本发明涉及一种肝素化磁性纳米粒子(fenps-hepda)及其制备方法和应用，更具体地说，涉及一种聚赖氨酸修饰的三氧化二铁磁性纳米粒子(fenps)与多巴胺修饰的肝素(hepda)通过静电相互作用形成的核壳机构的纳米粒子，该纳米粒子具有超顺磁性，磁响应有序排布和良好的生物相容性。
背景技术：
从广义上讲，纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围或由它们作为基本单元构成的材料。在纳米材料中，磁性纳米材料由于其特殊的磁性能，如超顺磁性、高矫顽力、低居里温度和高磁化率等，受到了材料科学界的广泛关注。目前它已经广泛的应用于磁流体、环境保护、数据存储、催化以及生物医学等领域，是一种应用十分广泛的功能材料。磁性纳米材料的研究最早开始于20世纪70年代，1988年法国巴黎大学的科学家在研究fe/cr纳米结构的多层膜时发现了巨磁电阻效应，进一步推动了磁性纳米材料的发展。因此，探索合成具有特殊性能的磁性纳米材料对推动纳米科学技术的发展将有着至关重要的意义，同时也会对人类社会的发展产生深远的影响。
与宏观块状材料不同，纳米磁性材料具有一些特殊的物理化学性质，如超顺磁性、小尺寸效应、表面效应、量子隧道效应等优良特性，利用这些性质，可以制造出许多块状材料的性能所达不到的新材料。磁性纳米粒子表面修饰作为一种最常用的化学方法普遍用于功能化磁性纳米粒子的合成。铁基纳米粒子作为最普遍的磁性纳米材料，通过特异化学反应如硅烷化偶联反应、络合反应、酯化反应等将有机配体修饰到铁基磁性纳米粒子表面，制得表面不同功能基团修饰的磁性纳米复合材料。dung等通过悬浮交联法，以戊二醛为交联剂，制备得到壳聚糖修饰的fe3o4磁性纳米粒子(dung,d.t.k.；hai,t.h.；phuc,l.h.et.al.preparationandcharacterizationofmagneticnanoparticleswithchitosancoating.journalofphysics:conferenceseries2009,187,012036.)。habibi用提拉镀膜法将一定浓度有氨基修饰的纤维素溶液加入到fe3o4磁性纳米粒子水溶液中，制得磁性纳米复合物，该复合物可作为功能化生物材料应用在药物传递、肿瘤治疗和酶工程等领域(habibi,n.,functionalbiocompatiblemagnetite-cellulosenanocompositefibrousnetworks:characterizationbyfouriertransformedinfraredspectroscopy,x-raypowderdiffractionandfieldemissionscanningelectronmicroscopyanalysis.spectrochim.acta.amol.biomol.spectrosc.2015,136,1450-1453.)。
生物医用植入材料的血液相容性是临床应用中首要考虑的问题，由于材料表面会直接接触血液，而材料的表面化学性质决定了其抗凝血性，因此材料表面改性作为一种最常用的手段来改善血液相容性。肝素作为临床最广泛的具有抗凝血和抑制血栓形成的抗凝药，其表面富集大量的羧基官能团，可以通过静电相互作用形成纳米粒子的方法来固定肝素，并应用于药物释放，例如，黄楠等人将肝素和聚赖氨酸通过静电相互作用形成核壳结构的纳米粒子，然后固定于聚多巴胺修饰的材料表面，有效改善了材料的血液相容性。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种肝素化磁性纳米粒子及其制备方法和应用。
本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现。
本发明的一种肝素化磁性纳米粒子及其制备方法和应用，按照下述步骤进行：
(1)以多巴胺(da)和肝素(hep)为原料，利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)通过酰胺化反应，制备出多巴胺修饰的肝素(hepda)；
(2)将步骤(1)制得的多巴胺修饰的肝素(hepda)和聚赖氨酸修饰的三氧化二铁纳米粒子(fenps)溶解于tris缓冲液中，在室温下搅拌反应，以利用静电相互作用将带有正电荷的聚赖氨酸修饰的三氧化二铁磁性纳米粒子与带有负电的多巴胺修饰的肝素复合形成核壳结构的纳米粒子。
步骤(2)中所述tris缓冲液的ph为8.5，浓度为5mg/ml。
步骤(2)中所述多巴胺修饰的肝素(hepda)和聚赖氨酸修饰的三氧化二铁纳米粒子(fenps)溶解于tris缓冲液中，在室温下搅拌反应2-4h。
步骤(2)中反应结束后，将反应溶液离心20-30min，转速为4000-6000rpm，然后将下层沉淀物真空干燥，得到所述核壳结构的纳米粒子。
所述的肝素化磁性纳米粒子(fenps-hepda)在制备抗凝血材料中的应用。
多巴胺在分散和固定肝素化磁性纳米粒子中的应用，肝素化磁性纳米粒子以聚赖氨酸修饰的三氧化二铁纳米粒子为内核，表面负载巴胺修饰的肝素，在磁场控制下有效分散并固定在多巴胺修饰的基质表面。
本发明的有益效果是：本发明提供一种以聚赖氨酸修饰的三氧化二铁磁性纳米粒子(fenps)为内核，表面负载多巴胺修饰的肝素(hepda)的核壳结构的纳米粒子，这种核壳结构的纳米粒子除了表现出磁性纳米粒子的一些固有属性如磁响应排布，还具有抗凝血功能和良好的生物相容性，可以在磁场控制下有效分散并固定在多巴胺修饰的基质表面。
附图说明
图1是本发明的hepda的核磁共振氢谱图。
图2是本发明的hepda的傅里叶红外谱图。
图3是本发明的hepda的紫外-可见光吸收光谱。
图4是本发明的纳米粒子的粒径分布图。
图5是本发明的纳米粒子的粒径变化图。
图6是本发明的纳米粒子的zeta点位变化图。
图7是本发明纳米粒子的热重分析图。
图8是本发明纳米粒子的扫描电子显微镜(sem)图。
图9是本发明纳米粒子的细胞毒性图。
图10是本发明纳米粒子的活化部分凝血活酶时间(aptt)和凝血酶原时间(pt)图。
图11是本发明的纳米粒子的原子力显微镜(afm)图。
具体实施方式
下面是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
依据参考文献(you,i.；kang,s.m.；byun,y.；lee,h.,enhancementofbloodcompatibilityofpoly(urethane)substratesbymussel-inspiredadhesiveheparincoating.bioconjug.chem.2011,22,1264-9.)的方法制备多巴胺修饰的肝素(hepda)：首先，将1g肝素溶解在100mlph5.5的mes缓冲溶液中，之后加入5mmn-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和10mm1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，搅拌均匀，之后将混合溶液在室温下搅拌1h活化肝素上的羧基；待搅拌完成后，将0.3g多巴胺溶解于mes缓冲液中并加入到上述反应溶液中，在室温下大力搅拌反应过夜；反应结束后，在截留分子量为3500da的透析袋中透析24h来除去未反应的分子，冻干得到产物多巴胺修饰的肝素(hepda)。
将上述制备得到的hepda进行核磁共振氢谱检测，由图1可见，其d＝2.8ppm(methylene)对应多巴胺上亚甲基的特征峰，由此证明多巴胺成功接枝到肝素上。
将上述制备得到的hepda进行红外光谱检测，由图2可见，其特征峰如下ν＝3436cm-1(s,nh),2924cm-1(m,nh),1557cm-1(vs,c＝o)，图中灰色区域1557cm-1特征峰的出现代表酰胺键的产生，由此证明多巴胺与肝素通过酰胺化反应共价结合在一起，即多巴胺成功接枝到肝素上。
按照上述的步骤得到产物后，分别将多巴胺，肝素以及多巴胺修饰的肝素进行紫外可见光吸收测试，在200-1000nm的波长范围内以1nn/s的速度测试吸光度以及吸收峰，由图3可见，多巴胺和肝素分别在280nm和258nm处存在特征吸收峰，而当多巴胺共价接枝到肝素上时，在263nm处出现新的吸收峰，通过不同吸收峰的强度我们可以得出多巴胺的接枝率。
将上述步骤制备得到的多巴胺修饰的肝素(hepda)溶解于10mmph8.5tris缓冲溶液，浓度为5mg/ml，将聚赖氨酸修饰的三氧化二铁纳米粒子(fenps)溶液与上述溶液混合，在室温下搅拌2h，然后5000rpm离心20min，真空干燥后得到核壳结构的纳米粒子(fenps-hepda)。
将修饰前后的聚赖氨酸修饰的三氧化二铁纳米粒子进行动态光散射和zeta点位分析，检测其修饰前后粒径和电势变化。
在图4中，a为修饰前的聚赖氨酸修饰的三氧化二铁纳米粒子(fenps)的动态光散射粒径分布图，b为修饰后的聚赖氨酸修饰的三氧化二铁纳米粒子(fenps-hepda)的动态光散射粒径分布图。由图4可见，未修饰前的fenps表现出窄分布，粒径为59.9±7.1nm，通过静电相互作用将hepda负载到fenps表面之后，粒径增大，且分布变宽，粒径为162±10.3nm，由此证明了其外层涂层的形成。
为了证实多巴胺接枝的肝素(hepda)可以进一步发生反应，以未修饰肝素作为阴性对照组，利用与上述相同的步骤将肝素负载到fenps表面得到fenps-hep，并对其进行动态光散射。由图5可见，肝素修饰的fenps(fenps-hep)的粒径仅能达到106±10.3nm，小于fenps-hepda的粒径，这主要是由于肝素接枝多巴胺后可以发生进一步的氧化自聚反应，可以显著增大涂层的厚度。
由图6可见，聚赖氨酸修饰的fenps带有正电，电势为31.8±2.7mv，而负载肝素和多巴胺修饰的肝素的fenps-hep和fenps-hepda的电势分别为-35.5±3.3mv和-27.1±2.6mv。肝素带有大量的羧基，所以表面呈现负电荷，而多巴胺修饰的肝素占用了部分羧基形成酰胺键，所以fenps-hepda的电势比fenps-hep要低，由此侧面证明了核壳结构的成功合成。
通过热重分析检测修饰前后的聚赖氨酸修饰的三氧化二铁纳米粒子热失重变化，通过25℃-700℃过程中的热失重分析，可以得到负载在fenps表面的hepda含量，由图7可见其含量为9.7％。
利用如下方法检测本发明的纳米粒子的表面形貌和结构。为了直观看到本发明制备得到的纳米粒子的表面形貌和结构，将不同的纳米粒子分散在乙醇溶液中，超声搅拌均匀，取20l溶液滴在预先清洗的硅片上，室温干燥12h，然后真空干燥2h，表面喷金处理后，通过扫描电子显微镜(sem)观察。在图8中，a为修饰前的聚赖氨酸修饰的三氧化二铁纳米粒子(fenps)的sem照片，b为修饰后的聚赖氨酸修饰的三氧化二铁纳米粒子(fenps-hepda)的sem照片。由图8可见，聚赖氨酸修饰的三氧化二铁纳米粒子(fenps)在被hepda修饰后粒径显著增大，且表面形成核壳结构。
由图9可见，fenps-hepda的细胞活性达到80％以上，证明有效果。
活化部分凝血活酶时间(aptt)和凝血酶原时间(pt)主要反映内源性凝血系统状况和外源性凝血系统状况。由图10可见，肝素修饰的纳米粒子与纯肝素均具有良好的抗凝血性能，其中aptt测试值均超过120s，而正常空白组的aptt值仅为18s；而其pt值与空白组相比，基本处在正常的波动范围之内，由此可以证明其抗凝作用还是改变内源性凝血行为。
在图11中，a为聚四氟乙烯基板(ptfe)的afm照片，b为磁场条件下肝素复合纳米粒子(fenps-hepda)修饰的聚四氟乙烯基板的afm照片，c为未加磁场条件下肝素复合纳米粒子(fenps-hepda)修饰的聚四氟乙烯基板的afm照片，d为聚四氟乙烯基板(ptfe)以及分别修饰聚多巴胺(pda)和肝素复合纳米粒子(fenps-hepda)的水接触角。由图11可见，纯聚四氟乙烯基板(ptfe)表现出比较光滑的表面，通过修饰肝素复合纳米粒子之后表现出粗糙的表面，在磁场条件下，纳米粒子可以均匀铺展在ptfe表面，表面粗糙度表现均一，而未加磁场控制时，纳米粒子会出现部分的团聚，表面形貌不规整；通过水接触角表征可以看到，ptfe表现出疏水的性质，表面水接触角为100.2°,而修饰多巴胺结构后接触角为67.9°，表面变得亲水，之后将纳米粒子修饰在表面后，接触角变为37.1°，表面亲水性质的改变有利于纳米粒子的铺展。
根据本发明内容进行工艺参数的调整，均可实现肝素化磁性纳米粒子的制备，且表现出与本发明实施例基本一致的性能。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
1.一种肝素化磁性纳米粒子，其特征在于：由下述步骤制备得到：
(1)以多巴胺和肝素为原料，利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺通过酰胺化反应，制备出多巴胺修饰的肝素；
(2)将步骤(1)制得的多巴胺修饰的肝素和聚赖氨酸修饰的三氧化二铁纳米粒子溶解于tris缓冲液中，在室温下搅拌反应，以利用静电相互作用将带有正电荷的聚赖氨酸修饰的三氧化二铁磁性纳米粒子与带有负电的多巴胺修饰的肝素复合形成核壳结构的纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的肝素化磁性纳米粒子，其特征在于：步骤(2)中所述tris缓冲液的ph为8.5，浓度为5mg/ml。
3.根据权利要求1所述的肝素化磁性纳米粒子，其特征在于：步骤(2)中所述多巴胺修饰的肝素和聚赖氨酸修饰的三氧化二铁纳米粒子溶解于tris缓冲液中，在室温下搅拌反应2-4h。
4.根据权利要求1所述的肝素化磁性纳米粒子，其特征在于：步骤(2)中反应结束后，将反应溶液离心20-30min，转速为4000-6000rpm，然后将下层沉淀物真空干燥，得到所述核壳结构的纳米粒子。
5.一种肝素化磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)以多巴胺和肝素为原料，利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺通过酰胺化反应，制备出多巴胺修饰的肝素；
(2)将步骤(1)制得的多巴胺修饰的肝素和聚赖氨酸修饰的三氧化二铁纳米粒子溶解于tris缓冲液中，在室温下搅拌反应，以利用静电相互作用将带有正电荷的聚赖氨酸修饰的三氧化二铁磁性纳米粒子与带有负电的多巴胺修饰的肝素复合形成核壳结构的纳米粒子。
6.根据权利要求5所述的肝素化磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述tris缓冲液的ph为8.5，浓度为5mg/ml。
7.根据权利要求5所述的肝素化磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述多巴胺修饰的肝素和聚赖氨酸修饰的三氧化二铁纳米粒子溶解于tris缓冲液中，在室温下搅拌反应2-4h。
8.根据权利要求5所述的肝素化磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于：步骤(2)中反应结束后，将反应溶液离心20-30min，转速为4000-6000rpm，然后将下层沉淀物真空干燥，得到所述核壳结构的纳米粒子。
9.根据权利要求1-4任一项所述的肝素化磁性纳米粒子在制备抗凝血材料中的应用。
10.多巴胺在分散和固定肝素化磁性纳米粒子中的应用，其特征在于：肝素化磁性纳米粒子以聚赖氨酸修饰的三氧化二铁纳米粒子为内核，表面负载巴胺修饰的肝素，在磁场控制下有效分散并固定在多巴胺修饰的基质表面。
技术总结