本发明涉及纳米生物医药材料领域，具体涉及一种近红外aie吡啶盐光敏剂及其在“壳核双靶向”智能纳米给药系统中的应用。
背景技术：
1、众所周知，由于环境污染的日益严重，人类生存环境持续恶化，癌症已成为多发性疾病，严重威胁人类生命健康。由于癌症独特的多靶点发病机制以及发病率、死亡率的激增，其有效诊治已经成为人类亟需攻克的重大研究难题。目前，癌症的治疗方法主要包括手术切除、化学治疗、免疫治疗和放疗等。其中，化学治疗是癌症综合治疗中不可或缺的重要方法，但传统的化疗存在药物生物利用率低、毒副作用大、靶向性和特异选择性差及难以实时监控治疗效果等缺点，限制了其临床应用。因此，研发肿瘤的非侵入式精准疗法并降低治疗的副作用具有重大的现实意义。
2、近年来，光动力学治疗(pdt)成为一种癌症治疗的替代疗法，具有非侵入性、高选择性且副作用小等优点。它主要是利用光敏剂(ps)在外界光源照射下产生细胞毒性很强的单线态活性氧(ros)，从而诱导靶向器官细胞发生自噬、凋亡或坏死。同时，由于大多数光敏剂可以发射荧光，pdt疗法可以同时实现细胞成像和治疗功能，可在治疗过程中实时检测治疗效果。虽然pdt已经取得了令人瞩目的成效，但所报道的光敏剂仍然存在活性氧产生效率低、耐光漂白能力差以及荧光强度弱等缺点，其主因是传统光敏剂的聚集诱导猝灭(acq)效应。
3、2001年，唐本忠课题组合成了一种硅杂环戊二烯衍生物(hps)。这种物质在稀溶液状态下不发光，而在聚集状态下可发出强烈荧光。这种光响应与传统的acq效应完全相反，实现了分子聚集态下发射荧光的效果(aie)。研究发现aie分子(aiegens)可在肿瘤细胞成像方面表现出良好的分辨率和稳定性，同时可在外界光源上高效产出活性氧，上述特性赋予其在光动力诊疗一体化领域以极大的可能性。
4、虽然“黑马”aiegens在光动力诊疗中已初露头角，但是仍有不少问题限制其应用。绝大多数aie光敏剂具有水溶性不好、生物相容性差、靶向性不佳、毒副作用大等缺点。为解决这些问题，科学家相继尝试用两亲性片段作为壳层，aie光敏剂作为核层，并将其包覆成为微胶囊纳米颗粒；此外，亦可在微胶囊中修饰靶向基团及负载化学药物。然而，上述载药系统都存在着一个致命的问题，即无法真正实现给药过程中的精准定位且往往治疗不彻底。因此，特异&高效aie载药纳米系统的设计与应用依然具有挑战性。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种集rgd肽靶向&线粒体靶向的“壳核双靶向”型近红外激发纳米给药系统，实现精准定位的同时，对患处提供化疗+光动力治疗双重治疗，以达到彻底杀死癌细胞的效果。
2、一种“壳核双靶向”型智能纳米给药系统包括靶向型aie吡啶盐光敏剂核层结构以及聚合物壳层结构；壳层结构包括两种两亲性聚合物dspe-pegn-dox和dspe-pegn-crgd。
3、其中，dspe-pegn-crgd和dspe-pegn-dox两片段中的n＝2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000。
4、本发明的目的之一在于提供一系列具有高单线态氧产率的近红外aie吡啶盐光敏剂aa0-aa7、bb0-bb7、cc0-cc7。
5、其中，各种产物的下标表明吡啶盐中碳原子的个数，如：产物aa0、aa1、aa3、aa5、aa7分别代表n为0,1,3,5,7。
6、“壳核双靶向”型智能纳米给药系统的制备，包括如下步骤(具体合成路线由下所示)：
7、aie吡啶盐光敏剂的合成包括以下步骤：
8、①中间体的合成：
9、中间体1的合成：向三口瓶中加入2,6-二甲基-4-吡喃酮2.5mol以及1,3-茚二酮3mol，并向其中加入100ml醋酸酐。将反应液在回流温度下反应6小时，并用质量分数30％氢氧化钠水溶液调ph至中性。乙酸乙酯(200ml)萃取3次，合并有机相，并用饱和nacl水溶液(500ml)洗涤五次。无水硫酸钠干燥，浓缩得到粗产物。经柱层析分离(石油醚/乙酸乙酯)可得黄色中间体1，产率75-78％。
10、中间体a的合成：向烧瓶中加入2-乙酰吡啶1-5mol和4-(二苯氨基)-苯甲醛1-5mol，5-10ml溶剂以及适量质量分数为10％的碱溶液，将上述反应物料溶于60-80ml的醇溶液中加热回流2h。洗涤后用乙酸乙酯/石油醚过柱，得黄色固体a，产率81-85％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.80-8.70(m,1h),8.20(dd,j＝14.3,11.9hz,2h),7.98-7.83(m,2h),7.61(d,j＝8.7hz,2h),7.50(ddd,j＝7.5,4.8,1.2hz,1h),7.37-7.29(m,4h),7.21-7.09(m,6h),7.09-6.98(m,2h)。
11、中间体b的合成：向烧瓶中加入2-乙酰吡啶1-5mol和5-(4-(二苯基氨基)苯基)噻吩-2-甲醛1-5mol，5-10ml溶剂以及适量质量分数为10％的碱溶液，将上述反应物料溶于60-80ml醇溶液中加热回流2h，洗涤后用乙酸乙酯/石油醚过柱，得红色固体b，产率62-65％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.83-8.75(m,1h),8.21(d,j＝7.8hz,1h),8.06(s,2h),7.95-7.86(m,1h),7.59-7.47(m,3h),7.37(dd,j＝9.3,4.5hz,1h),7.35-7.29(m,4h),7.24(d,j＝3.9hz,1h),7.16(dd,j＝8.5,1.0hz,4h),7.10(ddd,j＝8.6,4.3,1.4hz,4h)。
12、中间体c的合成：向烧瓶中加入3-乙酰吡啶1-5mol和5-(4-(二苯基氨基)苯基)噻吩-2-甲醛1-5mol，5-10ml溶剂以及适量质量分数为10％的碱溶液，将上述反应物料溶于60-80ml醇溶液中于25-40℃下搅拌6-8h。洗涤后用乙酸乙酯/石油醚过柱，得红色固体c，产率27-30％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.25(d,j＝1.7hz,1h),8.82(dd,j＝4.8,1.5hz,1h),8.31(dt,j＝7.9,1.8hz,1h),7.99(d,j＝15.1hz,1h),7.57-7.45(m,3h),7.38(d,j＝3.8hz,1h),7.32(t,j＝7.8hz,4h),7.28-7.23(m,2h),7.16(d,j＝7.7hz,4h),7.11(t,j＝7.9hz,4h)。
13、其中，中间体a、b、c合成步骤中所述的溶剂为四氢呋喃、1,4-二氧六环、乙醚中的一种或多种；
14、中间体a、b、c合成步骤中所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾、乙醇钠中的一种或多种；
15、中间体a、b、c合成步骤中所述醇溶液为乙醇、甲醇、丁醇中的一种或多种；
16、②aie光敏剂的合成
17、aie光敏剂aa0-aa7的合成：向三口瓶中加入中间体11-2mol以及a 5-15mol，反应溶剂150ml，向反应液中迅速加入一定量哌啶并于氮气环境下回流反应20-24h。冷却至室温，经石油醚/乙酸乙酯混合溶液中柱层析分离，在重结晶溶剂中重结晶后得到产物a-a。将化合物a-a 1mol、不同碳链长度的碘化物2.5mol和少量哌啶加入至无水乙醇中并在25-75℃的氮气氛围下搅拌24h。反应结束后，旋蒸除去溶剂得粗产物，经石油醚/乙酸乙酯混合溶液中柱层析分离，得到目标aie光敏剂aa0，aa1，aa3，aa5，aa7。
18、aa0 hrms(ems):m/z:[m-2br]+calcd for c70h54n4o3,998.4196；found:998.4198；
19、aa1 hrms(ems):m/z:[m-2br]+calcd for c72h58n4o3,1026.4509；found:1026.4507；
20、aa3 hrms(ems):m/z:[m-2br]+calcd for c76h66n4o3,1082.5135；found:1082.5136；
21、aa5 hrms(ems):m/z:[m-2br]+calcd for c80h74n4o3,1138.5761；found1138.5761；
22、aa7 hrms(ems):m/z:[m-2br]+calcd for c84h82n4o3,1194.6387；found1194.6388。
23、aie光敏剂bb0-bb7的合成：向三口瓶中加入中间体11-2mol以及b 5-15mol，反应溶剂150ml，向反应液中迅速加入一定量哌啶并于氮气环境下回流反应20-24h。冷却至室温，经石油醚/乙酸乙酯混合溶液中柱层析分离，在重结晶溶剂中重结晶后得到目标产物b-b。将化合物b-b 1mol、不同碳链长度的碘化物2.5mol和少量哌啶加入至无水乙醇中并在25-75℃的氮气氛围下搅拌24h。反应结束后，旋蒸除去溶剂得粗产物，经石油醚/乙酸乙酯混合溶液中柱层析分离，得到目标aie光敏剂bb0，bb1，bb3，bb5，bb7。
24、bb0 hrms(ems):m/z:[m-2br]+calcd for c78h58n4o3s2,1162.3950,found:1162.3951；
25、bb1 hrms(ems):m/z:[m-2br]+calcd for c80h62n4o3s2,1190.4263,found:1190.4263；
26、bb3 hrms(ems):m/z:[m-2br]+calcd forc84h70n4o3s2,1246.4889,found:1246.4887；
27、bb5 hrms(ems):m/z:[m-2br]+calcd forc88h78n4o3s2,1302.5515,found:1302.5514；
28、bb7 hrms(ems):m/z:[m-2br]+calcd forc92h86n4o3s2,1358.6141,found1358.6144。
29、aie光敏剂cc0-cc7的合成：向三口瓶中加入中间体11-2mol以及c 5-15mol，反应溶剂150ml，向反应液中迅速加入一定量哌啶并于氮气环境下回流反应20-24h。冷却至室温，经石油醚/乙酸乙酯混合溶液中柱层析分离，在重结晶溶剂中重结晶后得到目标产物c-c。将化合物c-c 1mol、不同碳链长度的碘化物2.5mol和少量哌啶加入至无水乙醇中并在25-75℃的氮气氛围下搅拌24h。反应结束后，旋蒸除去溶剂得粗产物，经石油醚/乙酸乙酯混合溶液中柱层析分离，得到目标aie光敏剂cc0，cc1，cc3，cc5，cc7。
30、cc0 hrms(ems):m/z:[m-2br]+calcd for c78h58n4o3s2,1162.3950,found:1162.3951；
31、cc1 hrms(ems):m/z:[m-2br]+calcd for c80h62n4o3s2,1190.4263,found:1190.4263；
32、cc3 hrms(ems):m/z:[m-2br]+calcd forc84h70n4o3s2,1246.4889,found:1246.4887；
33、cc5hrms(ems):m/z:[m-2br]+calcd forc88h78n4o3s2,1302.5515,found:1302.5514；
34、cc7hrms(ems):m/z:[m-2br]+calcd forc92h86n4o3s2,1358.6141,found1358.6144。
35、其中，aie光敏剂aa0-aa7、bb0-bb7、cc0-cc7合成步骤中所述的反应溶剂为乙腈、无水乙醇、dmf中的一种或多种。
36、aie光敏剂aa0-aa7、bb0-bb7、cc0-cc7合成步骤中所述的重结晶溶剂为无水乙醇、丙酮、甲醇中的一种或多种。
37、
38、本发明的第二个目的在于构筑集亲水性、生物相容性、靶向显影、诊疗一体化的近红外纳米给药系统。
39、近红外智能纳米给药系统的构筑方法包括以下步骤：
40、①释药性两亲片段dspe-pegn-dox的合成(合成路线如下图)：将dspe-peg在碱性条件下与4-氯丁醛反应，然后在25-80℃下于抗癌药物阿霉素dox作用，形成dspe-pegn-dox，其中n＝2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000。
41、
42、其中，生物相容肿瘤靶向片段dspe-pegn-crgd采用商业渠道购买n＝2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000。
43、②aie纳米粒子的制备
44、先将dspe-pegn-crgd和dspe-pegn-dox溶解在四氢呋喃中，混合均匀后加入aie光敏剂的四氢呋喃溶液，并将混合物在超声条件下逐滴加入到10ml超纯水中。超声5min后混合物在室温下搅拌过夜蒸发掉其中的有机溶剂。产生的纳米粒子悬浊液使用0.2μm的滤膜过滤获得aie靶向纳米粒子。
45、本发明的第三个目的在于将上述纳米颗粒应用于荧光成像以及癌细胞化学治疗-光动力学治疗。
46、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：首先，在aie分子合成方面，本发明通过引入噻吩、吡啶等片段，调控分子供体与受体结构，合成了系列d-a’-π-a型近红外吡喃酮类aie分子，克服了传统荧光探针分子的acq效应。一方面，荧光光谱落在近红外区域可增加aie分子的细胞渗透性；另一方面，由于辅助吸电子基(a’)的引入，增加了homo-lumo电荷的分离度，有助于促进系间窜越(isc)过程的发生，进而促进活性氧的产生，有利于光动力治疗。此外，将aie分子设计成吡啶盐结构，通过延长吡啶基阳离子部位烷基链的长度来增加光敏剂分子的亲脂性，亲脂的烷基链结合吡啶盐的正电荷可以实现癌细胞线粒体的精准靶向性。
47、其次，在智能纳米给药系统的靶向定位方面，由于该系列纳米颗粒亲油性强，不适用于体内环境，因此引入两亲性载体dspe-pegn-crgd和dspe-pegn-dox共同作为aie光敏剂的壳层结构。一方面，dspe-peg片段的引入增加了纳米微球的亲水性和生物相容性；另一方面，crgd片段具有肽靶向作用，可与癌细胞表面整合素受体结合以精准作用于肿瘤细胞。因此，aie吡啶盐正电荷线粒体锚定作用及亲脂性烷基链修饰连同壳层结构的整合素锚定实现了“壳核双靶向”效果。
48、最后，在治疗效果方面，本发明采用“化学-光动力”双重治疗法实现癌细胞的彻底消灭。将dspe-pegn-dox作为壳层的组成部分，其中的亚胺键可在癌细胞酸性条件下断裂释放出抗癌药物dox以实现化学治疗；另外，对剩余靶向aie纳米微球照射后可产生活性氧，从而实现二次光动力学治疗，弥补了单一疗法的不足并实现了多重治疗的效果，两种方法的协同作用有望实现彻底杀死癌细胞的目的。
1.一组靶向型近红外aie吡啶盐光敏剂，其特征在于，光敏剂aa0-aa7、bb0-bb7及cc0-cc7的结构如下：n＝0,1,3,5,7
2.一种根据权利要求1所述的靶向型近红外aie吡啶盐光敏剂的制备方法，其特征在于，光敏剂aa0-aa7、bb0-bb7及cc0-cc7的制备方法包括：
3.根据权利要求2中所述的靶向型近红外aie吡啶盐光敏剂的制备方法，其特征在于，中间体a、b、c合成步骤中所述的溶剂为四氢呋喃、1,4-二氧六环、乙醚中的一种或多种；中间体a、b、c合成步骤中所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾、乙醇钠中的一种或多种；中间体a、b、c合成步骤中所述醇溶液为乙醇、甲醇、丁醇中的一种或多种。
4.根据权利要求2中所述的靶向型近红外aie吡啶盐光敏剂的制备方法，其特征在于，aie光敏剂aa0-aa7、bb0-bb7、cc0-cc7合成步骤中所述的反应溶剂为乙腈、无水乙醇、dmf中的一种或多种；aie光敏剂aa0-aa7、bb0-bb7、cc0-cc7合成步骤中所述的重结晶溶剂为无水乙醇、丙酮、甲醇中的一种或多种。
5.一种“壳核双靶向”近红外智能纳米给药系统，其特征在于，包含核层结构和壳层结构共同制备的近红外aie靶向纳米粒子，所述核层结构包括靶向型近红外aie吡啶盐光敏剂aa0-aa7、bb0-bb7、cc0-cc7；壳层结构包括生物相容性肿瘤靶向片段dspe-pegn-crgd和释药性两亲片段dspe-pegn-dox。
6.根据权利要求5中所述的“壳核双靶向”近红外智能纳米给药系统，其特征在于，dspe-pegn-crgd和dspe-pegn-dox两片段中的n＝2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000。
7.根据权利要求5-6中任一项所述的“壳核双靶向”近红外智能纳米给药系统，其特征在于，释药性两亲片段dspe-pegn-dox的制备方法包括：将dspe-peg在碱性条件下与4-氯丁醛反应，然后在25-80℃下与抗癌药物阿霉素dox作用，形成dspe-pegn-dox。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的“壳核双靶向”近红外智能纳米给药系统，其特征在于，近红外aie靶向纳米粒子的制备方法包括：先将dspe-pegn-crgd和dspe-pegn-dox溶解在四氢呋喃中，混合均匀后加入aie光敏剂的四氢呋喃溶液，并将混合物在超声条件下逐滴加入到超纯水中；超声后混合物在室温下搅拌过夜蒸发掉其中的有机溶剂，产生的纳米粒子悬浊液使用滤膜过滤获得近红外aie靶向纳米粒子。
9.权利要求5-8任一项所述的“壳核双靶向”近红外智能纳米给药系统在肿瘤细胞成像、抗肿瘤药物的制备以及化学治疗-光动力学诊疗中的应用。
10.一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物包括由核层靶向型近红外aie吡啶盐光敏剂和壳层生物相容性肿瘤靶向片段dspe-pegn-crgd及释药性两亲片段dspe-pegn-dox共同组成的“壳核双靶向”近红外智能纳米给药系统。
