本发明属于分子生物学，涉及核酸扩增方法，具体涉及一种加速环介导等温扩增的turn-back环引物及由此建立的一种新的超快速环介导等温扩增方法。
背景技术：
1、分子检测在临床诊断、环境监测、食品安全等方面发挥着重要作用。在众多的分子检测技术中，基于核酸的检测方法因其高特异性和高灵敏度而备受推崇。其中聚合酶链式反应(pcr)是经典的扩增方法，但是其依赖于昂贵的仪器和专业的研究人员，难以进行即时诊断或检测(poct)。自1990年代初以来，等温核酸扩增技术(isothermal nucleic acidamplification,inaa)兴起，因其能够在恒温条件下高效扩增靶核酸，无需复杂的仪器，在poct中具有很大的应用潜力而逐渐受到各领域的关注。
2、在现有的inaa方法中，环介导等温扩增(lamp)是最流行的方法之一，已广泛应用于基因检测，特别是病原体引起的传染病的现场检测。lamp是在2000年由notomi等人提出的等温扩增方法，最初的lamp体系为四引物环介导等温扩增体系(four-primer lamp，四引物lamp)，使用内引物(fip、bip)、外引物(f3、b3)四种引物识别靶序列上六个不同的区域，可以将单个拷贝的dna扩增至109个拷贝(大于1h)，扩增过程可分为初始哑铃结构(dumbbell)生成阶段和循环扩增阶段。在初始哑铃结构生成阶段，内引物和外引物分别结合到目标区域(f2c、b2c)和(f3c、b3c)，通过具有链置换活性的dna聚合酶进行延伸和链置换后，产生两个哑铃状结构(附图1a中的dumbbell 1和dumbbell 2)；在循环阶段，内引物以哑铃状结构为模板，在具有链置换活性的dna聚合酶作用下生成大量长链dna扩增产物和哑铃状结构，循环往复，实现目标序列的指数累积(附图1a)。由于该四引物体系扩增时间不够快，notomi等人随后设计了环引物(loop primer，lf、lb)，建立六引物环介导等温扩增体系(six-primer lamp，六引物lamp)，该体系中，环引物能与lamp扩增产物的环区序列lfc、lbc结合，启动新的扩增路径，产生更多的扩增产物(附图1b)，大大加快lamp反应速度和灵敏度，可在一个小时内完成扩增，但尚不能满足poct(point-of-care testing)的检测需求。对此，olga gandelman等人设计了stem引物，rhett l.martineau等人设计了swarm引物，用于进一步提高检测效率，缩短检测时间，但效果并不显著，且引物设计难度大，检测体系复杂。
3、对于现有等温环介导扩增方法引物设计难度高、体系复杂，反应速度、灵敏度有待进一步改善的技术问题，本发明设计了新的turn-back环引物，建立了新的环介导等温扩增方法。
技术实现思路
1、本发明针对环介导等温扩增技术设计了一种新的环引物——turn-back环引物，并以此为基础提供了一种设计简单、扩增高效的新的环介导等温扩增方法。
2、实现以上目的的技术方案如下：
3、本发明一方面针对环介导等温扩增技术设计了一种新的环引物——turn-back环引物：该引物包括两部分，3’-端序列同传统六引物环介导等温扩增体系的环引物lf或lb，5’-端序列为一段翘起序列，分别与靶基因的f1c或b1c区域的序列相同(附图2)。
4、上述传统六引物环介导等温扩增体系包括一对外引物(f3、b3)、一对内引物(fip、bip)、一对环引物(lb、lf)。引物设计涉及靶基因的8个区域：f3(或f3c)、f2(或f2c)、lfc(或lf)、f1(或f1c)、b1c(或b1)、lb(或lbc)、b2c(或b2)、b3c(或b3)。外引物f3与靶基因的f3c区域互补；外引物b3与靶基因的b3c区域互补；内引物fip由5’端片段f1c和3’端片段f2构成，f2区域与靶基因的f2c区域互补，f1c区域与靶基因的f1c区域相同；内引物bip由5’端片段b1c和3’端片段b2构成，b2区域与靶基因的b2c区域互补，b1c区域与靶基因的b1区域相同；环引物lf与靶基因的lfc区域互补；环引物lb与靶基因的lbc区域互补(附图1b)。
5、本发明所述turn-back环引物用于取代传统六引物环介导等温扩增体系中的环引物参与环介导等温扩增，其中的lf或lb片段与环介导等温扩增产物的环上的lfc或lbc区域互补、延伸，启动区别于内引物fip或bip扩增路径的新的扩增路径，形成新的扩增模板和扩增产物。在具有链置换活性的dna聚合酶作用下，由turn-back环引物引发的扩增产物经链置换后，翘起序列f1c或b1c回折，与以f1c或b1c序列为模板合成的f1或b1片段互补形成新的茎环结构，所述新的茎环结构与基于内引物fip或bip形成的茎环结构组合形成新的哑铃结构。
6、本发明所述的turn-back环引物参与环介导等温扩增体系后，可在内引物形成的两种哑铃结构、一个扩增循环基础上，新增最多六种哑铃结构、最多三个扩增循环，加速环介导等温扩增。
7、本发明另一方面提供了一种基于turn-back环引物超快速的环介导等温扩增方法(tlamp)，其技术方案为：用上述turn-back环引物取代传统六引物环介导等温扩增体系中的环引物参与环介导等温扩增。针对待扩增靶序列设计内引物(fip、bip)、外引物(f3、b3)和turn-back环引物(tlf、tlb)，在具有链置换活性的dna聚合酶作用下对靶序列进行扩增。首先，外引物结合到目标区域f3c、b3c，内引物结合到目标区域f2c、b2c，通过具有链置换活性的dna聚合酶进行延伸，经过两轮退火和延伸后，产生两种哑铃状结构(dumbbell1和dumbbell 2)，进而形成第一个扩增循环cycle 1，这一阶段与传统六引物环介导等温扩增体系一致；随后，turn-back环引物与基于dumbbell 1和dumbbell 2产生的扩增产物的环区结合，启动区别于内引物fip或bip扩增路径的新的扩增路径，形成新的扩增模板和扩增产物。在具有链置换活性的dna聚合酶作用下，由turn-back环引物引发的扩增产物经链置换后，翘起序列f1c或b1c回折，与以f1c或b1c序列为模板合成的f1或b1片段互补形成新的茎环结构，所述新的茎环结构与基于内引物fip或bip形成的茎环结构组合形成新的哑铃结构(dumbbell 3、dumbbell 4、dumbbell 5、dumbbell 6、dumbbell 7、dumbbell 8)，进而形成三个新的扩增循环(cycle 2、cycle 3、cycle 4)，发生与传统六引物环介导等温扩增体系基于内引物形成的哑铃结构dumbbell 1和dumbbell 2引发的类似的指数扩增(附图2)。
8、本发明所述基于turn-back环引物的新的环介导等温扩增方法所用扩增体系和反应条件同传统六引物环介导等温扩增方法。
9、本发明所述基于turn-back环引物的新的环介导等温扩增方法共有8种哑铃结构、4个扩增循环，可加速环介导等温扩增，缩短检测时间，提高检测灵敏度。
10、本发明所述的基于turn-back环引物加速的环介导等温扩增方法(tlamp)仅需要在传统六引物环介导等温扩增体系的环引物的5’-端增加一段翘起序列，引物设计简单，可有效降低体系复杂度和非特异扩增的风险。
11、本发明所述的聚合酶是一种既不具有5’-3’外切酶活性也不具有3’-5’的外切酶活性，而具有链置换活性的嗜温聚合酶。
12、如本文所用，下列词语/术语具有下列含义，除非另外说明。
13、“dna”：脱氧核糖核酸。是一类带有遗传信息的生物大分子，由4种主要的脱氧核糖核苷酸通过3’,5’-磷酸二酯键连接而成，是遗传信息的载体。
14、“pcr”：聚合酶链式反应。是体外酶促合成特异dna片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成的一个周期，循环进行，使目的dna得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
15、“靶序列”、“靶基因”：需要检测的dna序列。
16、“poct”：point-of-care testing。在采样现场进行的、利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到检测结果的一种检测方式，其含义包括“床旁检验”、“即时检验”、“现场快速检验”。
17、“dna聚合酶”：具有链置换功能的用于环介导等温扩增的dna聚合酶，包括bsm dna聚合酶、bst系列多种dna聚合酶。
18、“等温”或“等温条件”：针对所用嗜温酶的工作温度而言，可指嗜温酶工作温度范围中某一恒定的温度条件，也可指在工作温度范围内处于动态变化的温度条件。
19、本发明所公开的方法关键在于turn-back环引物的设计和应用，此方法引物设计简单、扩增反应高效，具有明显优于现有技术的优点，其主要优点包括：
20、1.新颖性。turn-back环引物仅在传统六引物环介导等温体系的环引物基础上在5’-端设计一段与靶基因的f1c或b1c区域的序列相同的序列，即可新增六种哑铃状结构，三个扩增循环，显著提高环介导等温扩增效率和检测灵敏度。
21、2.通用性。本发明所涉及的turn-back环引物及tlamp扩增方法，针对不同的模板，只需要根据本发明所述引物设计原则，结合lamp设计软件，即可合理进行引物设计，对靶基因实现超快速扩增，是一种通用的引物和扩增方法。
22、3.实用性。本发明所述引物设计简单，以此为基础的新的扩增方法在传统环介导等温扩增方法基础上进一步缩短检测时间，提高检测灵敏度，加之反应成分简单易得，在等温条件下进行，不依赖复杂控温设备，适用于几乎所有核酸模板的扩增分析，在poct领域具有很大的实用价值。
23、4.经济性。本发明中所涉及的试剂和酶，来源广泛且易于获得，成本低廉。
1.一种环介导等温扩增的turn-back环引物，其特征是：包括两段序列，3’-端序列同传统六引物环介导等温扩增方法的环引物lf或lb，分别与靶基因上的lfc或lbc区域互补，5’-端序列为一段翘起序列，分别与靶基因的f1c或b1c区域的序列相同。
2.根据权利要求1所述的传统六引物环介导等温扩增方法，其特征是：引物设计涉及靶基因的8个区域：f3(或f3c)、f2(或f2c)、lfc(或lf)、f1(或f1c)、b1c(或b1)、lb(或lbc)、b2c(或b2)、b3c(或b3)；
3.根据权利要求1所述的turn-back环引物，其特征是：turn-back环引物取代传统环介导等温扩增方法的环引物参与环介导等温扩增，其中的lf或lb片段与环介导等温扩增产物的环上的lfc或lbc区域互补、延伸，启动区别于内引物fip或bip扩增路径的新的扩增路径，形成新的扩增模板和扩增产物。
4.根据权利要求1、3所述的turn-back环引物，其特征是：turn-back环引物中的lf或lb片段与环介导等温扩增产物的环上的lfc或lbc区域互补、延伸，延伸产物经链置换后，翘起序列f1c或b1c回折，与以f1c或b1c序列为模板合成的f1或b1片段互补形成新的茎环结构，所述新的茎环结构与基于内引物fip或bip形成的茎环结构组合形成新的哑铃结构。
5.根据权利要求1、3、4所述的turn-back环引物，其特征是：turn-back环引物参与环介导等温扩增后，在内引物形成的两种哑铃结构、一个扩增循环基础上，新增最多六种哑铃结构、最多三个扩增循环，加速环介导等温扩增。
6.一种基于turn-back环引物的超快速环介导等温扩增方法，其特征是：用权利要求1、3～5所述的turn-back环引物取代传统六引物环介导等温扩增方法中的环引物的环介导等温扩增方法。
7.根据权利要求6所述的基于turn-back环引物的超快速环介导等温扩增方法，其特征是，针对待扩增靶序列设计内引物(fip、bip)、外引物(f3、b3)和turn-back环引物(tlf、tlb)，在具有链置换活性的dna聚合酶作用下对靶序列进行扩增；首先，外引物结合到目标区域f3c、b3c，内引物结合到目标区域f2c、b2c，通过具有链置换活性的dna聚合酶进行延伸，经过两轮退火和延伸后，产生两种哑铃状结构，进而形成第一个扩增循环，这一阶段与传统环介导等温扩增体系一致；随后，turn-back环引物与上述哑铃结构产生的扩增产物的环区结合，启动区别于内引物fip或bip扩增路径的新的扩增路径，形成新的扩增模板和扩增产物；在具有链置换活性的dna聚合酶作用下，由turn-back环引物引发的扩增产物经链置换后，翘起序列f1c或b1c回折，与以f1c或b1c序列为模板合成的f1或b1片段互补形成新的茎环结构，所述新的茎环结构与基于内引物fip或bip形成的茎环结构组合形成六种新的哑铃结构，进而形成三个新的扩增循环，发生与传统环介导等温扩增体系基于内引物形成的两种哑铃结构引发的类似的指数扩增。
8.根据权利要求6所述的基于turn-back环引物的超快速环介导等温扩增方法，其特征是，所用扩增体系和反应条件同传统六引物环介导等温扩增方法。
