本发明属于生物医药，具体涉及基于空白脂质纳米颗粒的转染试剂、其制备方法和应用。
背景技术：
1、将外源dna插入细菌以表达所需蛋白质已成为一种常规技术，例如在大肠杆菌中合成人胰岛素，但是，由于细菌与哺乳动物(真核)细胞不同，其缺乏负责蛋白质加工和修饰(例如，糖基化，二硫键形成等)的酶和细胞器，因此在细菌中合成重组蛋白会受到多重限制，细菌无法将较大的蛋白质折叠为正确的3d结构，以确保蛋白质的生物学活性。而将有效的基因递送到真核细胞中进行表达，可以很好的解决此困境。
2、转染是一种将外来核酸送入真核细胞以改变宿主细胞遗传组成的过程，上述核酸包括脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)以及小的非编码rna，如sirna、shrna和mirna。目前，对高效的基因递送剂的需求巨大且该需求还在不断增长。
3、常用的商业化的转染试剂包括thermofisher的lipofectamine系列，如2000、3000、lipofectamine ltx、plus、rnaimax(cn106318971a、cn107057061a)；invitrogen的lipofection；doharmacon的dharmafect系列；roche的dotap；qiagen的hiperfect；gehealthcare的nanofectamine和sigmaaldrich的escort iv脂质体。
4、这些商业化转染试剂的工作原理一般为采用阳离子聚合物或阳离子脂质与核酸等阴离子物质结合，将核酸物质转运至细胞，有时还必须加入其他试剂(例如肽)作为佐剂才能进行有效转染。不仅组成复杂、阳离子材料对细胞的毒性较大，且这些试剂并非对所有细胞类型都有较好的转染，试剂对细胞类型的选择性较高，因此仍迫切需要比现有转染试剂毒性低且对各种类型的细胞普遍具有转染效果的转染试剂。
5、专利cn105143456a公开了用于转染的脂质纳米粒子，包括转染试剂组合物和阴离子大分子，所述转染试剂组合物包含：(a)一种或多种阳离子脂质或其可药用盐；(b)一种或多种中性脂质；(c)一种或多种固醇；和(d)一种或多种表面活性剂。该专利虽可实现在体外向难以转染的原代细胞以及在体内向靶细胞有效递送sirna ogn和其他阴离子大分子，但是用于转染的脂质纳米粒子需要采用特殊、复杂的混合工艺，才可制备得到合用的产品。
6、本发明提供一种转染试剂，该试剂通过脂质纳米颗粒与核酸在溶液状态下混合制备得到，组成简单，工艺简洁且重现性高。本专利所提供的转染试剂可以高效转染多种细胞且对细胞具有较低的毒性，且与市售转染试剂相比，具有更优的转染效果。
技术实现思路
1、本发明针对现有技术存在的问题，提供基于空白脂质纳米颗粒的转染试剂、其制备方法和应用。本发明的基于空白脂质纳米颗粒的转染试剂包括：(1)空白脂质纳米颗粒；(2)生物学活性成分；所述空白脂质纳米颗粒组成包括：可电离脂质、磷脂、胆固醇以及聚乙二醇缀合脂质。空白脂质纳米颗粒和转染试剂制备工艺简单，无需借助设备即可完成制备。所述转染试剂通过空白脂质纳米颗粒和核酸制备得到，可根据使用者需求灵活调整剂量，且转染效果稳定，可转染多种细胞(如293t、hela、hepg2、two3、mcf7)，细胞毒性低，转染效果好；在细胞转染中，与市售转染试剂相比，转染效果更优。
2、为实现上述目的，第一方面，本发明提供了基于空白脂质纳米颗粒的转染试剂，包括：(1)空白脂质纳米颗粒；(2)生物学活性成分；所述空白脂质纳米颗粒组成包括：5-70mol％第一可电离脂质、0-30mol％第二可电离脂质、5-50mol％磷脂、10-70mol％胆固醇以及0-15mol％聚乙二醇缀合脂质；所述转染试剂中，生物学活性成分的用量为空白脂质纳米颗粒和生物学活性成分总量的0.1％-50％(w/w)。
3、在一项优选的实施方案中，所述空白脂质纳米颗粒组成包括：10-60mol％第一可电离脂质、0-30mol％第二可电离脂质、5-30mol％磷脂、15-70mol％胆固醇以及0-10mol％聚乙二醇缀合脂质。
4、在一项优选的实施方案中，所述生物学活性成分包括核酸、多肽中的至少一种。
5、在一项优选的实施方案中，所述核酸是dna和/或rna，包括sirna、mirna、sarna、sgrna、dsrna、shrna、smrna、ssrna、mrna、circrna、snrna、crrna、incrna、snorna、pirna、pdna、ssdna、环状或线状dna、dna微环、msdna中的至少一种。
6、在一项优选的实施方案中，所述多肽选自包含2-50个氨基酸的多肽。
7、在一项优选的实施方案中，所述第一可电离脂质选自含有通式(1)的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体；
8、
9、其中，r1、r2、r3彼此独立地是h、c5-40直链或支链的烷基、c5-40直链或支链的烯基、c5-40直链或支链的炔基、含有1-3个侧链的3-6元饱和或部分不饱和环烃基、或者含有1-3个侧链的6-10元芳族基团；所述侧链独立地选自c10-30直链或支链烷基、c10-30直链或支链烯基、c10-30直链或支链炔基；条件是r1、r2、r3至多1个是h；
10、m选自-nr4r5、含有至少一个氮原子的饱和或部分不饱和3-6元杂环基、含有至少一个氮原子的6-10元杂芳基，所述的杂环基、杂芳基未被取代或被一个或多个-oh、羧基、氨基、氧代基或卤素取代；
11、r4、r5彼此独立地是h、c1-6直链或支链烷基、c2-6直链或支链烯基或者c2-6直链或支链炔基，所述的c1-6直链或支链烷基、c2-6直链或支链烯基或c2-6直链或支链炔基未被取代或被一个或多个-oh、羧基、氨基酰胺基、脒基、胍基或卤素取代；
12、g1、g2、g3彼此独立地是-o-、-s-、-nr6-、-s-s-、-c(＝o)-、-c(＝s)-、-c(＝o)o-、-ch(oh)-、-oc(＝o)-、-c(＝o)nr6-、-nr6c(＝o)-、-oc(＝o)o-、-nr6c(＝o)o-、-oc(＝o)nr6-、-nr6c(＝o)nr13-、-c(＝o)s-、-c(＝s)s-、-sc(＝s)-、-sc(＝o)-、-oc(＝o)s-、-sc(＝o)o-、-sc(＝o)s-、-os(＝o)2o-、-s(＝o)2o-、-os(＝o)2-、-s(＝o)2-、-s(＝o)2-nr6-、-nr6-s(＝o)2-、-p(＝o)(or6)o-、-op(＝o)(or6)-或-op(＝o)(or6)o-；其中各r6、r13彼此独立地选自h、羟基、c1-30直链或支链的烷基或环烷基、c2-30直链或支链的烯基；
13、l1选自-x1-或-(cr7r8)m-x1-，其中各x1独立地选自-o-、-s-、-nr14-、-s-s-、-c(＝o)-、-c(＝s)-、-c(＝o)o-、-oc(＝o)-、-c(＝o)nr14-、-nr14c(＝o)-、-oc(＝o)o-、-nr14c(＝o)o-、-oc(＝o)nr14-、-nr14c(＝o)nr15-、-c(＝o)s-、-c(＝s)s-、-sc(＝s)-、-sc(＝o)-、-oc(＝o)s-、-sc(＝o)o-、-sc(＝o)s-、-os(＝o)2o-、-s(＝o)2o-、-os(＝o)2-、-s(＝o)2-、-s(＝o)2-nr14-、-nr14-s(＝o)2-、-p(＝o)(or14)o-、-op(＝o)(or14)-或-op(＝o)(or14)o-；其中，m是2-6的整数，r7、r8彼此独立地是h、羟基、卤素、c1-6的直链或支链烷基或环烷基、c2-6的直链或支链的烯基，各r14、r15彼此独立地选自h、c1-30直链或支链的烷基或环烷基、c2-30直链或支链的烯基；
14、l2是-(cr9r10)n-或者-(cr9r10)n-x2-(cr11r12)k-，其中x2选自-o-、-s-、-nr16-、-s-s-、-c(＝o)-、-c(＝s)-、-c(＝o)o-、-oc(＝o)-、-c(＝o)nr16-、-nr16c(＝o)-、-oc(＝o)o-、-nr16c(＝o)o-、-oc(＝o)nr16-、-nr16c(＝o)nr17-、-c(＝o)s-、-c(＝s)s-、-sc(＝s)-、-sc(＝o)-、-oc(＝o)s-、-sc(＝o)o-、-sc(＝o)s-、-os(＝o)2o-、-s(＝o)2o-、-os(＝o)2-、-s(＝o)2-、-s(＝o)2-nr16-、nr16-s(＝o)2-、-p(＝o)(or16)o-、-op(＝o)(or16)-或-op(＝o)(or16)o-；n是1-6的整数；k是1-6的整数；r9、r10、r11、r12彼此独立地是h、羟基、卤素、c1-6的直链或支链烷基或环烷基、c2-6的直链或支链的烯基，各r16、r17彼此独立地选自h、c1-30直链或支链的烷基或环烷基、c2-30直链或支链的烯基；
15、其中r4至r17中所述的烷基、环烷基、烯基未被取代或被一个或多个选自羟基、巯基、氨基、取代氨基、卤素的基团取代；
16、所述盐不包括季铵盐。
17、在一项优选的实施方案中，所述r1、r2、r3彼此独立地是如下基团：
18、
19、其中，y不存在，或者是c1-30直链或支链烷基或环烷基、c2-20直链或支链烯基、c2-20直链或支链炔基；r1’、r2’彼此独立地是h、c1-30直链或支链烷基、c2-30直链或支链烯基、c2-30直链或支链炔基，且y、r1’和r2’的碳链总长度为8-40。
20、在一项优选的实施方案中，所述r1、r2、r3彼此独立地选自以下基团：
21、
22、其中，r1’、r2’彼此独立地是h、c1-30直链或支链烷基、c2-30直链或支链烯基、c2-30直链或支链炔基，且r1’和r2’的碳链总长度为8-30。
23、在一项优选的实施方案中，所述r1、r2、r3彼此独立地选自以下基团中的任意一种：
24、
25、在一项优选的实施方案中，g1、g2、g3彼此独立地是-o-、-s-、-nr6-、-s-s-、-c(＝o)-、-c(＝o)o-、-ch(oh)-、-oc(＝o)-、-c(＝o)nr6-、-nr6c(＝o)-、-oc(＝o)o-、-nr6c(＝o)o-、-oc(＝o)nr6-、-nr6c(＝o)nr13-、-p(＝o)(or6)o-、-op(＝o)(or6)-或-op(＝o)(or6)o-。
26、在一项优选的实施方案中，l1选自-(cr7r8)m-x1-，其中x1选自-o-、-s-、-nr14-、-s-s-、-c(＝o)-、-c(＝o)o-、-oc(＝o)-、-c(＝o)nr14-、-nr14c(＝o)-、-oc(＝o)o-、-nr14c(＝o)o-、-oc(＝o)nr14-、-nr14c(＝o)nr15-、-p(＝o)(or14)o-、-op(＝o)(or14)-或-op(＝o)(or14)o-。
27、在一项优选的实施方案中，l2是-(cr9r10)n-x2-(cr11r12)k-，其中x2选自-o-、-s-、-nr16-、-s-s-、-c(＝o)-、-c(＝o)o-、-oc(＝o)-、-c(＝o)nr16-、-nr16c(＝o)-、-oc(＝o)o-、-nr16c(＝o)o-、-oc(＝o)nr16-、-nr16c(＝o)nr17-、-p(＝o)(or16)o-、-op(＝o)(or16)-或-op(＝o)(or16)o-。
28、在一项优选的实施方案中，m选自以下结构：
29、
30、其中，m’与n’彼此独立地是0-6的整数，r1”与r2”彼此独立地是h、c1-6的烷基、c2-6的烯基、胍基、脒基、酰胺基、脂肪胺基、3-10元含氮杂环；所述含氮杂环选自吡咯、咪唑、吡啶、吡唑、三氮唑、恶唑、异恶唑、噻吩、异噻唑、哒嗪、吡嗪、哌嗪、吲哚、苯并咪唑、咔唑、喹啉、异喹啉、嘌呤和嘧啶及其互变异构形式，其未被取代或任选地被一个或多个选自羟基、巯基、氨基、取代氨基、卤素、c1-6烷基、c2-6烯基、c2-6炔基、c6-14芳基的有机基团取代。
31、在一项优选的实施方案中，所述式(1)的化合物选自式(1a)所示的化合物：
32、
33、在一项优选的实施方案中，所述式(1)的化合物选自式(1b)所示的化合物：
34、
35、在一项优选的实施方案中，所述式(1)的化合物选自式(1c)的化合物：
36、
37、在一项优选的实施方案中，所述式(1)的化合物选自式(1d)所示的化合物的化合物：
38、
39、在一项优选的实施方案中，所述式(1)的化合物选自式(1e)所示的化合物
40、
41、在一项优选的实施方案中，所述式(1)的化合物选自式(1f)所示的化合物：
42、
43、在一项优选的实施方案中，所述式(1)的化合物选自式(1g)所示的化合物：
44、
45、在一项优选的实施方案中，所述式(1)的化合物选自式(1h)所示的化合物：
46、
47、在一项优选的实施方案中，m选自以下基团中的任意一个：
48、
49、在一项优选的实施方案中，所述式(1)的化合物选自式(1i)所示的化合物：
50、
51、在一项优选的实施方案中，所述式(1)的化合物选自式(1j)所示的化合物：
52、
53、在一项优选的实施方案中，所述式(1)的化合物选自式(1k)所示的化合物：
54、
55、在一项优选的实施方案中，y不存在，所述式(1)的化合物选自式(1l)所示的化合物：
56、
57、其中r1’、r2’独立的选自h、c1-30直链或支链烷基、c2-30直链或支链烯基、c2-30直链或支链炔基，且r1’和r2’的碳链总长度为8-40。
58、在一项优选的实施方案中，所述式(1)的化合物选自式(1m)所示的化合物：
59、
60、在一项优选的实施方案中，所述式(1)的化合物选自：
61、
62、
63、
64、
65、
66、
67、
68、
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130、
131、
132、
133、
134、
135、
136、
137、
138、在一项优选的实施方案中，所述第一可电离脂质的制备方法包括使式(ii)与式(iii)化合物反应的步骤：
139、
140、其中，xa和xb为含有离去基团或亲核基团的基团，且xa和xb通过亲核反应或缩合反应形成l1。
141、在一项优选的实施方案中，所述第一可电离脂质的制备方法包括使式(iv)与式(v)化合物反应的步骤：
142、
143、其中xc、xd为含有离去基团或亲核基团的基团，且xc和xd通过亲核反应或缩合反应形成l2。
144、在一项优选的实施方案中，所述第一可电离脂质的制备方法包括使式(vi)化合物反应的步骤：
145、
146、其中xe为含有离去基团或亲核基团的基团，xf为含有离去基团或亲核基团的化合物，且xe和xf通过亲核反应或缩合反应形成m。
147、在一项优选的实施方案中，所述第一可电离脂质的制备方法包括使式(vii)化合物依次与式(viii)化合物、式(ix)化合物、式(x)化合物反应的步骤：
148、
149、其中xg、xh、xi、xj、xk、xl为含有离去基团或亲核基团的基团，且xg和xj通过亲核反应或缩合反应形成g1，xh和xk通过亲核反应或缩合反应形成g2，xi和xl通过亲核反应或缩合反应形成g3。
150、在一项优选的实施方案中，所述第一可电离脂质的制备方法包括使式(xi)与式(xii)化合物反应的步骤：
151、
152、式(xiii)与式(xii)化合物反应的步骤：
153、
154、其中xm为含有亲核基团的基团，且xm与式(xii)化合物的c＝c-l2a通过加成反应形成x1-l2。
155、在一项优选的实施方案中，r1、r2、r3彼此独立地是如下基团：
156、
157、其中y、r1’、r2’的含义同前；
158、其中还包括形成尾链r1、r2、r3的步骤：
159、
160、其中x为离去基团。
161、在一项优选的实施方案中，所述第二可电离脂质为式(2)的化合物，或其盐、立体异构体、互变异构体：
162、
163、其中n1为nh或o；
164、ra选自c6-c24烷基、c6-c24烯基、c6-c24的环烷基、c6-c24醇、c6-c24短链聚氧乙烯；所述c6-c24烷基、c6-c24烯基、c6-c24的环烷基、c6-c24醇、c6-c24短链聚氧乙烯为直链或支链结构；rb和rc各自独立地选自c1-c12烷基、c2-c12烯基、c1-c12炔基、c3-c12环烷烃基、c6-c12的芳烃基、c1-c12烷基醇、c1-c12的杂环基、烷基胺；
165、所述烷基胺为其中，ra’为c1-c12烷基，所述rb’和rb”各自独立的选自h、c1-c6烷基胺、rc”选自被未取代或被氨基取代的c1-c6烷基，rc”’为h、或-rc’-a1’-rc”-nh2；
166、条件是，当a1’为-co-nh-、-nh-co-或-co-o-时，rc’为c1-c6烷基；当a1’为-co-时，rc’不存在。
167、在一项优选的实施方案中，rb和rc各自独立地选自c1-c12烷基醇、烷基胺。
168、在一项优选的实施方案中，条件是：当ra为c6-c24烯基时，a1为nh，rb和rc各自独立地选自c1-c12烷基醇；
169、当ra为支链的c6-c24烷基时，a1为nh，rb和rc各自独立地选自c1-c12烷基醇、烷基胺；
170、ra为直链的c6-c24烷基时，a1为nh或o，rb和rc各自独立地选自烷基胺；
171、当ra为直链的c6-c24烷基时，a1为o，rb和rc各自独立地选自c1-c12烷基醇；
172、当ra为c6-c24短链聚氧乙烯时，a1为nh或o，rb和rc各自独立地选自烷基胺；
173、或当ra为c6-c24烷基醇时，a1为nh或o，rb和rc各自独立地选自烷基胺。
174、在一项优选的实施方案中，ra选自下面的化合物结构：
175、
176、在一项优选的实施方案中，rb和rc选自下面的化合物结构：
177、
178、rd选自c1-c6的烷烃或环烷烃。
179、在一项优选的实施方案中，所述式(2)的化合物选自下列化合物中的至少一种：
180、
181、
182、
183、在一项优选的实施方案中，第二可电离脂质的制备方法包括如下反应步骤：
184、ra”-nh2①与α,β-不饱和羰基化合物②反应生成可电离脂质化合物③：
185、
186、其中，ra”-nh2为ra-nh2或
187、rb’和rb”同时为h，或者rb’和rb”同时为c1-c6胺，或者rb’和rb”同时为-rc’-a1’-rc”-nh2。
188、在一项优选的实施方案中，第二可电离脂质的制备方法包括：
189、1)ra”-nh2①与α,β-不饱和羰基化合物④反应生成化合物⑤；
190、2)化合物⑤与亲核试剂⑥反应生成可电离脂质化合物③；
191、
192、其中，亲核试剂⑥为rb-nh2或rb-oh；ra”-nh2选自ra-nh2或
193、
194、rb’和rb”同时为h，或者rb’和rb”同时为c1-c6胺，或者rb’和rb”同时为-rc’-a1’-rc”-nh2；z2为离去基团，z2与nh2反应得到a1。
195、在一项优选的实施方案中，第二可电离脂质的制备方法包括：
196、1)ra”-nh2①与α,β-不饱和羰基化合物②反应生成化合物⑦；
197、2)化合物⑦与α,β-不饱和羰基化合物⑧反应生成化合物⑨；
198、3)化合物⑨与亲核试剂⑩反应生成可电离脂质化合物
199、
200、其中，ra”-nh2为ra-nh2，z3为离去基团，a3与z3反应得到a1。
201、在一项优选的实施方案中，式2a-式2c中，至少一种亲核试剂与至少一种α,β-不饱和羰基化合物的β位碳原子发生麦克加成反应，生成含碳碳键、碳氧键、碳氮键、碳硫键或碳硒键的带有两分叉的所述可电离脂质化合物。
202、在一项优选的实施方案中，式2a-式2b还包括以通过式2a-式2b反应得到的带有端氨基的式(2)的化合物作为原料，按照式2a中步骤1或式2b中步骤1-2进行迭代反应的步骤；
203、所述带有端氨基的式(2)的化合物为
204、其中，rb’和rb”同时为h，或者rb’和rb”同时为c1-c6胺，或者rb’和rb”同时为-rc’-a1’-rc”-nh2。
205、在一项优选的实施方案中，式2a-式2c反应式还包括以通过式2a-式2c反应式得到带有端氨基的式(2)的化合物作为原料，与反应的步骤；
206、所述带有端氨基的式(2)的化合物为
207、其中，rb’和rb”同时为h，或者rb’和rb”同时为c1-c6胺，或者rb’和rb”同时为-rc’-a1’-rc”-nh2。
208、上文所述的离去基团是指在亲核反应或缩合反应中离去部分，包括但不限于：h、
209、oh、h2o、卤素(例如f,cl，br和i)、氰酸负离子、无机酸(例如硝酸、硫酸、磷酸)、羧酸(例如乙酸、三氟乙酸和苯甲酸等)、磺酸(例如甲磺酸、三氟甲磺酸、苯磺酸、对甲基苯磺酸和对硝基苯磺酸等)、二氧化碳(co2)、氮气(n2)、咪唑、烷氧基(r-o-)、氨基(-nhr，其中r为h去掉的烷基或芳基)、苯氧基、叔碳正离子(例如叔丁基正离子)、被不饱和系统或杂原子稳定的碳正离子或上文所述的各种保护基。
210、上文所述的亲核基团是指在化学反应中能够提供电子对以形成新的化学键的分子或离子，常见亲核基团包括：氢氧根(ho-)、氨(nh3)、羟胺(nh2oh)、肼(nh2-nh2)、取代肼、具有亲核性的卤素(如cl-、br-或i-)、氢负离子(h-)、叠氮负离子(n3-)、氰酸根负离子(cn-)、醇或烷氧基负离子(例如脱除羟基氢的醇)、胺基(包括伯胺、仲胺和叔胺)或胺负离子、碳负离子(例如格氏试剂、有机锂试剂、吉尔曼试剂等有机金属试剂中的碳负离子)、巯基或巯基负离子、硫醚、烯醇或烯醇负离子、烯基醚、烯胺、羧酸或羧酸负离子、烷基或芳基膦(例如三苯基膦)、有孤对电子的芳杂环(例如吡啶)等。
211、在一项优选的实施方案中，反应过程中所用原料还含有保护基团，反应步骤中包括保护和/或脱保护的步骤。
212、在一项优选的实施方案中，所述基于空白脂质纳米颗粒的转染试剂，所述脂质纳米颗粒还包括0-60mol％的其他可电离脂质，所述其他可电离脂质选自下列化合物中的至少一种：
213、
214、
215、
216、
217、
218、在一项优选的实施方案中，所述磷脂包括1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dlpc)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(dmpc)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dopc)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dppc)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)、1,2-双十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(dupc)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(popc)、1,2-二-0-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0diether pc)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(ochemspc)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(c16 lyso pc)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(me 16.0pe)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(dopg)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(dppg)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(pope)、二硬脂酰基-磷脂酰-乙醇胺(dspe)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(dppe)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(dmpe)、1-硬脂酰基-2-油酰基-硬脂酰乙醇胺(sope)、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱(sopc)、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺(lpe)中的至少一种。
219、在一项优选的实施方案中，所述类固醇或其衍生物包括胆固醇、胆固醇硬脂酸、粪固醇、谷固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜籽固醇、盐藻甾醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚中的至少一种。
220、在一项优选的实施方案中，所述聚乙二醇缀合脂质包括peg改性的磷脂酰乙醇胺、peg改性的磷脂酸、peg改性的神经酰胺、peg改性的二烷基胺、peg改性的二酰基甘油、peg改性的二烷基甘油中的至少一种。
221、在一项优选的实施方案中，所述聚乙二醇缀合脂质包括peg-二硬脂基氧基丙基(peg-dsa)、peg-c-domg、peg-dppc、聚乙二醇二甲基丙烯酸(peg-dma)、1,2-二甲基苯乙烯-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(peg-dmg)、双棕榈酸甘油酯-聚乙二醇(dpg-peg)、1,2-二硬脂酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(dsg-peg)、2-[(聚乙二醇)-2000]-n,n-二十四烷基乙酰胺(alc-0159)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dppe-peg)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(peg-dspe)、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(peg-dlpe)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(peg-dmpe)脂质中的至少一种。
222、在一项优选的实施方案中，所述转染试剂中，核酸分子被包裹于脂质纳米颗粒内部和/或吸附于脂质纳米颗粒表面，形成一种复合物。
223、第二方面，本发明提供了前述基于空白脂质纳米颗粒的转染试剂的制备方法，其特征在于，包括将空白脂质纳米颗粒与核酸在溶剂中混合的步骤。
224、在一项优选的实施方案中，所述混合方式包括手动混合、涡旋混合、搅拌混合以及微通道混合。
225、在一项优选的实施方案中，混合后所述核酸的浓度为5-1000ng/μl。
226、在一项优选的实施方案中，所述溶剂为水、有机溶剂的水溶液、缓冲盐溶液中的至少一种。
227、在一项优选的实施方案中，所述缓冲盐溶液ph为1-9，所述缓冲盐浓度为0.1-200mm，所述有机溶剂的水溶液为体积浓度＜50％的醇溶液。
228、在一项优选的实施方案中，所述醇为乙醇。
229、在一项优选的实施方案中，所述缓冲盐溶液选自枸橼酸盐溶液、醋酸盐溶液、酒石酸盐溶液、磷酸盐溶液、碳酸盐溶液、tris-hcl溶液、氯化钠溶液中的至少一种。
230、在一项优选的实施方案中，所述基于空白脂质纳米颗粒的转染试剂中还添加培养基、糖、甘油、dmso、盐、抗生素、表面活性剂中的至少一种。
231、第三方面，本发明提供了前述的基于空白脂质纳米颗粒的转染试剂在体外转染中的应用。
232、在一项优选的实施方案中，所述在体外转染中的应用为制备用于体外转染的产品中的应用。
233、第四方面，本发明提供了一种体外转染方法，使前述的基于空白脂质纳米颗粒的转染试剂与细胞混合，进行转染。
234、第五方面，本发明提供了前述的基于空白脂质纳米颗粒的转染试剂在制备用于体外转染的药物中的应用，使前述的基于空白脂质纳米颗粒的转染试剂与细胞混合，进行转染。
235、在一项优选的实施方案中，所述细胞包括真核细胞和/或原核细胞；所述原核细胞为细菌细胞；所述真核细胞为动物细胞、植物细胞、藻类细胞、真菌细胞中的至少一种。
236、在一项优选的实施方案中，细胞的存活率≥80％。
237、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
238、1、本发明的基于空白脂质纳米颗粒的转染试剂包括：(1)空白脂质纳米颗粒；(2)生物学活性成分；所述空白脂质纳米颗粒组成包括：可电离脂质、磷脂、胆固醇以及聚乙二醇缀合脂质。空白脂质纳米颗粒和转染试剂制备工艺简单，无需借助设备即可完成制备。
239、2、本发明提出的基于空白脂质纳米颗粒的转染试剂通过空白脂质纳米颗粒和核酸制备得到，可根据使用者需求灵活调整剂量，且转染效果稳定。
240、3、本发明提出的基于空白脂质纳米颗粒的转染试剂可转染多种细胞(如293t、hela、hepg2、two3、mcf7等)，细胞毒性低，转染效果好；在细胞转染中，与市售转染试剂相比，转染效果更优。
1.基于空白脂质纳米颗粒的转染试剂，其特征在于，包括：(1)空白脂质纳米颗粒；(2)生物学活性成分；所述空白脂质纳米颗粒组成包括：5-70mol％第一可电离脂质、0-30mol％第二可电离脂质、5-50mol％磷脂、10-70mol％胆固醇以及0-15mol％聚乙二醇缀合脂质；所述转染试剂中，生物学活性成分的用量为空白脂质纳米颗粒和生物学活性成分总量的0.1％-50％(w/w)。
2.如权利要求1所述的转染试剂，其特征在于，所述生物学活性成分包括核酸、多肽中的至少一种。
3.如权利要求2所述的转染试剂，其特征在于，所述核酸是dna和/或rna，包括sirna、mirna、sarna、sgrna、dsrna、shrna、smrna、ssrna、mrna、circrna、snrna、crrna、incrna、snorna、pirna、pdna、ssdna、环状或线状dna、dna微环、msdna中的至少一种。
4.如权利要求2所述的转染试剂，其特征在于，所述多肽选自包含2-50个氨基酸的多肽。
5.如权利要求1所述的转染试剂，其特征在于，所述第一可电离脂质选自含有通式(1)的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体；
6.如权利要求5所述的转染试剂，其特征在于，所述r1、r2、r3彼此独立地是如下基团：
7.如权利要求5所述的转染试剂，其特征在于，所述r1、r2、r3彼此独立地选自以下基团：
8.如权利要求5所述的转染试剂，其特征在于，所述r1、r2、r3彼此独立地选自以下基团中的任意一种：
9.如权利要求5所述的转染试剂，其特征在于，g1、g2、g3彼此独立地是-o-、-s-、-nr6-、-s-s-、-c(＝o)-、-c(＝o)o-、-ch(oh)-、-oc(＝o)-、-c(＝o)nr6-、-nr6c(＝o)-、-oc(＝o)o-、-nr6c(＝o)o-、-oc(＝o)nr6-、-nr6c(＝o)nr13-、-p(＝o)(or6)o-、-op(＝o)(or6)-或-op(＝o)(or6)o-。
10.如权利要求5所述的转染试剂，其特征在于，l1选自-(cr7r8)m-x1-，其中x1选自-o-、-s-、-nr14-、-s-s-、-c(＝o)-、-c(＝o)o-、-oc(＝o)-、-c(＝o)nr14-、-nr14c(＝o)-、-oc(＝o)o-、-nr14c(＝o)o-、-oc(＝o)nr14-、-nr14c(＝o)nr15-、-p(＝o)(or14)o-、-op(＝o)(or14)-或-op(＝o)(or14)o-。
11.如权利要求5所述的转染试剂，其特征在于，l2是-(cr9r10)n-x2-(cr11r12)k-，其中x2选自-o-、-s-、-nr16-、-s-s-、-c(＝o)-、-c(＝o)o-、-oc(＝o)-、-c(＝o)nr16-、-nr16c(＝o)-、-oc(＝o)o-、-nr16c(＝o)o-、-oc(＝o)nr16-、-nr16c(＝o)nr17-、-p(＝o)(or16)o-、-op(＝o)(or16)-或-op(＝o)(or16)o-。
12.如权利要求5所述的转染试剂，其特征在于，m选自以下结构：
13.如权利要求5所述的转染试剂，其特征在于，所述式(1)的化合物选自式(1a)所示的化合物：
14.如权利要求5所述的转染试剂，其特征在于，所述式(1)的化合物选自式(1b)所示的化合物：
15.如权利要求5所述的转染试剂，其特征在于，所述式(1)的化合物选自式(1c)的化合物：
16.如权利要求14所述的转染试剂，其特征在于，所述式(1)的化合物选自式(1d)所示的化合物的化合物：
17.如权利要求16所述的转染试剂，其特征在于，所述式(1)的化合物选自式(1e)所示的化合物
18.如权利要求17所述的转染试剂，其特征在于，所述式(1)的化合物选自式(1f)所示的化合物：
19.如权利要求18所述的转染试剂，其特征在于，所述式(1)的化合物选自式(1g)所示的化合物：
20.如权利要求18所述的转染试剂，其特征在于，所述式(1)的化合物选自式(1h)所示的化合物：
21.如权利要求5所述的转染试剂，其特征在于，所述式(1)的化合物选自式(1i)所示的化合物：
22.如权利要求14所述的转染试剂，其特征在于，所述式(1)的化合物选自式(1j)所示的化合物：
23.如权利要求21所述的转染试剂，其特征在于，所述式(1)的化合物选自式(1k)所示的化合物：
24.如权利要求6所述的转染试剂，其特征在于，y不存在，所述式(1)的化合物选自式(1l)所示的化合物：
25.如权利要求6所述的转染试剂，其特征在于，所述式(1)的化合物选自式(1m)所示的化合物：
26.如权利要求1所述的转染试剂，其特征在于，所述式(1)的化合物选自：
27.如权利要求1-26任一项所述的转染试剂，其特征在于，所述第二可电离脂质为式(2)的化合物，或其盐、立体异构体、互变异构体：
28.如权利要求27所述的转染试剂，其特征在于，所述式(2)的化合物选自下列化合物中的至少一种：
29.如权利要求1-26任一项所述的转染试剂，其特征在于，所述转染试剂还包括0-60mol％的其他可电离脂质，所述其他可电离脂质选自下列化合物中的至少一种：
30.如权利要求1所述的转染试剂，其特征在于，所述磷脂包括1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二-0-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐、二棕榈酰基磷脂酰甘油、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基-磷脂酰-乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺、1-硬脂酰基-2-油酰基-硬脂酰乙醇胺、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺中的至少一种。
31.如权利要求1所述的转染试剂，其特征在于，所述类固醇或其衍生物包括胆固醇、胆固醇硬脂酸、粪固醇、谷固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜籽固醇、盐藻甾醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚中的至少一种。
32.如权利要求1所述的转染试剂，其特征在于，所述聚乙二醇缀合脂质包括peg改性的磷脂酰乙醇胺、peg改性的磷脂酸、peg改性的神经酰胺、peg改性的二烷基胺、peg改性的二酰基甘油、peg改性的二烷基甘油中的至少一种。
33.如权利要求33所述的转染试剂，其特征在于，所述聚乙二醇缀合脂质包括peg-二硬脂基氧基丙基、peg-c-domg、peg-dppc、聚乙二醇二甲基丙烯酸、1,2-二甲基苯乙烯-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇、双棕榈酸甘油酯-聚乙二醇、1,2-二硬脂酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇、2-[(聚乙二醇)-2000]-n,n-二十四烷基乙酰胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇脂质中的至少一种。
34.根据权利要求1所述的转染试剂，其特征在于，所述转染试剂中，核酸分子被包裹于脂质纳米颗粒内部和/或吸附于脂质纳米颗粒表面，形成一种复合物。
35.如权利要求1-34任一项所述的转染试剂的制备方法，其特征在于，包括将空白脂质纳米颗粒与核酸在溶剂中混合的步骤。
36.如权利要求35所述的制备方法，其特征在于，混合后所述核酸的浓度为5-1000ng/μl。
37.如权利要求35所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为水、有机溶剂的水溶液、缓冲盐溶液中的至少一种。
38.如权利要求37所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲盐溶液ph为1-9，所述缓冲盐浓度为0.1-200mm，所述有机溶剂的水溶液为体积浓度＜50％的醇溶液。
39.如权利要求38所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲盐溶液选自枸橼酸盐溶液、醋酸盐溶液、酒石酸盐溶液、磷酸盐溶液、碳酸盐溶液、tris-hcl溶液、氯化钠溶液中的至少一种。
40.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述转染试剂中还添加培养基、糖、甘油、dmso、盐、抗生素、少量表面活性剂等。
41.如权利要求1-34任一项所述的转染试剂在体外转染中的应用。
42.一种体外转染方法，其特征在于，使权利要求1-34任一项所述的转染试剂与细胞混合，进行转染。
43.如权利要求42所述的体外转染方法，其特征在于，所述细胞包括真核细胞和/或原核细胞；所述原核细胞为细菌细胞；所述真核细胞为动物细胞、植物细胞、藻类细胞、真菌细胞中的至少一种。
