本发明涉及荧光分子探针领域。更具体地说，本发明涉及一种水溶性香豆素fe3+荧光探针及其制备方法和在斑马鱼成像中的应用。
背景技术：
1、fe3+是人体必需的微量元素之一，通常以fe3+或fe2+的形态存在于生命体或自然环境中，其中fe3+在人类生命系统中具有不可代替的重要地位，广泛参与各种生命过程，参与构成了生命体内多种酶和蛋白质，如细胞内rna和dna的合成、生物体中的细胞和氧代谢、酶催化及质子转移等，其过量和缺少都会造成严重的人体机能障碍。同时，研究发现，造成人体中fe3+含量异常的原因之一是环境水中可能存在超标的金属离子，水是维持人体正常生命活动的基本保证，而金属污染进入水循环会直接对人体造成巨大的损害。
2、目前科学家们已经建立了多种用于fe3+离子检测的分析方法，包括火焰原子吸收光谱法(faas)，石墨炉原子吸收光谱法(gfaas)，电感耦合等离子体原子发射光谱法(icp-aes)，电感耦合等离子体质谱法(icp-ms)，比色法等。尽管这些方法均能有效灵敏地定量检测样品中的fe3+离子，然而，这些方法通常存在仪器昂贵，耗时，操作复杂，以及不适用于实时和现场检测等缺点。相比之下，荧光探针具有选择性好、灵敏度高、对设备依赖小、操作简单和成本低等优点，而且其能够与荧光显微镜成像技术结合，实现在活体水平上无损原位的检测，使得荧光探针被认为是最有前景的方法之一。
技术实现思路
1、本发明提供水溶性香豆素fe3+荧光探针，该荧光探针合成简单，结构新颖，水溶性好，应用于检测fe3+离子，具有较好的选择性、灵敏性、检测限低等优点。
2、为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了水溶性香豆素fe3+荧光探针，其具有结构式如下：
3、
4、其中，r为
5、本发明还提供了水溶性香豆素fe3+荧光探针的制备方法，制备上述水溶性香豆素fe3+荧光探针包括步骤如下：
6、步骤一：以对甲苯乙酸和2,4二羟基苯甲醛为起始原料，溶于醋酸酐，加入三乙胺作为催化剂反应，得到乙酰化的香豆素类母核；将乙酰化的香豆素类母核加入甲醇中，缓慢滴加浓盐酸，酸性环境脱去乙酰基即得苯并吡喃酮香豆素中间体(1)；
7、步骤二：以苯并吡喃酮香豆素中间体(1)、溴丙炔和碳酸钾为原料，以乙腈为溶剂通过亲核取代得含炔基的中间体(2)；
8、步骤三：将叠氮氨基酸用叔丁醇溶解后，加入含炔基的中间体(2)，再加入五水硫酸铜、抗坏血酸钠、纯水，采用点击化学的方法合成得水溶性香豆素fe3+荧光探针。
9、优选的是，步骤一具体为：对甲苯乙酸和2,4二羟基苯甲醛用醋酸酐作为溶剂溶解，加入三乙胺作为催化剂反应，反应温度为130-150℃，反应6～8h，反应结束后冷却，重结晶析出得到乙酰化的香豆素类母核；将乙酰化的香豆素类母核加入甲醇中，缓慢滴加浓盐酸，升温至60-65℃反应3-4h，反应结束后抽滤白色透明的固体即得苯并吡喃酮香豆素中间体(1)。
10、优选的是，步骤二的反应温度为55-60℃，反应3-4h；反应结束后过滤，浓缩，乙酸乙酯溶解后依次加入饱和氯化铵、饱和食盐水洗涤，保留有机层加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，即得含炔基的中间体(2)。
11、优选的是，步骤三中的叠氮氨基酸为叠氮亮氨基酸、叠氮缬氨基酸、叠氮氨基丁酸或叠氮苏氨基酸，对应合成得到的水溶性香豆素fe3+荧光探针具有的结构式分别为：
12、
13、优选的是，叠氮氨基酸通过如下步骤制得：叠氮化钠用水溶解加入dcm为溶剂，0℃下滴加三氟甲磺酸酐，3-4h后加入碳酸钾、氨基酸、无水硫酸铜反应3-4h，除去有机溶剂调ph＝2，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥有机层，旋干后得叠氮氨基酸；其中，叠氮化钠：dcm：三氟甲磺酸酐：碳酸钾：氨基酸：无水硫酸铜的摩尔体积比为9.2mmol：15ml：18.4mmol：7.2mmol：9.2mmol：0.92mmol；
14、其中，所述氨基酸为l-亮氨酸、l-缬氨酸、y-氨基丁酸或l-苏氨酸对应得到的叠氮氨基酸分别为叠氮亮氨基酸、叠氮缬氨基酸、叠氮氨基丁酸或叠氮苏氨基酸。
15、优选的是，步骤三的点击化学方法具体为：叠氮氨基酸用叔丁醇溶解后，加入含炔基的中间体(2)、五水硫酸铜、抗坏血酸钠和纯水，升温至55-60℃，反应4-5h，tlc监控反应结束后，直接加入饱和食盐水洗涤，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后柱层析硅胶柱纯化，得水溶性香豆素fe3+荧光探针；其中，所述柱层析硅胶柱纯化采用二氯：甲醇＝40：1；20：1；10：1梯度洗脱。
16、优选的是，所述步骤一中，对甲苯乙酸：2,4二羟基苯甲醛：三乙胺的摩尔比为(1.5～2)：1：(1.5～2)；醋酸酐：甲醇：浓盐酸：2，4二羟基苯甲醛的体积摩尔比为2.5～3ml：2～2.5ml：90～100μl：1mmol；
17、所述步骤二中，苯并吡喃酮香豆素中间体(1)：碳酸钾：溴丙炔：乙腈的摩尔体积比为1～1.2mmol：4～4.8mmol：2.4mmol：15ml；
18、所述步骤三中，叠氮氨基酸：含炔基的中间体：五水硫酸铜：抗坏血酸钠的摩尔比为1：1：0.4：0.85，含炔基的中间体(2)与纯水的摩尔体积比为1mmol：2ml。
19、本发明还提供了水溶性香豆素fe3+荧光探针在斑马鱼成像中的应用。
20、本发明至少包括以下有益效果：
21、1、本发明通过简单步骤即可得到水溶性香豆素fe3+荧光探针，该探针与fe3+离子接触后，荧光强度迅速减弱，显示出“turn-off”模式，实现了对fe3+离子的荧光识别，检测灵敏度高。
22、2、本发明荧光探针对fe3+离子有较好的选择性，与其他常见阳离子，尤其是fe2+
23、离子作用荧光信号基本没有变化，较高的抗干扰能力，反应时间较短，检测限低；还具有在斑马鱼体内观察fe3+的能力，具有在生物体内检测fe3+的潜力。
24、3、本发明荧光探针具有较高的水溶性，水占比达到40％-75％，生物相容性高。
25、本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
1.水溶性香豆素fe3+荧光探针，其特征在于，其具有结构式如下：
2.水溶性香豆素fe3+荧光探针的制备方法，其特征在于，制备如权利要求1所述的水溶性香豆素fe3+荧光探针包括步骤如下：
3.如权利要求2所述的水溶性香豆素fe3+荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤一具体为：对甲苯乙酸和2,4二羟基苯甲醛用醋酸酐作为溶剂溶解，加入三乙胺作为催化剂反应，反应温度为130-150℃，反应6～8h，反应结束后冷却，重结晶析出得到乙酰化的香豆素类母核；将乙酰化的香豆素类母核加入甲醇中，缓慢滴加浓盐酸，升温至60-65℃反应3-4h，反应结束后抽滤白色透明的固体即得苯并吡喃酮香豆素中间体(1)。
4.如权利要求3所述的水溶性香豆素fe3+荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤二的反应温度为55-60℃，反应3-4h；反应结束后过滤，浓缩，乙酸乙酯溶解后依次加入饱和氯化铵、饱和食盐水洗涤，保留有机层加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，即得含炔基的中间体(2)。
5.如权利要求4所述的水溶性香豆素fe3+荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤三中的叠氮氨基酸为叠氮亮氨基酸、叠氮缬氨基酸、叠氮氨基丁酸或叠氮苏氨基酸，对应合成得到的水溶性香豆素fe3+荧光探针具有的结构式分别为：
6.如权利要求5所述的水溶性香豆素fe3+荧光探针的制备方法，其特征在于，所述叠氮氨基酸通过如下步骤制得：叠氮化钠用水溶解加入dcm为溶剂，0℃下滴加三氟甲磺酸酐，3-4h后加入碳酸钾、氨基酸、无水硫酸铜反应3-4h，除去有机溶剂调ph＝2，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥有机层，旋干后得叠氮氨基酸；其中，叠氮化钠：dcm：三氟甲磺酸酐：碳酸钾：氨基酸：无水硫酸铜的摩尔体积比为9.2mmol：15ml：18.4mmol：7.2mmol：9.2mmol：0.92mmol；
7.如权利要求6所述的水溶性香豆素fe3+荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤三的点击化学方法具体为：叠氮氨基酸用叔丁醇溶解后，加入含炔基的中间体(2)、五水硫酸铜、抗坏血酸钠和纯水，升温至55-60℃，反应4-5h，tlc监控反应结束后，直接加入饱和食盐水洗涤，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后柱层析硅胶柱纯化，得水溶性香豆素fe3+荧光探针；其中，所述柱层析硅胶柱纯化采用二氯：甲醇＝40：1；20：1；10：1梯度洗脱。
8.如权利要求2-7任一项所述的水溶性香豆素fe3+荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，对甲苯乙酸：2,4二羟基苯甲醛：三乙胺的摩尔比为(1.5～2)：1：(1.5～2)；醋酸酐：甲醇：浓盐酸：2，4二羟基苯甲醛的体积摩尔比为2.5～3ml：2～2.5ml：90～100μl：1mmol；
9.如权利要求1所述的水溶性香豆素fe3+荧光探针在斑马鱼成像中的应用。
