本发明属于植物生长调节剂，具体涉及壳寡糖接枝玉米醇溶蛋白芸苔素内酯纳米粒子的制备及其抗盐胁迫应用。
背景技术：
1、纳米技术的应用现已进入了农业和食品生产领域，并且在可持续农业中具有潜在的应用前景。纳米材料具有独特的物理化学特性，如体积小、比表面积大、催化活性优良等，因此将纳米材料用于负载农药有利于药物进入植物体内，并发挥稳定的作用。盐胁迫是限制植物生长发育的主要非生物胁迫之一。盐胁迫对植物的细胞分裂和生长发育具有负面的影响，高盐胁迫限制了植物对水分的利用，同时带来了养分吸收不平衡等问题，从而限制了根、茎、叶的生长发育。此外，钠离子也会对养分吸收产生负面的影响，通常会导致养分缺乏。有研究发现，使用外源物质是提高作物对盐胁迫耐受性的可选方法。
2、芸苔素内酯(brassinolide,br)是一种甾醇类化合物，可用于调控植物种子萌发、开花、衰老、抗逆性等。许多研究已证实br在促进植物对抗非生物胁迫上具有积极的作用，如耐盐性、耐砷性、耐低氧性等。br可以调控植物体对土壤中养分的吸收，使得植物能够根据自身需要汲取土壤中的养分，从而在低盐、缺氧等非生物胁迫环境中仍能正常生长。br具有疏水性，易被植物代谢，并且br的施用对植物的生长时期和作用部位有较为严格的要求，因此人为施加br时，难以把握合适的时机及施加量。因此，需要构建稳定的芸苔素内酯纳米载药体系，以实现芸苔素内酯的可控释放，提高芸苔素内酯在植物体内的中靶率和利用率。
3、玉米醇溶蛋白(zein)来源于玉米的麦醇溶蛋白，具有出色的生物相容性和生物降解性，是一种有前途的颗粒递送的候选材料。但是，zein含有较多的疏水性氨基酸，导致其水溶性较差；而且zein的等电点在6.2-6.8，形成的纳米颗粒在中性溶液中不能稳定存在。壳寡糖(chitosanoligosaccharide,cos)是壳聚糖/甲壳素通过化学水解或酶降解(包括脱乙酰和解聚过程)后的主要产物。与壳聚糖相比，cos具有低分子量、较低的粘性和完全的水溶性；同时，由于cos具有丰富的官能团、优异的生物相容性和生物降解性，被广泛用作药物载体。
4、综上，如果能利用zein和cos解决芸苔素内酯(brassinolide，br)溶解性差、易被植物代谢且存在浓度依赖性、生物利用度低等问题，有望提高芸苔素内酯对植物种子发芽和抗盐胁迫性的促进作用。
技术实现思路
1、为了克服上述现有技术的不足，本发明构建了由亲水性多糖壳寡糖(cos)和乙二醇二缩水甘油醚(egde)修饰玉米醇溶蛋白(z-cos)负载芸苔素内酯(br@z-cos)的纳米体系，为开发缓解植物受盐胁迫损害的方法提供了依据。
2、为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
3、本发明第一方面提供了一种壳寡糖接枝玉米醇溶蛋白芸苔素内酯纳米粒子的制备方法，该方法包括以下步骤：
4、s1、将玉米醇溶蛋白(zein)溶于乙醇中，再加入乙二醇二缩水甘油醚(egde)，搅拌溶解后加入壳寡糖(cos)溶液，经透析和干燥得到固体z-cos；
5、s2、先配制芸苔素内酯(brassinolide,br)的乙醇溶液作为br母液，然后z-cos和br母液共同溶于乙醇中，完全溶解后收集有机相，然后在搅拌状态下将有机相加入水中，经搅拌稳定后即得目标产物。
6、本发明将cos修饰到zein上，利用乙二醇二缩水甘油醚(ethylene glycoldiglycidyl ether,egde)来连接zein和cos，构建得到一个具有稳定缓释性能的蛋白质基纳米载体(z-cos)，然后通过反溶剂法负载芸苔素内酯构建具有缓释性能的壳寡糖接枝玉米醇溶蛋白/芸苔素内酯纳米粒子(br@z-cos)，所述br@z-cos的数均分子量(mn)＝1385-1572、分子量分布指数(pdi)＝0.301-0.562。
7、优选地，s1中，所述乙醇为80-85％的乙醇水溶液，所述玉米醇溶蛋白(zein)在乙醇中的浓度为1-2g/50ml。
8、优选地，s1中，所述玉米醇溶蛋白(zein)与乙二醇二缩水甘油醚(egde)的质量比为1-2：0.5-1。
9、优选地，s1中，所述壳寡糖(cos)溶液的浓度为9-11mg/ml，所述壳寡糖(cos)溶液与乙醇的体积比为1-2：5-6。
10、优选地，s1中，所述透析为在分子截留量为4500-7000da的透析袋中透析20-30h。
11、优选地，s2中，所述br母液的浓度为1-2mg/ml，所述z-cos与br母液的用量比为40-60mg：1-3ml。
12、优选地，s2中，所述乙醇为70-75％乙醇水溶液，所述br母液与乙醇的体积比为1-3：4-6。
13、本发明第二方面提供了一种壳寡糖接枝玉米醇溶蛋白芸苔素内酯纳米粒子，由第一方面所述的制备方法制备得到。
14、本发明第三方面提供了第二方面所述的壳寡糖接枝玉米醇溶蛋白芸苔素内酯纳米粒子在制备促进植物生长的制剂中的应用。
15、本发明第三方面提供了第二方面所述的壳寡糖接枝玉米醇溶蛋白芸苔素内酯纳米粒子在制备提高植物耐盐性的制剂中的应用。
16、br在植物体内含量很低，但生理活性很高。有研究发现，br几乎可以在植物的所有组织中复合存在，对植物的正常生长发育具有重要作用，将br应用于调控盐胁迫种子的萌发是目前br的研究热点之一。前人的研究中多为将br及其衍生物单独使用，目前还未有其他研究将br负载于蛋白质基纳米载体上，br在植物体内的作用可根据发育背景导致不同的反应，但其背后的基因调控网络在空间和时间上如何变化尚不清楚。本发明经研究发现，z-cos在水中的溶解度达到了13％，br@z-cos的平均粒径为98nm，pdi值少于0.2。z-cos对br有一定的缓释效果，对br的包封率和载药量分别达到17.81％和6.85μg/mg。进一步研究发现，当br@z-cos的浓度为0.1mg/l时，可以增加植物体内的脯氨酸含量，从而有效缓解盐胁迫下的植株生长发育遭受的损害。
17、优选地，所述植物包括(但不限于)黄瓜。
18、优选地，所述壳寡糖接枝玉米醇溶蛋白芸苔素内酯纳米粒子的使用浓度为0.05-0.5mg/l，更优选0.1mg/l。
19、优选地，所述壳寡糖接枝玉米醇溶蛋白芸苔素内酯纳米粒子的使用方法为：采取浸泡法处理种子，即在室温下振荡浸泡10h以上。或者，采取根部浸泡法处理幼苗，然后再移栽，即对幼苗根部暗处培养12h以上。
20、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
21、为了解决芸苔素内酯(brassinolide，br)溶解性差、易被植物代谢且存在浓度依赖性、生物利用度低等问题，本发明构建了由亲水性多糖壳寡糖(chitosanoligosaccharide,cos)和乙二醇二缩水甘油醚(ethylene glycol diglycidyl ether,egde)修饰玉米醇溶蛋白(z-cos)负载芸苔素内酯(br@z-cos)的纳米体系。所得br@z-cos的平均粒径为98nm，pdi值少于0.2，对br的包封率和载药量分别达到17.81％和6.85μg/mg。zein作为植物生长的营养元素之一，用其负载br后在一定浓度下能与br产生协同作用，可以增加植物体内的脯氨酸含量，从而有效缓解盐胁迫下的植株生长发育遭受的损害。同时，zein载体水溶性的提高可以拓宽其在农业中的应用，br@z-cos小的粒径有利于br更好地进入植物体内并且赋予br缓释作用，提高br的利用率，这为未来蛋白质基纳米载体负载植物激素的研究提供了一定的参考。
1.一种壳寡糖接枝玉米醇溶蛋白芸苔素内酯纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种壳寡糖接枝玉米醇溶蛋白芸苔素内酯纳米粒子的制备方法，其特征在于，s1中，所述乙醇为80-85％的乙醇水溶液，所述玉米醇溶蛋白在乙醇中的浓度为1-2g/50ml。
3.根据权利要求1所述的一种壳寡糖接枝玉米醇溶蛋白芸苔素内酯纳米粒子的制备方法，其特征在于，s1中，所述玉米醇溶蛋白与乙二醇二缩水甘油醚的质量比为1-2：0.5-1。
4.根据权利要求1所述的一种壳寡糖接枝玉米醇溶蛋白芸苔素内酯纳米粒子的制备方法，其特征在于，s1中，所述壳寡糖溶液的浓度为9-11mg/ml，所述壳寡糖溶液与乙醇的体积比为1-2：5-6。
5.根据权利要求1所述的一种壳寡糖接枝玉米醇溶蛋白芸苔素内酯纳米粒子的制备方法，其特征在于，s1中，所述透析为在分子截留量为4500-7000da的透析袋中透析20-30h。
6.根据权利要求1所述的一种壳寡糖接枝玉米醇溶蛋白芸苔素内酯纳米粒子的制备方法，其特征在于，s2中，所述br母液的浓度为1-2mg/ml，所述z-cos与br母液的用量比为40-60mg：1-3ml。
7.根据权利要求1所述的一种壳寡糖接枝玉米醇溶蛋白芸苔素内酯纳米粒子的制备方法，其特征在于，s2中，所述乙醇为70-75％乙醇水溶液，所述br母液与乙醇的体积比为1-3：4-6。
8.一种壳寡糖接枝玉米醇溶蛋白芸苔素内酯纳米粒子，其特征在于，由权利要求1-7任一项所述的制备方法制备得到。
9.权利要求8所述的壳寡糖接枝玉米醇溶蛋白芸苔素内酯纳米粒子在制备促进植物生长的制剂中的应用。
10.权利要求8所述的壳寡糖接枝玉米醇溶蛋白芸苔素内酯纳米粒子在制备提高植物耐盐性的制剂中的应用。
