本发明属于物质检测技术领域，尤其涉及一种具有类漆酶活性的纳米酶及其制备方法和应用。
背景技术：
牛乳含有人体必需的氨基酸、多种矿物质，是人类健康饮食的重要组成部分，被称为“白色血液”。然而，牛乳过敏是一种最常见的食物过敏反应，占所有确诊食物过敏病例的9％，在儿童中发病率大约为0.3％～7.5％，在成年人中的发病率则小于1％；α-乳白蛋白是乳清蛋白中主要的优质蛋白，也是乳清蛋白中主要的致敏蛋白之一。
目前牛乳中过敏蛋白常用检测的方法：(1)毛细管电泳法，重复性差，容易堵塞；(2)基于识别特征基因的荧光定量pcr(qpcr)、环介导等温扩增(lamp)，存在特异性差、操作复杂的问题；(3)基于高效液相色谱的方法(hplc)，设备昂贵，成本较高，需要专业人员操作；因此，基于抗体特异性识别的酶联免疫方法(elisa)仍是检测牛乳中过敏蛋白主要的手段。
传统的elisa使用天然酶的高效催化作用，从而实现检测信号的多重放大。常用的酶如碱性磷酸化酶和辣根过氧化物酶等，虽然这些酶具有高催化效率和专一性，但也存在一些内在的不足，比如易失活、不稳定、催化条件苛刻，储藏难度大等。而且，存在天然酶提取纯化难度比较大，过程复杂，成本比较高等缺点。因此，探索一种成本低，稳定性高，催化活性好的人工酶替代传统的免疫传感器中的天然酶构建新型免疫传感器尤为重要。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供了一种具有类漆酶活性的纳米酶的制备方法，按照以下步骤进行：
s101：将氯化铜的水溶液、谷胱甘肽水溶液、n，n二甲基甲酰胺以体积比为1：2：4ml的比例在室温下混合搅拌均匀后，转移至不锈钢反应釜中；
s102：将所述不锈钢反应釜放置在烘箱中加热，然后冷却至室温，反应合成纳米酶；
s103：将所述合成的纳米酶进行离心收集，并用n，n二甲基甲酰胺和去离子水洗数次去除残留试剂，最后将其真空干燥，得到具有类漆酶活性的纳米酶。
优选的，所述步骤s102中，在烘箱中140℃加热4.5h；所述步骤s103中，合成的纳米酶在10000r5min的条件下离心收集；真空干燥的温度为45℃。
本发明还提供了一种具有类漆酶活性的纳米酶，由上述的制备方法制备而成。
本发明同时提供了上述一种具有类漆酶活性的纳米酶的应用，将其用于制作纳米酶免疫传感器，并将所述纳米酶免疫传感器应用于检测牛乳过敏蛋白。
优选的，所述牛乳过敏蛋白为α-乳白蛋白。
优选的，所述纳米酶免疫传感器的制备方法如下：
s201：用ab1包被96孔板；
s202：用ab2修饰具有类漆酶活性的纳米酶，制备纳米酶免疫传感器的免疫检测标签；
s203：采用2，4-二氯苯酚与4-氨基安替比林作为显色底物，构建基于具有类漆酶活性的纳米酶免疫传感器。
本发明提供了一种基于纳米酶免疫传感器应用于检测α-乳白蛋白时包含以下步骤：
s301：包被；用ab1包被96孔板，洗涤后用bsa封闭；
s302：免疫反应；将不同已知浓度的α-乳白蛋白样品加入到ab1包被的96孔板，并进行温育、洗涤、甩干；
s303：修饰免疫酶标签；将纳米酶标记的ab2加入96孔板，并进行温育、洗涤、甩干；
s304：显色反应；在96孔板中加入mes缓冲液，然后再分别加入2，4-二氯苯酚与4-氨基安替比林，通过氧化偶联反应产生红色产物，在25～95℃孵育10～60min后取出；
s305：读数测定，用酶标仪测量96孔板各孔中510nm波长处的吸光值，并根据不同已知浓度的α-乳白蛋白样品的吸光值，建立标准曲线，根据标准曲线测定未知浓度的α-乳白蛋白样品浓度。
优选的，所述步骤s301中，ab1的浓度为10μg/ml；
所述步骤s302和s303中，温育、洗涤、甩干的条件均为在37℃温育1h，倾倒用pbst洗涤3次，每次3min，垂直甩干板内洗涤液；
所述步骤s304中，显色反应时反应体系的ph值为6.8，孵育温度为65℃，时间为30min。
本发明的有益效果：本发明提供的一种具有类漆酶活性的纳米酶的制备方法简单、方便、成本低，且制备的具有类漆酶活性的纳米酶具有优良的类漆酶催化活性、稳定性高、易储藏，其催化2，4-二氯苯酚与4-氨基安替比林的氧化偶联反应生成明显的红色产物，利用此性质可以将其应用于制作可以检测牛乳过敏蛋白的纳米酶免疫传感器，由于其对α-乳白蛋白具有良好的特异性，在检测时具有高灵敏性，并且可重复操作，真个检测过程方便、简单、易操作。
附图说明
图1：实施例1中捕获抗体浓度(ab1)对免疫传感器性能的影响图。
图2：实施例1中免疫反应孵育时间对免疫传感器性能的影响图。
图3：实施例1中纳米酶催化显色反应温度和时间对免疫传感器性能的影响示意图。
图4a：免疫传感器检测不同浓度α-乳白蛋白的吸收光谱图。
图4b：免疫传感器的标准曲线图。
图5：免疫传感器对α-乳白蛋白的选择性示意图。
图6：氧化偶联反应产生的红色产物分子结构。
具体实施方式
为了使本发明的方案和有益效果更加清楚、明显，下面将结合附图和实施方式对本发明作进一步说明。
在操作前，需要做以下准备：
(1)主要试剂与材料：α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、牛血清白蛋白bsa、κ-酪蛋白、α-酪蛋白、小麦蛋白、大豆蛋白、鸡蛋蛋白、花生蛋白、漆酶、辣根过氧化物酶、α-乳白蛋白单克隆抗体(ab1)、α-乳白蛋白多克隆抗体(ab2)、2，4-二氯苯酚与4-氨基安替比林。
(2)主要仪器：酶标仪、96孔板、紫外分光光度计。
(3)缓冲液及其他溶液：
a.碳酸盐缓冲液(50mm，ph9.6)：称取2.93gnahco3，1.59gna2co3，去离子水定容至1l；
b.pbs缓冲液(10mm，ph7.2)：称取0.20gkh2po4，8.00gnacl，2.90gna2hpo4·12h2o，去离子水定容至1l；
c.洗涤液(pbst，ph7.2)：称取0.20gkh2po4，8.00gnacl，2.90gna2hpo4·12h2o，2.00gtween-20，去离子水定容至1l；
d.封闭液(0.5％bsa)：0.50g溶于100mlpbs。
实施例1：
本实施例提供了一种具有类漆酶活性的纳米酶，通过纳米酶以谷胱甘肽和氯化铜为前体通过水热法合成；具体的，按照以下方法制备而成：
取1ml0.24mol/l的氯化铜的水溶液，2ml0.12mol/l的谷胱甘肽水溶液，4mln，n二甲基甲酰胺混合(氯化铜的水溶液、谷胱甘肽水溶液、n，n二甲基甲酰胺以体积比为1：2：4ml)，在室温下搅拌5分钟后转移至10ml的不锈钢反应釜中；然后，把不锈钢反应釜放置在烘箱中在140℃条件下加热4.5小时，冷却至室温；合成的纳米酶在10000r，5min条件下离心收集，用n，n二甲基甲酰胺和去离子水洗3次去除残留试剂，最后将制备的纳米酶在45℃条件下真空干燥，即得到具有类漆酶活性的纳米酶。
用上述方法制备的纳米酶具有优良的类漆酶催化活性、稳定性高、易储藏，并且可以催化2，4-二氯苯酚与4-氨基安替比林的氧化偶联反应生成明显的红色产物，其分子式如图6所示，利用此性质可以将其应用于制作可以检测牛乳过敏蛋白的纳米酶免疫传感器。
实施例2：
本实实施例提供了一种具有类漆酶活性的纳米酶的应用方式，即将其应用于制作可以检测牛乳过敏蛋白(α-乳白蛋白)的纳米酶免疫传感器，具体操作如下：
第一步：利用实施例1的方法制备具有类漆酶活性的纳米酶，并利用制备的纳米酶进行纳米酶@ab2复合物的制备。
具体的，取2mgedc和2mgnhs溶解于2ml纳米酶(1mg/ml)，涡旋溶解并混合均匀，接着在37℃频率200r的振荡器上孵育30min，离心水洗2次去除多余的edc和nhs，获得功能化的纳米酶；将功能化的纳米酶重新分散到2mlpbs(10mm，ph7.2)的缓冲液中，加入200μg/mlab2，在37℃，200r条件下震荡1h，然后，加入1％bsa阻断剩余结合位点，洗涤2～3次，离心后再次分散到pbs中备用；此步骤是为了用ab2修饰具有类漆酶活性的纳米酶，制备纳米酶免疫传感器的免疫检测标签。
第二步：进行96孔板的包被和结合位点阻断。
具体的，先进行ab1包被96孔板，即用碳酸盐缓冲液(50mm，ph9.6)稀释的ab1加入96孔板，每孔200μl，使用保鲜膜密封在4℃条件下过夜；包被结束后，用洗涤液(pbst，ph7.2)洗涤3次，每次3min，并垂直甩干板内洗涤液，此操作是为了固定捕获抗体；接着进行封闭，用pbs缓冲液将bsa配为1g/100ml，每孔100μl加入96孔板，37℃温育1h，倾倒后用pbst洗涤4次，每次3min，垂直甩干板内洗涤液，此操作为阻断96孔板剩余结合位点，避免假阳性结果。
第三步：基于纳米酶的免疫传感器的构建，具体的按照如下步骤进行。
免疫反应：把0、0.02、0.2、2、20、40、80、100、200、400、800、1000ng/ml的α-乳白蛋白加入到ab1包被的96孔板，每孔200μl，设立3个平行，在37℃温育1h，倾倒用pbst洗涤3次，每次3min，垂直甩干板内洗涤液。
加入纳米酶标记的ab2：把纳米酶标记的ab2加入96孔板，每孔200μl，在37℃温育1h，倾倒用pbst洗涤3次，每次3min，垂直甩干板内洗涤液。
比色反应：在96孔板中加入100μl的mes缓冲液(30mm，ph6.8)，然后再分别加入2，4-二氯苯酚与4-氨基安替比林各75μl，在25～95℃孵育10～60min，取出。
读数：用酶标仪测量各孔中510nm处的吸光度。
上述步骤，即构建完成基于具有类漆酶活性的纳米酶免疫传感器，为了提高此免疫传感器对α-乳白蛋白的检测性能，本实施例还研究了包被96孔板ab1的量、免疫反应孵育时间、纳米酶催化显色反应温度及时间对其检测性能的影响，如图1-3所示。
图1表明吸光度值随ab1浓度的增加而增加，当ab1浓度达到10μg/ml时，实验组的吸光值几乎保持恒定；然而，在相同条件下对照组中未观察到吸光度；以上结果表明10μg/ml的ab1可以满足免疫测定的要求。
图2表明当孵育时间达到1h时发生假阳性结果，这可能归因于较长的孵育时间会导致更多的非特异性结合；因此，最佳孵育时间应设定为1h。
图3表明基于响应面分析，最佳催化反应温度设定为65℃，时间设为30min时，免疫传感器的检测灵敏性最高。
实施例3：
为了进一步说明上述免疫传感器的检测性能，本实施例做了以下评估，在上述最优条件下把0、0.02、0.2、2、20、40、80、100、200、400、800、1000ng/ml的α-乳白蛋白加入ab1包被的96孔板，每孔200μl，设立3个平行；在37℃温育1h，倾倒用pbst洗涤3次，每次3min，垂直甩干板内洗涤液。把纳米酶标记的ab2加入96孔板，每孔200μl，在37℃温育1h，倾倒用pbst洗涤3次，每次3min，垂直甩干板内洗涤液。在96孔板中加入100μl的mes缓冲液(30mm，ph6.8)，然后再分别加入2，4-二氯苯酚与4-氨基安替比林各75μl，在25～95℃孵育10～60min，取出。读数，用酶标仪测量各孔中510nm处的吸光度。
图4a表明测量的吸光值，图4b是根据测定结果建立的免疫传感器的标准曲线，当α-乳白蛋白的浓度在0.06～400ng/ml之间时，吸光值随着α-乳白蛋白的浓度增加而增加，α-乳白蛋白的浓度与吸光值具有良好的线性关系，标准曲线方程为：y＝0.0016*x 0.1284，相关系数r2＝0.9956，检测限为0.01ng/ml。
特异性是免疫传感器的一项重要性能，为了验证免疫传感器对α-乳白蛋白的特异性，选择了牛血清白蛋白bsa、κ-酪蛋白、α-酪蛋白、小麦蛋白、大豆蛋白、鸡蛋蛋白、花生蛋白作为干扰物，图5表明免疫传感器对α-乳白蛋白良好的特异性。
实施例4：
本实施例提供了上述基于具有类漆酶活性的纳米酶免疫传感器用于牛乳中α-乳白蛋白的检测步骤。
第一步：类漆酶活性纳米酶的合成
将1ml0.24mol/l的氯化铜的水溶液、2ml0.12mol/l的谷胱甘肽水溶液、4mln，n二甲基甲酰胺混合在室温下搅拌5分钟转移至10ml的不锈钢反应釜中；然后，把不锈钢反应釜放置在烘箱中在140℃条件下加热4.5小时，冷却至室温；合成的纳米酶在10000r，5min的条件下离心收集，用n，n二甲基甲酰胺和去离子水洗3次去除残留试剂；最后将制备的纳米酶在45℃条件下真空干燥。
第二步：纳米酶@ab2复合物的制备
将2mgedc和2mgnhs溶解于2ml纳米酶(1mg/ml)，涡旋溶解并混合均匀，接着在37℃频率200r的振荡器上孵育30min，离心水洗2次去除多余的edc和nhs；将功能化的纳米酶重新分散到2mlpbs(10mm，ph7.2)的缓冲液中；加入200μg/mlab2，在37℃，200r条件下震荡1h；然后，加入1％bsa阻断结合位点，洗涤2～3次；离心后再次分散到pbs中备用。
第三步：96孔板的包被和结合位点阻断
①ab1包被：用碳酸盐缓冲液(5mm,ph9.6)稀释的ab1加入96孔板，每孔200μl，使用保鲜膜密封在4℃条件下过夜；包被结束后，用洗涤液(pbst，ph7.2)洗涤3次，每次3min，垂直甩干板内洗涤液。
②封闭：用pbs缓冲液将bsa配为1g/100ml，每孔100μl加入酶标板，37℃温育1h，倾倒后用pbst洗涤4次，每次3min，垂直甩干板内洗涤液。
第四步：基于纳米酶的免疫传感器的构建
免疫反应：把稀释处理的牛乳样品加入ab1包被的96孔板，每孔200μl，设立3个平行；在37℃温育1h，倾倒用pbst洗涤3次，每次3min，垂直甩干板内洗涤液。
加入纳米酶标记的ab2：把纳米酶标记的ab2加入96孔板，每孔200μl，在37℃温育1h，倾倒用pbst洗涤3次，每次3min，垂直甩干板内洗涤液。
比色反应：在96孔板中加入100μlmes缓冲液(30mm,ph6.8)，然后再分别加入2，4-二氯苯酚与4-氨基安替比林各75μl，在65℃孵育30min，取出。
读数，用酶标仪测量各孔中510nm处的吸光度。
经测定，生牛乳中α-乳白蛋白的含量为1.13mg/ml，与现有的文献报道基本一致。
本实施例进一步验证了，本发明制备的基于纳米酶的免疫传感器在检测牛乳中α-乳白蛋白时的高灵敏性，并且操作步骤简单、方便，可普遍用于牛乳过敏蛋白的检测中。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
1.一种具有类漆酶活性的纳米酶的制备方法，其特征在于，按照以下步骤进行：
s101：将氯化铜的水溶液、谷胱甘肽水溶液、n，n二甲基甲酰胺以体积比为1：2：4ml的比例在室温下混合搅拌均匀后，转移至不锈钢反应釜中；
s102：将所述不锈钢反应釜放置在烘箱中加热，然后冷却至室温，反应合成纳米酶；
s103：将所述合成的纳米酶进行离心收集，并用n，n二甲基甲酰胺和去离子水洗数次去除残留试剂，最后将其真空干燥，得到具有类漆酶活性的纳米酶。
2.根据权利要求1所述的一种具有类漆酶活性的纳米酶的制备方法，其特征在于，所述步骤s102中，在烘箱中140℃加热4.5h；所述步骤s103中，合成的纳米酶在10000r5min的条件下离心收集；真空干燥的温度为45℃。
3.一种具有类漆酶活性的纳米酶，其特征在于，由权利要求1或2所述的制备方法制备而成。
4.一种具有类漆酶活性的纳米酶的应用，其特征在于，将其用于制作纳米酶免疫传感器，并将所述纳米酶免疫传感器应用于检测牛乳过敏蛋白。
5.根据权利要求4所述的一种具有类漆酶活性的纳米酶的应用，其特征在于，所述牛乳过敏蛋白为α-乳白蛋白。
6.根据权利要求4所述的一种具有类漆酶活性的纳米酶的应用，其特征在于，所述纳米酶免疫传感器的制备方法如下：
s201：用ab1包被96孔板；
s202：用ab2修饰具有类漆酶活性的纳米酶，制备纳米酶免疫传感器的免疫检测标签；
s203：采用2，4-二氯苯酚与4-氨基安替比林作为显色底物，构建基于具有类漆酶活性的纳米酶免疫传感器。
7.根据权利要求6所述的一种具有类漆酶活性的纳米酶的应用，其特征在于，将所述基于纳米酶免疫传感器应用于检测α-乳白蛋白时包含以下步骤：
s301：包被；用ab1包被96孔板，洗涤后用bsa封闭；
s302：免疫反应；将不同已知浓度的α-乳白蛋白样品加入到ab1包被的96孔板，并进行温育、洗涤、甩干；
s303：修饰免疫酶标签；将纳米酶标记的ab2加入96孔板，并进行温育、洗涤、甩干；
s304：显色反应；在96孔板中加入mes缓冲液，然后再分别加入2，4-二氯苯酚与4-氨基安替比林，通过氧化偶联反应产生红色产物，在25～95℃孵育10～60min后取出；
s305：读数测定，用酶标仪测量96孔板各孔中510nm波长处的吸光值，并根据不同已知浓度的α-乳白蛋白样品的吸光值，建立标准曲线，根据标准曲线测定未知浓度的α-乳白蛋白样品浓度。
8.据权利要求7所述的一种具有类漆酶活性的纳米酶的应用，其特征在于，
所述步骤s301中，ab1的浓度为10μg/ml；
所述步骤s302和s303中，温育、洗涤、甩干的条件均为在37℃温育1h，倾倒用pbst洗涤3次，每次3min，垂直甩干板内洗涤液；
所述步骤s304中，显色反应时反应体系的ph值为6.8，孵育温度为65℃，时间为30min。
技术总结