本发明涉及发酵工程领域，具体涉及辛弗林合成方法，还涉及合成辛弗林的工程菌。
背景技术：
1、辛弗林作为我国传统中药材枳实(fructus aurantii immatures，fai)中含量最高、最活跃的生物碱，是枳实中起主要药理作用的有效成分，具有升高血压、促进心血管兴奋等作用，因而常用于治疗低血压等病症。由于结构与肾上腺素、去甲肾上腺素以及麻黄碱相似，辛弗林还被发现能够加快心率，促进血液循环，氧化脂肪，增加能量水平，从而药理作用表现为肾上腺素α受体、心脏β受体兴奋剂，可代替麻黄碱作为一种中枢神经兴奋药使用并用于临床急救。同时研究表明辛弗林具有一定的抗氧化、降血糖、减肥功效作用。
2、目前，辛弗林的生产主要为化学合成法和物理提取法，由于辛弗林在枳实等作物中含量很低，采用提取方法存在提取成本高、含量低、污染大等问题；如中国专利cn115043889b报道从代代花中提取辛弗林，辛弗林含量仅为0.6％；中国专利cn105399787a公开了一种从柑橘皮、果中提取新橙皮苷、橙皮苷和辛弗林的方法，辛弗林含量收率也仅为2.5％，产品纯度和收率均很低。化学合成法主要包括直接酰化法、氨基乙腈法、fries重排法等，苯酚为起始原料，也存在反应毒性大、环境污染等问题。因此需要开发高效的绿色生产方法。
3、合成生物学技术以低成本的葡萄糖等为原料，通过微生物底盘菌株合成目的产物，不仅反应条件温和、绿色环保，还具有高效、易于调控等优势。目前尚未有通过生物发酵的方法来生产辛弗林的研究出现。本发明以产酪氨酸的大肠杆菌为出发菌株，搭建一条从葡萄糖从头合成辛弗林的生物合成路线，从而实现绿色高效生物合成辛弗林。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种辛弗林合成方法；本发明的目的之二在于提供酪氨酸脱羧酶、多巴胺-β-单加氧酶和苯乙醇胺-n-甲基转移酶联合在产酪氨酸菌中重建辛弗林代谢途径中的应用；本发明的目的之三在于提供一种合成辛弗林的工程菌。
2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
3、1、辛弗林合成方法，以酪氨酸为底物，依次在酪氨酸脱羧酶、多巴胺-β-单加氧酶和苯乙醇胺-n-甲基转移酶催化下合成辛弗林。
4、2、酪氨酸脱羧酶、多巴胺-β-单加氧酶和苯乙醇胺-n-甲基转移酶联合在产酪氨酸菌中重建辛弗林代谢途径中的应用。
5、本发明优选的，所述酪氨酸脱羧酶的氨基酸如seq id no.1所示；所述多巴胺-β-单加氧酶的氨基酸如seq id no.2所示；所述苯乙醇胺-n-甲基转移酶的氨基酸如seq idno.3所示。
6、本发明优选的，编码表达所述酪氨酸脱羧酶的核苷酸如seq id no.5所示；编码表达所述多巴胺-β-单加氧酶的核苷酸如seq id no.6所示；编码表达所述苯乙醇胺-n-甲基转移酶的核苷酸如seq id no.7所示。
7、本发明优选的，所述产酪氨酸菌选自酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌。
8、3、一种合成辛弗林的工程菌，所述工程菌以产酪氨酸菌株作为底盘菌，在底盘菌中同时表达酪氨酸脱羧酶、多巴胺-β-单加氧酶和苯乙醇胺-n-甲基转移酶，获得产辛弗林的工程菌。
9、本发明优选的，所述底盘菌为酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌。
10、本发明优选的，所述底盘菌为过表达酪氨酸转运蛋白tyrp以及芳香族氨基酸转运蛋白arop的bak11菌。
11、本发明优选的，所述工程菌由以下方法构建：将酪氨酸脱羧酶编码基因连接于pet28a质粒，得到mbp-tydc-pet28a重组质粒，然后将多巴胺-β-单加氧酶编码基因扩增后通过重组整合入线性化mbp-tydc-pet28a重组质粒中，enaseⅱ连接后得到mtd-pet28a质粒，然后将苯乙醇胺-n-甲基转移酶编码基因通过重组整合入mtd-pet28a线性化质粒中，得到mtd-mp-pet28a重组质粒，转入bak11(de3)菌株，得到工程菌株bak11-tas。
12、本发明优选的，所述线性化mbp-tydc-pet28a重组质粒是用sacⅰ和hindⅲ线性化；所述mtd-pet28a线性化质粒是用hindⅲ和xhoⅰ线性化。
13、本发明的有益效果在于：本发明公开了由酪氨酸生物转化为辛弗林的催化路线，实现了生物发酵法合成辛弗林的从无到有，并结合了高产酪氨酸的底盘菌株，从而实现了以廉价原料葡萄糖合成辛弗林的从头合成。该工程菌基于高产酪氨酸的底盘，异源表达酪氨酸脱羧酶、多巴胺β-单加氧酶以及苯乙醇胺n-甲基转移酶，实现微生物底盘能够以葡萄糖为原料从头合成辛弗林。同时本发明也适用于其他菌株如酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌等模式或其他非模式底盘微生物进一步改造酪氨酸生物合成途径，实现生物合成辛弗林的技术路线。
1.辛弗林合成方法，其特征在于：以酪氨酸为底物，依次在酪氨酸脱羧酶、多巴胺-β-单加氧酶和苯乙醇胺-n-甲基转移酶催化下合成辛弗林。
2.酪氨酸脱羧酶、多巴胺-β-单加氧酶和苯乙醇胺-n-甲基转移酶联合在产酪氨酸菌中重建辛弗林代谢途径中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述酪氨酸脱羧酶的氨基酸如seq idno.1所示；所述多巴胺-β-单加氧酶的氨基酸如seq id no.2所示；所述苯乙醇胺-n-甲基转移酶的氨基酸如seq id no.3所示。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：编码表达所述酪氨酸脱羧酶的核苷酸如seq id no.5所示；编码表达所述多巴胺-β-单加氧酶的核苷酸如seq id no.6所示；编码表达所述苯乙醇胺-n-甲基转移酶的核苷酸如seq id no.7所示。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述产酪氨酸菌选自酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌。
6.一种合成辛弗林的工程菌，其特征在于：所述工程菌以产酪氨酸菌株作为底盘菌，在底盘菌中同时表达酪氨酸脱羧酶、多巴胺-β-单加氧酶和苯乙醇胺-n-甲基转移酶，获得产辛弗林的工程菌。
7.根据权利要求6所述合成辛弗林的工程菌，其特征在于：所述底盘菌为酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌。
8.根据权利要求7所述合成辛弗林的工程菌，其特征在于：所述底盘菌为过表达酪氨酸转运蛋白tyrp以及芳香族氨基酸转运蛋白arop的bak11菌。
9.根据权利要求7所述合成辛弗林的工程菌，其特征在于：所述工程菌由以下方法构建：将酪氨酸脱羧酶编码基因连接于pet28a质粒，得到mbp-tydc-pet28a重组质粒，然后将多巴胺-β-单加氧酶编码基因扩增后通过重组整合入线性化mbp-tydc-pet28a重组质粒中，enaseⅱ连接后得到mtd-pet28a质粒，然后将苯乙醇胺-n-甲基转移酶编码基因通过重组整合入mtd-pet28a线性化质粒中，得到mtd-mp-pet28a重组质粒，转入bak11-ta菌株，得到工程菌bak11-tas。
10.根据权利要求9所述合成辛弗林的工程菌，其特征在于：所述线性化mbp-tydc-pet28a重组质粒是用sacⅰ和hindⅲ线性化；所述mtd-pet28a线性化质粒是用hindⅲ和xhoⅰ线性化。
