本发明属于疫苗，特别涉及一种淋病奈瑟菌联合疫苗及其制备方法和应用。
背景技术：
1、淋病奈瑟菌(neisseria gonorrhoeae)是导致淋病的病原体，该疾病在我国属于乙类传染病。据估计，全球每年约有8700万新增淋病感染病例。淋病奈瑟菌可引起人类生殖道以及直肠、咽部和眼睛的感染，下生殖道感染可从无症状到更具侵袭性的上行感染。对于女性来说，这种情况尤其严重，可能导致盆腔炎(pid)、宫外孕和不孕。此外，淋病奈瑟菌感染会增加感染和传播艾滋病病毒的风险。目前，头孢曲松是我们抗击淋病的最后一道防线，随着近年来耐药菌株的不断出现，耐头孢曲松的高水平fc428克隆菌株已在全球范围内传播，这使未来以头孢曲松为基础的治疗变得复杂化。
2、疫苗接种被认为是控制传染病的最佳长期战略，疫苗开发可能是控制淋病的唯一长期、可持续的手段。近来基于基因组学、蛋白质组学、生物信息学为基础的疫苗靶点筛选方法的发展，一些有潜力的淋病奈瑟菌疫苗靶点被筛选和鉴定。但目前市场上仍无可批准使用的淋病疫苗，其主要原因是由于淋病奈瑟菌的表面分子存在高频率的抗原变异，单一蛋白抗原靶点随之产生的易耐药性使得淋病疫苗均未能取得良好的免疫保护效果。研究发现多种抗原靶点联合使用可提供更广泛的保护性免疫，避免了抗原类型过于单一，难以激发较全面有效的保护性免疫应答的情况，并且目前淋病奈瑟菌疫苗研究中尚无相关多联蛋白疫苗的报道。
技术实现思路
1、本发明意在提供一种淋病奈瑟菌联合疫苗的制备方法，以提高针对淋病奈瑟菌感染的免疫保护效果。
2、本方案中的一种淋病奈瑟菌联合疫苗的制备方法，包括以下步骤：
3、步骤一、以淋病奈瑟菌fa1090标准菌株的基因组dna为模板，使用上游引物和下游引物，通过pcr扩增ngo2105蛋白的passenger结构域序列、ngo1958基因的全长序列及ngo2139基因的截短序列，得到对应的pcr扩增产物passenger、nhba及metq；
4、步骤二、将pcr扩增产物与表达载体pcold tf质粒定向重组，构建重组质粒pcoldtf-passenger、pcold tf-nhba及pcold tf-metq；使用hind iii和xba i对重组质粒进行双酶切验证，酶切产物经电泳鉴定可见与目的基因大小相符的酶切片段，核酸序列测序结果分别与genbank数据库中淋病奈瑟菌fa1090标准菌株ngo2105蛋白的passenger结构域序列、ngo1958基因的全长序列及ngo2139基因的的截短序列相符；基因片段的扩增引物如下表所示：
5、
6、上表中，下划线部分分别是hind iii和xba i的内切酶部分；
7、步骤三、将重组质粒pcold tf-passenger、pcold tf-nhba及pcold tf-metq转入e.coli bl21表达菌株中；获得pcold tf-passenger-e.coli bl21、pcold tf-nhba-e.colibl21以及pcold tf-metq-e.coli bl21蛋白表达菌株；
8、步骤四、将pcold tf-passenger-e.coli bl21、pcold tf-nhba-e.coli bl21以及pcold tf-metq-e.coli bl21蛋白表达菌株增菌培养至吸光度(a600nm)为0.6～0.8后加入终浓度为0.05～2mmol/l的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)诱导，15℃，90～120rpm诱导10～12h，收集菌体超声破菌，上清液经(ni-nta)亲和层析柱纯化，得到纯化后的ngo2105passenger、nhba(ngo1958)以及metq(ngo2139)三种蛋白；
9、步骤五、将纯化后的三种蛋白混合均匀得到联合蛋白，将联合蛋白与ctb疫苗佐剂充分混匀，得到淋病奈瑟菌联合疫苗。
10、进一步，采用热激法将重组质粒转入e.coli bl21表达菌株。
11、进一步，所述联合蛋白与ctb疫苗佐剂的浓度比为1～3：1。
12、由上述制备方法获得的淋病奈瑟菌联合疫苗。
13、淋病奈瑟菌联合疫苗在制备淋病奈瑟菌防治性药物中的应用。
14、申请人通过验证发现，本申请制得的淋病奈瑟菌联合疫苗针对淋病奈瑟菌感染具有良好的免疫保护效果，可用于淋病奈瑟菌免疫效力评价。
1.一种淋病奈瑟菌联合疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种淋病奈瑟菌联合疫苗的制备方法，其特征在于：采用热激法将重组质粒转入e.coli bl21表达菌株。
3.根据权利要求2所述的一种淋病奈瑟菌联合疫苗的制备方法，其特征在于：所述联合蛋白与ctb疫苗佐剂的浓度比为1～3：1。
4.一种淋病奈瑟菌联合疫苗，其特征在于：由权利要求1～3任一项所述的淋病奈瑟菌联合疫苗的制备方法制得。
5.权利要求4所述的一种淋病奈瑟菌联合疫苗在制备淋病奈瑟菌防治性药物中的应用。
6.权利要求4所述的一种淋病奈瑟菌联合疫苗在淋病奈瑟菌免疫效力评价中的应用。
