本发明属于生物医用材料领域，特别涉及一种改性生物基止血复合胶原海绵及其制备方法与应用。
背景技术：
1、胶原蛋白又称胶原(collagen)，是鱼皮中含量最丰富、分布最广的一种糖蛋白，由于其特殊的右手三螺旋结构受到广泛关注。在食品和医疗领域有着广泛的应用，尤其在组织工程方面，由于其具有良好的生物相容性、低抗原性和可降解性，能够促进细胞增殖等优势，多应用于皮肤伤口愈合、骨和软骨组织工程、血管和神经再生等诸多方面。胶原在止血领域的具体应用常作为止血材料的敷料或海绵主体，其三维网状结构及生物特性可以起到诱导血小板聚集和释放反应的作用，还可以激活凝血因子，进而起到止血的作用。因此胶原常用于止血材料。
2、辐射加工技术是指将电子加速器产生的电子线(β射线)或放射性同位素(cs-137或co-60)产生的γ射线的能量转移给被辐照物质，而使被辐照物质的物理性能和化学组成发生变化并能使其产生良好的物化性质或成为人们所需要的一种新的物质。比如，使高分子材料分别实现接枝、聚合、裂变或交联，抑制或刺激生物生长，有效地杀灭害虫、虫卵、病菌等。辐照加工属于冷加工，低能耗，不需添加化学试剂的物理加工过程，不存在药物残留问题。目前辐照技术已经应用在食品辐照保藏、医疗用品辐射灭菌、辐射化工、三废治理等领域。但在生物基医疗材料改性等方面的应用却鲜有报道。
3、目前来源于哺乳动物的胶原蛋白海绵制备工艺较为繁琐，且成本高昂，常常需要通过京尼平、戊二醛、甲醛、碳化二亚胺、改性戊二醛等交联剂交联胶原进行胶原蛋白海绵的制备。但这可能存在化学试剂的残留，易被患者通过伤口吸收，产生致敏反应从而导致出血伤口的恶化。另外，使用交联剂交联的止血海绵具有不能有效抵御细菌感染和引发其它并发症的风险，降解性也较差。因此开发一款无化学试剂残留不会为患者带来二次伤害，且能够提高出血伤口止血效果，降低创面感染几率，具备失血量低、止血速度快的止血材料显得尤为重要。
技术实现思路
1、基于背景技术所述，本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供了一种改性生物基止血复合胶原海绵的制备方法。
2、本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的改性生物基止血复合胶原海绵。本发明制备的止血复合胶原海绵采用非热处理的辐照工艺，将提取的渔源胶原蛋白、壳聚糖类成分、淀粉、维生素及甘油等成分交联聚合而成，制成的止血复合胶原海绵具有多孔且均匀致密性、热变性温度高、止血性能强等特点，制备方法能耗低，生产成本低，对环境友好，具有很好的应用前景。
3、本发明的再一目的在于提供上述改性生物基止血复合胶原海绵的应用。
4、为实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：一种改性生物基止血复合胶原海绵的制备方法，包括以下步骤：
5、(1)预处理：将渔业原料用碱溶液处理，以去除色素及非蛋白成分；再用正丁醇溶液处理，以去除脂肪；
6、(2)酶解：
7、a、将步骤(1)得到的处理后的渔业原料，用蛋白酶进行酶解，酶解后进行固液分离；
8、b、将步骤a得到的上清液进行盐析，固液分离，将得到的沉淀复溶，透析，得到胶原蛋白溶液；
9、(3)复合原液的制备：
10、a、将壳聚糖类成分和淀粉溶于酸溶液，得到多糖溶液；
11、b、将步骤(2)得到的胶原蛋白溶液与上述步骤a得到的多糖溶液混合均匀，得到混合液a；
12、c、将混合液a和维生素、甘油混合均匀，得到复合原液；
13、(4)辐照：将步骤(3)得到的复合原液预冷至2～8℃并静置3～5h，再进行辐照，得到改性生物基复合材料母液；
14、(5)定型：将步骤(4)得到的改性生物基复合材料母液倒入模具，预冻，真空冷冻干燥，得到改性止血复合胶原海绵。
15、步骤(1)中所述的渔业原料包括鱼皮、鱼鳞、鱼骨、虾蟹壳等；优选为鱼皮；更优选为罗非鱼皮。
16、步骤(1)中所述的碱溶液优选为含有吐温的naoh溶液，其中，吐温的浓度为体积百分比0.3％～0.5％，优选为体积百分比0.5％；naoh的浓度为0.1～0.25mol/l，优选为0.15mol/l。
17、步骤(1)中所述的用碱溶液处理的具体步骤优选如下：将渔业原料和碱溶液按料液比1g：30～50ml混合，搅拌6～10h并每3～5h更换一次溶液；更优选如下：将渔业原料和碱溶液按料液比1g：40ml混合，搅拌8h并每4h更换一次溶液。
18、步骤(1)中所述的正丁醇溶液的浓度优选为体积百分比8～12％；更优选为体积百分比10％。
19、步骤(1)中所述的用正丁醇溶液处理的具体步骤优选如下：将碱溶液处理后得到的渔业原料和正丁醇溶液按料液比1g：20～40ml混合，搅拌6～10h并每3～5h更换一次溶液；更优选如下：将碱溶液处理后得到的渔业原料和正丁醇溶液按料液比1g：30ml混合，搅拌8h并每4h更换一次溶液。
20、步骤(2)a中所述的蛋白酶优选为酸性蛋白酶。
21、步骤(2)a中所述的酶解的体系如下：溶剂为体积分数为1～4％的乙酸溶液，蛋白酶1000～1200u/ml，步骤(1)得到的处理后的渔业原料的用量按其与溶剂的固液比为1g：40～60ml计算。
22、步骤(2)a中所述的酶解的条件优选为先于2～8℃、300～400rpm搅拌48～60h；再于室温300～400rpm搅拌7～9h。
23、所述的室温指的是15～35℃；优选为20～30℃；更优选为24～27℃。
24、步骤(2)a中所述的固液分离的方式优选为离心。
25、所述的离心的条件优选为于4℃、8000～10000rpm的转速离心10～12min。
26、步骤(2)b中所述的盐析是在上清液中加入氯化钠进行；其中，氯化钠的终浓度为1.5～2.6mol/l。
27、步骤(2)b中所述的固液分离的方式优选为离心。
28、所述的离心的条件优选为于4℃、8000～10000rpm的转速离心10～12min。
29、步骤(2)b中所述的复溶的溶剂优选为体积分数是1～4％的乙酸溶液。
30、步骤(2)b中所述的透析中的透析袋优选为分子量为8-14kda的透析袋。
31、步骤(2)b中所述的透析中的透析液优选为蒸馏水。
32、步骤(2)b中所述的透析的次数优选为3～6次，每次4～6h。
33、步骤(3)a中所述的壳聚糖类成分优选为壳聚糖、羧甲基壳聚糖和羟乙基壳聚糖中的至少一种。
34、步骤(3)a中所述的淀粉为可溶性淀粉，包括玉米淀粉、小麦淀粉、马铃薯淀粉、红薯淀粉等。
35、步骤(3)a中所述的酸溶液优选体积百分比1～4％的乙酸溶液。
36、步骤(3)b中所述的混合的条件优选为于200～400rpm搅拌1～2h；更优选为于250～350rpm搅拌1～2h。
37、步骤(3)b中所述的混合液a中胶原蛋白的浓度为4～7mg/ml，胶原蛋白、壳聚糖类成分和淀粉按质量比5：2.8～3.3：1～1.5；优选地，胶原蛋白的浓度为4.5～6.5mg/ml，胶原蛋白、壳聚糖类成分和淀粉按质量比5：2.8～3.3：1～1.5。
38、步骤(3)c中所述的维生素优选为l-抗坏血酸。
39、步骤(3)c中所述的维生素的质量添加量(g)优选为混合液a体积(ml)的0.5～0.8％。
40、步骤(3)c中所述的甘油的体积添加量优选为混合液a体积的0.5～1％。
41、步骤(3)c中所述的混合的条件优选为于200～400rpm搅拌1～2h；更优选为于300～400rpm搅拌1～2h。
42、步骤(4)中所述的辐照中的辐照方式优选为钴60-γ、铯137-γ射线辐照或电子束辐照。
43、步骤(4)中所述的辐照的条件优选为：辐照剂量为1.5～3.0kgy，辐照剂量速率为0.6～1.2kgy/h。
44、步骤(5)中所述的预冻的条件优选为于-18～-20℃预冻10～12h。
45、步骤(5)中所述的真空冷冻干燥的条件优选为于-50～-65℃真空冷冻干燥36～48h。
46、一种改性生物基止血复合胶原海绵，通过上述制备方法得到。
47、上述改性生物基止血复合胶原海绵在止血方面的应用。
48、本发明的有益效果：
49、(1)本发明提供了渔业源的胶原蛋白的提取过程，为渔源胶原蛋白的利用提供了方向。
50、(2)本发明通过辐照技术对止血材料的成分进行交联、聚合及接枝，替换了通过京尼平、碳化二亚胺(edc)、n-羟基丁二酰亚胺(nhs)、叠氮磷酸二苯酯(dppa)等交联剂交联胶原的方式，避免了止血材料中化学试剂残留的可能，从而降低了伤者二次伤害的风险。通过本发明的实验结果可知，与现有化学试剂交联技术相比，本发明由于采用天然三螺旋结构的胶原蛋白和壳聚糖等成分，通过辐照技术交联形成的生物基改性止血材料，具有止血快速、出血量低、与生物组织黏性好等特点。胶原蛋白独特的三螺旋结构，与带有负电荷的壳聚糖等成分，经过辐照交联后形成三维网状结构，形成了可以快速止血的多孔胶原海绵；该快速止血海绵，可以快速吸收血液中的液体成分，网状结构迅速锁住红细胞等成分，提高凝血因子浓度，引起红细胞聚集，提高血小板活性，进而快速止血。另一方面，止血材料还加入了可溶性淀粉、抗坏血酸等止血因子，经过辐照交联，这些止血因子紧紧接枝在胶原蛋白和壳聚糖上，使止血海绵具有优秀的吸收液体的能力，而且由于淀粉的加入，使得止血海绵能快速粘附与伤口，无需特别重的压迫，也能达到快速止血的目标。
51、(3)本发明制成的止血胶原海绵结构稳定均一，止血效果好，制备方法操作简单，能耗低，生产成本低，对环境友好，具有很好的应用前景。
1.一种改性生物基止血复合胶原海绵的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的改性生物基止血复合胶原海绵的制备方法，其特征在于：
3.根据权利要求2所述的改性生物基止血复合胶原海绵的制备方法，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的改性生物基止血复合胶原海绵的制备方法，其特征在于：
5.根据权利要求4所述的改性生物基止血复合胶原海绵的制备方法，其特征在于：
6.根据权利要求1所述的改性生物基止血复合胶原海绵的制备方法，其特征在于：
7.根据权利要求6所述的改性生物基止血复合胶原海绵的制备方法，其特征在于：
8.根据权利要求1所述的改性生物基止血复合胶原海绵的制备方法，其特征在于：
9.一种改性生物基止血复合胶原海绵，其特征在于：通过权利要求1～8任一项所述的制备方法得到。
10.权利要求9所述的改性生物基止血复合胶原海绵在止血方面的应用。
