本发明涉及遗传修饰的自然杀伤(nk)细胞及其制造方法。具体地，本发明涉及car-nk细胞、制造这些car-nk细胞的方法以及这些car-nk细胞在医学中、特别是用于治疗癌症中的用途。
背景技术：
1、自然杀伤(natural killer nk)细胞是人体免疫细胞家族中的重要成员，是人体免疫系统的第一道防线，在人体的抗肿瘤免疫中发挥着重要的免疫监视和免疫清除作用。在过去的10多年时间里，国际上开展了多项回输nk细胞治疗血液瘤和实体瘤的临床研究，初步证明了nk细胞的有效性和安全性。nk细胞在抗肿瘤领域扮演着重要的角色，car技术的发展也催生了car-nk的诞生。经过car结构修饰后的nk细胞，理论上也能够高效的识别肿瘤细胞，并通过释放杀伤介质、诱导靶细胞凋亡等多种手段杀伤肿瘤细胞。但相对于car-t，由于nk细胞的天然特性，car-nk的治疗过程中不会产生严重的细胞因子风暴，因此在临床使用中，安全性可能较car-t更高。其次，由于nk细胞在体内的存活时间较t细胞更短，导致car-nk在体内的存活时间较car-t更短。这一特性或许会导致car-nk细胞疗效不如car-t，但是从安全性的角度来说，这种特性反而避免了经过基因修饰的免疫细胞长期存在于人体可能导致的一系列未知的风险。
2、研究表明在nk细胞中过表达外源的car分子可以增强nk细胞的肿瘤靶向能力和杀伤能力。国际上也开展了多项回输car-nk细胞治疗血液瘤和实体瘤的临床试验，这些临床试验所使用car结构主要可分为两大类，其中一类car结构是原本为t细胞激活设计的，并不完全适合nk细胞激活，不能最大程度增强nk细胞功能。另一类则是为nk细胞激活量身设计的，但是这一类car结构种类较少。
3、有鉴于此，本领域亟需更多的可用于car nk细胞制备的car结构设计。
技术实现思路
1、本发明的一个方面提供嵌合抗原受体，依次包含抗原结合域、铰链域、跨膜域、共刺激域和信号传导域，其中铰链域包含或为4-1bb铰链域，所述跨膜域选自nkg2d、kir2ds1、cd3ζ、cd28、2b4、nkp44和nkp30跨膜域，所述共刺激域选自2b4、dap12、4-1bb、ntb-a和cd2共刺激域，所述信号传导域包含或为cd3ζ信号传导域。
2、在一些实施方式中，本发明提供嵌合抗原受体，其中所述铰链域包含或为4-1bb铰链域，所述跨膜域选自nkg2d、cd3ζ、2b4、nkp44跨膜域，所述共刺激域选自2b4、dap12、4-1bb和ntb-a共刺激域，所述信号传导域为cd3ζ信号传导域。
3、在一些实施方式中，本发明提供的所述嵌合抗原受体的[铰链域]-[跨膜域]-[共刺激域]-[信号传导域]的结构选自以下结构式中的任何一种，其中[]表示结构域，]-[表示结构域之间的连接，优选为键或肽接头，例如由甘氨酸和丝氨酸组成的肽接头：
4、(a)[4-1bb]-[nkg2d]-[2b4]-[cd3ζ]
5、(b)[4-1bb-kir2ds1]-[kir2ds1]-[2b4]-[cd3ζ]
6、(c)[4-1bb]-[cd3ζ]-[2b4]-[cd3ζ]
7、(d)[4-1bb]-[cd28]-[2b4]-[cd3ζ]
8、(e)[4-1bb]-[2b4]-[2b4]-[cd3ζ]
9、(f)[4-1bb]-[nkp44]-[2b4]-[cd3ζ]
10、(g)[4-1bb]-[nkp30]-[2b4]-[cd3ζ]
11、(h)[4-1bb]-[nkg2d]-[dap12]-[cd3ζ]
12、(i)[4-1bb]-[nkg2d]-[4-1bb]-[cd3ζ]
13、(j)[4-1bb]-[nkg2d]-[ntb-a]-[cd3ζ]，以及
14、(k)[4-1bb-kir2ds1]-[kir2ds1]-[cd2]-[cd3ζ]。
15、在一些实施方式中，在本发明提供的所述嵌合抗原受体中，所述抗原结合域为结合至肿瘤特异性抗原或肿瘤相关性抗原的结构域，优选为对应抗原的抗体的抗原结合片段，优选为scfv或vhh，优选地所述肿瘤特异性抗原或肿瘤相关性抗原选自her2、psma、bcma、cd20、cd33、cd19、cd22、cd123、cd30、gpc-3、cea、claudin18.2、epcam、gd2、msln、egfr、muc1、egfrviii、cd38、trop-2、c-met、nectin-4、cd79b、cck4、gpa33、hla-a2、clec12a、p-cadherin、tdo2、mart-1、pmel 17、mage-1、afp、ca125、trp-1、trp-2、ny-eso、psa、cdk4、bca225、ca125、mg7-ag、ny-co-1、rcas1、sdccag16、taal6和tag72；优选地，所述抗原结合域结合her2抗原；优选地，所述抗原结合域为抗her2 scfv，优选包含或为seq idno.19所示的氨基酸序列。
16、在一些实施方式中，在本发明提供的所述嵌合抗原受体中，所述抗原结合域在其n端进一步包含信号肽，优选地所述信号肽为cd8α的信号肽，优选地包含或为seq id no.20所示的氨基酸序列。
17、在一些实施方式中，在本发明提供的所述嵌合抗原受体中：
18、(a)4-1bb铰链域包含或为seq id no.1所示的氨基酸序列或与seq id no.1所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
19、(b)4-1bb-kir2ds1铰链域包含或为seq id no.2所示的氨基酸序列或与seq idno.2所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
20、(c)nkg2d跨膜域包含或为seq id no.5所示的氨基酸序列或与seq id no.5所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
21、(d)kir2ds1跨膜域包含或为seq id no.6所示的氨基酸序列或与seq id no.6所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
22、(e)cd3ζ跨膜域包含或为seq id no.7所示的氨基酸序列或与seq id no.7所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
23、(f)cd28跨膜域包含或为seq id no.8所示的氨基酸序列或与seq id no.8所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
24、(g)2b4跨膜域包含或为seq id no.9所示的氨基酸序列或与seq id no.9所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
25、(i)nkp44跨膜域包含或为seq id no.10所示的氨基酸序列或与seq id no.10所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
26、(j)nkp34跨膜域包含或为seq id no.11所示的氨基酸序列或与seq id no.11所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
27、(k)2b4共刺激域包含或为seq id no.13所示的氨基酸序列或与seq id no.13所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
28、(l)dap12共刺激域包含或为seq id no.14所示的氨基酸序列或与seq id no.14所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
29、(m)4-1bb共刺激域包含或为seq id no.15所示的氨基酸序列或与seq id no.15所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
30、(n)ntb-a共刺激域包含或为seq id no.16所示的氨基酸序列或与seq id no.16所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；
31、(o)cd2共刺激域包含或为seq id no.17所示的氨基酸序列或与seq id no.17所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和/或
32、(p)cd3ζ信号传导域包含或为seq id no.18所示的氨基酸序列或与seq id no.18所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
33、在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体的[铰链域]-[跨膜域]-[共刺激域]-[信号传导域]包含或为如seq id no.49至59任一项所示的氨基酸序列或与seq id no.49至59任一项所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
34、在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含或为如seq id no.22至32任一项所示的氨基酸序列或与seq id no.22至32任一项所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
35、在另一个方面，本发明提供一种工程化的nk细胞，其被改造以在细胞表面上表达嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体为本发明提供的任一种所述的嵌合抗原受体。在一些实施方式中，所述nk细胞例如是诱导多能干细胞分化产生的nk细胞、是来源于外周血或脐血的nk细胞或nk92细胞系。
36、在另一个方面，本发明提供工程化的nk细胞群，其包含本发明所提供的工程化的nk细胞；优选地，所述细胞群包含1x105至1x107个细胞。
37、本发明还提供编码本发明的任一项所述的嵌合抗原受体的多核苷酸。在一些实施方式中，所述多核苷酸的序列选自seq id no.30至42中的任一项。
38、在另一个方面，本发明提供一种载体，其包含本发明提供的多核苷酸；优选地，所述载体是病毒载体，优选为逆转录病毒或腺相关病毒载体；优选地所述载体包含表达调控序列，包括启动子。
39、本发明还提供制备工程化的nk细胞的方法，包括使用本发明提供的病毒载体转染nk细胞，使所述多核苷酸在所述nk细胞中表达，从而在细胞表面上表达本发明所述的嵌合抗原受体；所述nk细胞例如是诱导多能干细胞分化产生的nk细胞、是来源于外周血或脐血的nk细胞或nk92细胞系。
40、本发明还提供制备工程化的nk细胞的方法，包括使用本发明提供的病毒载体转染诱导多能干细胞ipsc，并且诱导分化ipsc为nk细胞，所述nk细胞的表面上表达本发明所述的嵌合抗原受体。
1.嵌合抗原受体，依次包含抗原结合域、铰链域、跨膜域、共刺激域和信号传导域，其中铰链域包含或为4-1bb铰链域，所述跨膜域选自nkg2d、kir2ds1、cd3ζ、cd28、2b4、nkp44和nkp30跨膜域，所述共刺激域选自2b4、dap12、4-1bb、ntb-a和cd2共刺激域，所述信号传导域包含或为cd3ζ信号传导域。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述铰链域包含或为4-1bb铰链域，所述跨膜域选自nkg2d、cd3ζ、2b4、nkp44跨膜域，所述共刺激域选自2b4、dap12、4-1bb和ntb-a共刺激域，所述信号传导域为cd3ζ信号传导域。
3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体的[铰链域]-[跨膜域]-[共刺激域]-[信号传导域]的结构选自以下结构式中的任何一种，其中[]表示结构域，]-[表示结构域之间的连接，优选为键或肽接头，例如由甘氨酸和丝氨酸组成的肽接头：
4.根据权利要求1至3任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述抗原结合域为结合至肿瘤特异性抗原或肿瘤相关性抗原的结构域，优选为对应抗原的抗体的抗原结合片段，优选为scfv或vhh，优选地所述肿瘤特异性抗原或肿瘤相关性抗原选自her2、psma、bcma、cd20、cd33、cd19、cd22、cd123、cd30、gpc-3、cea、claudin18.2、epcam、gd2、msln、egfr、muc1、egfrviii、cd38、trop-2、c-met、nectin-4、cd79b、cck4、gpa33、hla-a2、clec12a、p-cadherin、tdo2、mart-1、pmel 17、mage-1、afp、ca125、trp-1、trp-2、ny-eso、psa、cdk4、bca225、ca125、mg7-ag、ny-co-1、rcas1、sdccag16、taal6和tag72；优选地，所述抗原结合域结合her2抗原；优选地，所述抗原结合域为抗her2 scfv，优选包含或为seq id no.19所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至4任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述抗原结合域在其n端进一步包含信号肽，优选地所述信号肽为cd8α的信号肽，优选地包含或为seq id no.20所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求1至5任一项所述的嵌合抗原受体，其中：
7.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体的[铰链域]-[跨膜域]-[共刺激域]-[信号传导域]包含或为如seq id no.49至59任一项所示的氨基酸序列或与seq id no.49至59任一项所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
8.根据权利要求1至6任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体包含或为如seq id no.22至32任一项所示的氨基酸序列或与seq id no.22至32任一项所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
9.一种工程化的nk细胞，其被改造以在细胞表面上表达嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体为权利要求1至8任一项所述的嵌合抗原受体；所述nk细胞例如是诱导多能干细胞分化产生的nk细胞、是来源于外周血或脐血的nk细胞或nk92细胞系。
10.工程化的nk细胞群，其包含权利要求9所述的工程化的nk细胞；优选地，所述细胞群包含1x105至1x107个细胞。
11.编码权利要求1至8任一项所述的嵌合抗原受体的多核苷酸。
12.根据权利要求11所述的多核苷酸，其序列选自seq id no.36至46中的任一项。
13.一种载体，其包含权利要求11或12所述的多核苷酸；优选地，所述载体是病毒载体，优选为逆转录病毒或腺相关病毒载体；优选地所述载体包含表达调控序列，包括启动子。
14.一种制备工程化的nk细胞的方法，包括使用权利要求13所述的病毒载体转染nk细胞，使所述多核苷酸在所述nk细胞中表达，从而在细胞表面上表达权利要求1至8任一项所述的嵌合抗原受体；所述nk细胞例如是诱导多能干细胞分化产生的nk细胞、是来源于外周血或脐血的nk细胞或nk92细胞系。
15.一种制备工程化的nk细胞的方法，包括使用权利要求13所述的病毒载体转染诱导多能干细胞ipsc，并且诱导分化ipsc为nk细胞，所述nk细胞的表面上表达权利要求1至8任一项所述的嵌合抗原受体。
