⅳ型胶原包被处理的培养瓶中，常规培养至60～70％细胞融合，采用胰蛋白酶消化后传代培养，得到表皮干细胞；
s3，脱细胞真皮基质微粒与表皮干细胞的结合；
s31，将s1制得的脱细胞真皮基质微粒在温度为4～8℃的条件下、采用ⅳ型胶原溶液浸泡包被12～18h，复温至室温，得到浓度为0.01～0.05g/ml的脱细胞真皮基质微粒悬浮液；
s32，将脱细胞真皮基质微粒悬浮液滴加到细胞培养板中，采用k-sfm或epilife培养液重悬细胞培养板中的脱细胞真皮基质微粒；
s33，取s2中培养对数期的表皮干细胞消化、收集，调整浓度为0.2～0.5×106个细胞/ml，加入到细胞培养板中，在温度为37℃、5％的co2的条件下培养制得人工微粒皮。
进一步，所述s11中的消化和分离具体为：将动物离体皮肤经70～75％乙醇浸泡后用pbs溶液清洗，刮除多余的体毛及皮下附带的脂肪组织；然后用0.2～0.5中性蛋白酶在温度为4～8℃的条件下消化处理12～18h，分离得到表皮组织和真皮组织。
进一步，所述s12的edta-胰蛋白酶溶液中edta的浓度为0.01～0.03，胰蛋白酶的浓度0.25～0.5％。
进一步，所述s12的震荡脱细胞处理具体为：将带有真皮组织微粒的edta-胰蛋白酶溶液置于恒温震荡仪中，在转速为80～100rpm的条件下震荡18～24h，然后用pbs溶液洗涤两次，超声震荡30min后用pbs溶液漂洗18～24h，震荡和漂洗过程中均每隔4～6h换液一次。
进一步，所述s22的粉碎、消化、过滤、离心具体为：将表皮组织剪碎，在温度为37℃的条件下用浓度为0.25～0.5％(w/v)的胰蛋白酶溶液消化10～15min，采用rpmi1640培养基终止消化，再用200目筛网过滤，然后在转速为800～1000rpm的条件下离心4～8min。
进一步，所述s23具体为：以k-sfm或epilife培养液调整细胞浓度为(1～2)×106个细胞/25cm2，接种于采用ⅳ型胶原包被处理的培养瓶中，常规培养10～15min，吸弃未贴壁细胞；再采用pbs溶液轻洗两次，更换新的k-sfm或epilife培养液进行常规培养，次日换液，然后每隔三天换液一次；使用倒置相差显微镜观察到60～70％细胞融合时，采用浓度为2.5～5g/l的胰蛋白酶溶液消化3～8min，收集细胞且将收集的细胞均分四份传代培养。
进一步，所述s1中的动物离体皮肤为人、猪、兔、牛、羊或鼠的皮肤。
上述制备方法的制得的人工微粒皮在烧伤创面修复中的应用。
本发明与现有技术相比具有如下有益效果。
1、本发明通过先粉碎再脱细胞的方式去除皮肤组织中的免疫原性物质，既能完整的保留皮肤组织细胞外基质成分，又能达到优良的脱细胞效果，且在脱细胞过程中使用的都是性质较温和的试剂，最大程度的保留了皮肤细胞外基质的活性成分。同时简化了脱细胞真皮基质处理方法，制得的脱细胞真皮基质通过红外技术分析确定其胶原结构完好，能够更好的适合于细胞贴附和存活。在脱细胞真皮基质上培养了表皮干细胞，形成的人工微粒皮不仅具有生物敷料作用，而且能够将移植的表皮干细胞依托脱细胞真皮基质增殖、分化形成皮肤完整结构。
2、本发明实现了真皮基质与表皮干细胞的融合，制得的人工微粒皮具有快速促进创面愈合、恢复表皮复层结构、提高创面愈合质量、重建皮肤真皮组织结构的作用。同时为解决创面细胞治疗，提高细胞存活率提供了一种新方法，该方法是一种快速、有效封闭严重烧伤创面的一种新方式，有望解决临床重症烧伤患者皮源短缺。
附图说明
图1是本发明实施例一猪皮组织的宏观形貌示意图；
图2是本发明实施例一制得的adm宏观形貌示意图；
图3是本发明实施例一制得的adm的he染色结果示意图；
图4是本发明实施例一制得的adm的微观形貌示意图
图5是本发明实施例一制得的adm的红外扫描结果示意图；
图6是本发明实施例一制得的adm的粒径分布示意图；
图7是本发明实施例一制得的adm的zeta电位测试结果示意图；
图8是本发明实施例一制得的adm在k-sfm培养液中形态示意图；
图9是本发明实施例一制得的adm分散在k-sfm培养液中的稳定性分析结果示意图；
图10是本发明实施例一制得的adm在k-sfm培养液中溶胀度示意图；
图11是本发明实施例一制得的adm的细胞毒性测试结果示意图；
图12是本发明实施例一制得的adm的血液相容性测试结果示意图；
图13是本发明实施例一制得的epsc的微观形貌图；
图14是本发明实施例一制得的epsc的流式鉴定结果示意图；
图15是带有gfp的epsc与adm混合培养结果示意图；
图16是带有gfp的epsc与adm混合培养颗粒he染色结果示意图；
图17是对照组、adm组、epsc组和试验组的创面修复情况示意图；
图18是对照组、adm组、epsc组和试验组的创面愈合率曲线图；
图19是对照组、adm组、epsc组和试验组的创面未上皮化统计示意图；
图20是第11天裸鼠创面修复的masson染色结果示意图；
图21是对照组、adm组、epsc组和试验组的创面切面真皮面积统计示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作详细说明。
实施例一，一种人工微粒皮的制备方法，其包括如下步骤：
s1，脱细胞真皮基质微粒的制备。
s11，取猪皮组织用75％乙醇浸泡1min后，用pbs溶液清洗两次，刮除多余的体毛，手术剪修剪皮下附带的脂肪组织；然后用0.25％中性蛋白酶在温度为4℃的条件下消化处理12h，分离得到表皮组织和真皮组织，去表皮组织保留真皮组织。
s12，将真皮组织粉碎为微粒并加入edta-胰蛋白酶溶液得到混悬液，所述edta-胰蛋白酶溶液中edta的浓度为0.02％，胰蛋白酶的浓度0.25％。将带有真皮组织微粒的edta-胰蛋白酶溶液置于恒温震荡仪中，在转速为80rpm的条件下震荡24h，每隔6h换液一次。然后用pbs溶液洗涤两次，超声震荡30min后置于恒温震荡仪中，用pbs溶液漂洗24h，每隔6h换液一次。得到脱细胞真皮基质微粒，记作adm，adm为acellulardermalmatrixparticles的简称。将制得adm在无菌生理盐水中于4℃环境下保存备用。
参见图1和图2，猪皮组织脱细胞后制得的adm呈白色微粒状。
对制得的adm进行he染色分析，参见图3，无细胞存在，表明制备的adm脱细胞彻底。
采用扫描电镜进一步观察adm的微观形貌，参见图4，adm内部由纤维构成网状结构，呈现出无序排列，纤维丝表面粗糙，且纤维丝直径大小不均一。
采用红外扫描仪对制得的adm进行红外扫描分析，参见图5，显示adm分别在1659、1549和1239cm-1处出现吸收峰，表明其胶原分子的二级分子结构α-helix、β-sheet和β-turn保存良好，脱细胞处理未导致这些特征峰位移。
采用马尔文粒径仪对制得的adm粒径进行测试，参见图6，adm在溶液中粒径分布于500nm-700nm之间，说明adm整体偏小，粒径小于50nm比例约有6.3％，结果表明adm呈现出一种层级结构，其大部分为小颗粒，小部分为大颗粒。
对制得的adm的zeta电位进行测试，参见图7，粒子表面带负电荷，在溶液中趋向于絮凝。
对制得的adm在细胞培养环境下的稳定性进行测试，将adm用k-sfm培养液稀释成混悬溶液，镜下观察其形态，参见图8，adm的形态不规则，呈网状式分布，且有胶原纤维细丝分布。然后将adm混悬溶液置于37℃、5％的co2细胞培养箱中，分别于第1天和第5天镜下观察adm形态，参见图9，adm形态及大小保持稳定。进一步分析adm在培养基中的溶胀度，参见图10，adm在培养基中30min钟内充分吸水膨胀，30min之后adm溶胀度达到峰值且趋于稳定。综上结果可知，相对时间内adm在细胞培养环境下能够保持稳定。
对adm的细胞毒性进行考察，结果参见图11，adm浸提液指0.5g的adm用10ml的dmem含10％fbs培养基混合过滤所得，0、12.5、25、50、75、100分别代表adm浸提液占dmem 10％fbs培养基的比率。adm浸提液每个浓度做6个复孔，共计3次独立重复试验。可知，adm浸提液对3t3细胞无细胞毒性，相反adm能够促进3t3细胞增殖，增殖作用具有浓度剂量依赖关系，因此，能够将adm与epsc共培养，epsc为epithelialstemcells的简称，即表皮干细胞。同时，adm浸提液血液相容性分析结果参见图12，nacl组即阴性组指的是注射用生理盐水溶液，5、10、20mg/ml的adm分散液用注射生理盐水配置，h2o为阳性组，不同浓度的adm溶液与阳性组相比不具有血液相容性，表明adm浸提液在发挥其他生物学作用时，可注射方式给药。
s2，表皮干细胞分离培养，采用ⅳ型胶原快速黏附法并进行改良，分离纯化培养人表皮干细胞。
s21，取废弃包皮消毒后加入中性蛋白酶ⅱ于4℃消化12h，分离得到表皮组织和真皮组织，去真皮组织保留表皮组织；
s22，将表皮组织剪碎，在温度为37℃的条件下用浓度为2.5g/l的胰蛋白酶溶液消化10min，采用rpmi1640培养基终止消化，再用200目筛网过滤，然后在转速为1000rpm的条件下离心5min，收集细胞并计数；
s23，以k-sfm培养液调整细胞浓度为1×106个细胞/25cm2，接种于采用ⅳ型胶原包被处理的培养瓶中，常规培养10min，吸弃未贴壁细胞；再采用pbs溶液轻洗两次，更换新的k-sfm培养液进行常规培养，次日换液，然后每隔三天换液一次；使用倒置相差显微镜观察到60～70％细胞融合时，采用浓度为2.5g/l的胰蛋白酶溶液消化7min，收集细胞且将收集的细胞均分四份传代培养，得到表皮干细胞即epsc。取第4代分离培养细胞完成流式流式细胞学检测分离培养细胞中人表皮干细胞cd49f和cd71的表达，结果见图13，采取iv型胶原快速黏附法对epsc进行分离培养，第4代倒置相差显微镜下观察分离培养细胞形态：细胞伸展、多角形、细胞核浆比例大，可见细胞内细胞核及细胞器，鹅卵石样排列，表明培养细胞均符合原代表皮干细胞的形态和该细胞生长特征。流式细胞学结果参见图14，分离培养的第4代epsc的cd49f cd71-为97％，epsc表面高表达cd49f和低表达cd71，结合细胞形态表明，所获取的细胞为epsc。综上，所培养细胞符合人表皮干细胞的特性。
s3，脱细胞真皮基质微粒与表皮干细胞的结合。
s31，取0.5g的adm在温度为4℃的条件下、采用10ml的ⅳ型胶原溶液浸泡包被12h，复温至室温，得到浓度为0.05g/ml的adm悬浮液。
s32，向48孔板中滴加adm悬浮液，取adm为250μg/48孔板。接着，采用500μl的k-sfm培养液重悬48孔板中的adm，在转速为1200rpm的条件下离心10min，弃上清。
s33，取s2中培养对数期的表皮干细胞epsc消化、收集，调整浓度为0.5×106个细胞/ml，每48孔板加入500μl的epsc溶液，在温度为37℃、5％的co2的条件下培养制得人工微粒皮。
考察epsc能否和adm结合，将带有gfp的epsc与adm混合培养，gfp指的是绿色荧光蛋白，激光共聚焦观察培养，结果参见图15，在adm上具有显著绿色荧光表达，说明epsc和adm稳定粘附；进一步将混合培养颗粒进行he染色，结果参见图16，切片中有epsc细胞存在。同时，混合培养3天后，所得人工微粒皮颗粒用胰酶消化计数细胞，250μg的adm结合epsc细胞数约为1x105个，折算0.5g的adm能负载epsc细胞2x108个，表明成功制备出人工微粒皮颗粒，能够进行创面伤口移植研究。
实施例二，分析实施例一制得的人工微粒皮对烧伤后深度创面愈合的作用，具体包括如下步骤。
步骤一，取15只相同环境下生长的7周龄裸鼠，雌雄各半分成3组，每组5只，分别命名为adm组、epsc组、人工微粒皮组，并进行编号，适应性饲养1周后用于实验。
步骤二，采用2.4％水合氯醛溶液(7.5ml/kg)腹腔注射麻醉，消毒处理后打孔器于裸鼠背部皮肤中轴线行对称打孔，造成全层皮肤缺损创伤，左、右两侧各一个直径为6mm的圆孔，一侧作为对照面，另一侧作为实验面；
步骤三，将实施例一制备的人工微粒皮收集在ep管中，在转速为1200rpm的条件下离心10min，弃上清，使总浓度为250μg/μl的微粒皮，每1μl结合了1×103个epsc；另外制备等量epsc和等浓度的adm溶液。
步骤四，在制备的全层皮肤缺损孔中分别滴加对应体积样品；对照组为pbs溶液，加入量为5μl/孔；adm组为5μl的adm分散液，其中含250μg的adm；epsc组为5μl含2.5×105个细胞的细胞悬液；试验组为实施例一制得的人工微粒皮，加入量为5μl，其中含2.5×105个epsc结合250μg的adm。
步骤五，对创面周边再次消毒处理后，用无菌医用透气敷贴封闭创面。
步骤六，将术后所有小白鼠分笼饲养，定期观察小鼠的精神状态、进食情况以及伤口愈合程度并形成记录，并取创面皮肤组织做进一步he染色和masson染色观察。
步骤七，分别于造模后第7天、第11天、第15天，采用4％水合氯醛溶液(7.5ml/kg)腹腔注射麻醉裸鼠；以6mm直径标准圆型纸片做为参照物，固定高度垂直拍照；imagej软件统计创面愈合率，创面愈合率计算公式如下：
创面愈合率(％)＝(原始创面面积-未愈合创面面积)/原始创面面积x100％。
拍照后相应取材，对创面组织进行he染色和masson染色。masson三色染色法具体为：采用4％水合氯醛溶液(7.5ml/kg)腹腔注射麻醉裸鼠，用手术剪小心剪得创面部位全层皮肤，以4％多聚甲醛固定24h，常规脱水，石蜡包埋，之后按试剂盒说明书操作。染色结果：胶原纤维为蓝色，肌纤维、胞质、纤维素、角蛋白和红细胞为红色，胞核为蓝褐色。
参见图17和图18，分别于第1、7、11、15天观察记录裸鼠创面修复，并用相机固定高度垂直拍照结果，随时间延长，创面愈合面积增大，其中对照组致创后第7、11、15天的创面愈合率分别为31.29±5.59％、47.93±6.11％、67.02±7.34％。adm组致创后第7、11、5天的创面愈合率分别为37.95±6.34％、54.19±7.46％、77.64±2.77％。epsc组致创后第7、11、15天的创面愈合率分别为44.84±7.76％、58.98±8.79％、79.09±3.91％。试验组致创后第7、11、15天的创面愈合率分别为51.43±6.43％、69.83±6.62％、81.21±4.81％。试验组与对照组创面愈合率相比较第7天高19.4％，p<0.01；第11天高21.8％，p<0.01；第15天高14.2％，p<0.05。试验组与adm组的创面愈合率相比较第7天高13.48％，p<0.05；第11天高15.64％，p<0.05；第15天高3.57％，adm组与epsc组创面愈合率相比无显著性。结果表明，实施例一制得的人工微粒皮颗粒具有快速修复创面的作用。
创面上皮化是创面最终愈合的标志，将第7天创面皮肤进行he染色分析创面上皮化情况。参见图19，其中对照组创面未上皮化大小为1198.52±42.65μm，adm组创面未上皮化大小为816.44±84.76μm，epsc组为635.10±65.57μm，试验组为162.88±31.78μm。试验组和对照组、adm组和epsc组相比创面上皮化显著，p<0.01，表明了实施例一制得的人工微粒皮具有加速创面上皮化作用。
adm主成分是胶原纤维蛋白，在创面愈合过程能更好地以基底形式修复创面皮肤结构。将第11天创面皮肤进行masson染色，分析创面上皮化时纤维胶原含量情况。参见图20和21，e1、e2为对照组在不同倍数下的masson染色结果，f1、f2为adm组在不同倍数下的masson染色结果，g1、g2为epsc组在不同倍数下的masson染色结果，h1、h2为试验组在不同倍数下的masson染色结果；对照组纤维胶原含量相比于试验组、adm组、epsc组低，对照组创面切面真皮组织面积相比于试验组、adm组、epsc组低，p<0.01。adm组与试验组和epsc组相比较创面切面真皮组织面积高，p<0.01，表明adm能更好地促进创面真皮结构修复。综上，创面移植epsc具有促进创面上皮化、恢复表皮复层结构作用，创面移植adm可重建皮肤真皮组织，实施例一制得的人工微粒皮具有快速促进创面愈合、恢复表皮复层结构、提高创面愈合质量、重建皮肤真皮组织结构的作用。
实施例三，一种人工微粒皮的制备方法，其包括如下步骤：
s1，脱细胞真皮基质微粒的制备。
s11，取猪皮组织用75％乙醇浸泡1min后，用pbs溶液清洗两次，刮除多余的体毛，手术剪修剪皮下附带的脂肪组织；然后用0.25％中性蛋白酶在温度为4℃的条件下消化处理12h，分离得到表皮组织和真皮组织，去表皮组织保留真皮组织。
s12，将真皮组织粉碎为微粒并加入edta-胰蛋白酶溶液得到混悬液，所述edta-胰蛋白酶溶液中edta的浓度为0.01％，胰蛋白酶的浓度0.5％。将带有真皮组织微粒的edta-胰蛋白酶溶液置于恒温震荡仪中，在转速为80rpm的条件下震荡24h，每隔6h换液一次。然后用pbs溶液洗涤两次，超声震荡30min后置于恒温震荡仪中，用pbs溶液漂洗24h，每隔6h换液一次。得到脱细胞真皮基质微粒，记作adm，将制得adm在无菌生理盐水中于4℃环境下保存备用。
s2，表皮干细胞分离培养，采用ⅳ型胶原快速黏附法并进行改良，分离纯化培养人表皮干细胞。
s21，取废弃包皮消毒后加入中性蛋白酶ⅱ于4℃消化12h，分离得到表皮组织和真皮组织，去真皮组织保留表皮组织；
s22，将表皮组织剪碎，在温度为37℃的条件下用浓度为2.5g/l的胰蛋白酶溶液消化10min，采用rpmi1640培养基终止消化，再用200目筛网过滤，然后在转速为1000rpm的条件下离心5min，收集细胞并计数；
s23，以k-sfm培养液调整细胞浓度为1.5×106个细胞/25cm2，接种于采用ⅳ型胶原包被处理的培养瓶中，常规培养10min，吸弃未贴壁细胞；再采用pbs溶液轻洗两次，更换新的k-sfm培养液进行常规培养，次日换液，然后每隔三天换液一次；使用倒置相差显微镜观察到60～70％细胞融合时，采用浓度为2.5g/l的胰蛋白酶溶液消化5min，收集细胞且将收集的细胞均分四份传代培养，得到表皮干细胞即epsc。
s3，脱细胞真皮基质微粒与表皮干细胞的结合。
s31，取0.5g的adm在温度为4℃的条件下、采用10ml的ⅳ型胶原溶液浸泡包被12h，复温至室温，得到浓度为0.05g/ml的adm悬浮液。
s32，向48孔板中滴加adm悬浮液，取adm为250μg/48孔板。接着，采用500μl的k-sfm培养液重悬48孔板中的adm，在转速为1200rpm的条件下离心10min，弃上清。
s33，取s2中培养对数期的表皮干细胞epsc消化、收集，调整浓度为0.3×106个细胞/ml，每48孔板加入500μl的epsc溶液，在温度为37℃、5％的co2的条件下培养制得人工微粒皮。
实施例四，一种人工微粒皮的制备方法，其包括如下步骤：
s1，脱细胞真皮基质微粒的制备。
s11，取猪皮组织用75％乙醇浸泡1min后，用pbs溶液清洗两次，刮除多余的体毛，手术剪修剪皮下附带的脂肪组织；然后用0.25％中性蛋白酶在温度为4℃的条件下消化处理12h，分离得到表皮组织和真皮组织，去表皮组织保留真皮组织。
s12，将真皮组织粉碎为微粒并加入edta-胰蛋白酶溶液得到混悬液，所述edta-胰蛋白酶溶液中edta的浓度为0.01％，胰蛋白酶的浓度0.5％。将带有真皮组织微粒的edta-胰蛋白酶溶液置于恒温震荡仪中，在转速为80rpm的条件下震荡24h，每隔6h换液一次。然后用pbs溶液洗涤两次，超声震荡30min后置于恒温震荡仪中，用pbs溶液漂洗24h，每隔6h换液一次。得到脱细胞真皮基质微粒，记作adm，将制得adm在无菌生理盐水中于4℃环境下保存备用。
s2，表皮干细胞分离培养，采用ⅳ型胶原快速黏附法并进行改良，分离纯化培养人表皮干细胞。
s21，取废弃包皮消毒后加入中性蛋白酶ⅱ于4℃消化12h，分离得到表皮组织和真皮组织，去真皮组织保留表皮组织；
s22，将表皮组织剪碎，在温度为37℃的条件下用浓度为2.5g/l的胰蛋白酶溶液消化10min，采用rpmi1640培养基终止消化，再用200目筛网过滤，然后在转速为1000rpm的条件下离心5min，收集细胞并计数；
s23，以k-sfm培养液调整细胞浓度为2×106个细胞/25cm2，接种于采用ⅳ型胶原包被处理的培养瓶中，常规培养10min，吸弃未贴壁细胞；再采用pbs溶液轻洗两次，更换新的k-sfm培养液进行常规培养，次日换液，然后每隔三天换液一次；使用倒置相差显微镜观察到60～70％细胞融合时，采用浓度为2.5g/l的胰蛋白酶溶液消化5min，收集细胞且将收集的细胞均分四份传代培养，得到表皮干细胞即epsc。
s3，脱细胞真皮基质微粒与表皮干细胞的结合。
s31，取0.5g的adm在温度为4℃的条件下、采用10ml的ⅳ型胶原溶液浸泡包被12h，复温至室温，得到浓度为0.05g/ml的adm悬浮液。
s32，向48孔板中滴加adm悬浮液，取adm为250μg/48孔板。接着，采用500μl的k-sfm培养液重悬48孔板中的adm，在转速为1200rpm的条件下离心10min，弃上清。
s33，取s2中培养对数期的表皮干细胞epsc消化、收集，调整浓度为0.4×106个细胞/ml，每48孔板加入500μl的epsc溶液，在温度为37℃、5％的co2的条件下培养制得人工微粒皮。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
1.一种人工微粒皮的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
s1，脱细胞真皮基质微粒的制备；
s11，取动物离体皮肤消化、分离，去表皮组织保留真皮组织；
s12，将真皮组织粉碎为微粒并加入edta-胰蛋白酶溶液，进行震荡脱细胞处理，得到脱细胞真皮基质微粒；
s2，表皮干细胞分离培养；
s21，取术后皮肤消化、分离，去真皮组织保留表皮组织；
s22，将表皮组织粉碎、消化、过滤、离心，收集细胞；
s23，以k-sfm或epilife培养液调整细胞浓度为(1～2)×106个细胞/25cm2，接种于采用ⅳ型胶原包被处理的培养瓶中，常规培养至60～70％细胞融合，采用胰蛋白酶消化后传代培养，得到表皮干细胞；
s3，脱细胞真皮基质微粒与表皮干细胞的结合；
s31，将s1制得的脱细胞真皮基质微粒在温度为4～8℃的条件下、采用ⅳ型胶原溶液浸泡包被12～18h，复温至室温，得到浓度为0.01～0.05g/ml的脱细胞真皮基质微粒悬浮液；
s32，将脱细胞真皮基质微粒悬浮液滴加到细胞培养板中，采用k-sfm或epilife培养液重悬细胞培养板中的脱细胞真皮基质微粒；
s33，取s2中培养对数期的表皮干细胞消化、收集，调整浓度为0.2～0.5×106个细胞/ml，加入到细胞培养板中，培养制得人工微粒皮。
2.根据权利要求1所述的人工微粒皮的制备方法，其特征在于，所述s11中的消化和分离具体为：将动物离体皮肤经70～75％乙醇浸泡后用pbs溶液清洗，刮除多余的体毛及皮下附带的脂肪组织；然后用0.2～0.5中性蛋白酶在温度为4～8℃的条件下消化处理12～18h，分离得到表皮组织和真皮组织。
3.根据权利要求1或2所述的人工微粒皮的制备方法，其特征在于：所述s12的edta-胰蛋白酶溶液中edta的浓度为0.01～0.03，胰蛋白酶的浓度0.25～0.5％。
4.根据权利要求1或2所述的人工微粒皮的制备方法，其特征在于，所述s12的震荡脱细胞处理具体为：将带有真皮组织微粒的edta-胰蛋白酶溶液置于恒温震荡仪中，在转速为80～100rpm的条件下震荡18～24h，然后用pbs溶液洗涤两次，超声震荡30min后用pbs溶液漂洗18～24h，震荡和漂洗过程中均每隔4～6h换液一次。
5.根据权利要求1或2所述的人工微粒皮的制备方法，其特征在于，所述s22的粉碎、消化、过滤、离心具体为：将表皮组织剪碎，在温度为37℃的条件下用浓度为0.25～0.5％(w/v)的胰蛋白酶溶液消化10～15min，采用rpmi1640培养基终止消化，再用200目筛网过滤，然后在转速为800～1000rpm的条件下离心4～8min。
6.根据权利要求1或2所述的人工微粒皮的制备方法，其特征在于，所述s23具体为：以k-sfm或epilife培养液调整细胞浓度为(1～2)×106个细胞/25cm2，接种于采用ⅳ型胶原包被处理的培养瓶中，常规培养10～15min，吸弃未贴壁细胞；再采用pbs溶液轻洗两次，更换新的k-sfm或epilife培养液进行常规培养，次日换液，然后每隔三天换液一次；使用倒置相差显微镜观察到60～70％细胞融合时，采用浓度为2.5～5g/l的胰蛋白酶溶液消化3～8min，收集细胞且将收集的细胞均分四份传代培养。
7.根据权利要求1或2所述的人工微粒皮的制备方法，其特征在于：所述s1中的动物离体皮肤为人、猪、兔、牛、羊或鼠的皮肤。
8.权利要求1～7任一项所述制备方法的制得的人工微粒皮在烧伤创面修复中的应用。
技术总结