本发明涉及水质基准定值，更具体的说是涉及一种基于环境核酸的水生生物水质基准定值方法。
背景技术：
1、环境核酸包括环境dna和环境rna，是从生物身体上脱落的碎屑、粘液、鳞片等物质中含有的dna或rna，通过分子生物学方法可以捕获这些环境核酸分子，继而通过高通量测序可以获得环境核酸的丰度，用于表征水生生物的相对丰度。
2、水生生物水质基准是基于水生态毒理学，对污染物对水生生物个体的存活和丰度的影响进行相关性研究，获取的一般保护水平为95％的污染物安全阈值。
3、现有技术耗时费力，需要通过实际测试获得大量的生物毒理学数据，对动物福利不利，且成本很高。比如按照美国的水生生物水质基准方法学，至少需要开展8种不同水生生物的急性和慢性毒性实验，然后利用物种敏感度分布(ssd)模型对数据进行拟合，得到能够保护95％水生生物的污染物安全阈值，就是基准值。完成这些实验需要牺牲数千个水生生物，花费一年以上的时间，以及百万计的试验费用，而在实际工作中，依据上述毒理方法学在研制水质基准时，为了增加基准值的可靠性，往往需要成倍增加测试物种的数量，比如美国的氨氮国家水质基准就采用了67种水生生物的毒性数据，耗费更是惊人，而且依据这些室内实验数据研制的水质基准没有考虑野外的实际情况，没有融合野外的现场实际数据，也是传统方法学的一大欠缺。
4、综上，如何提供一种操作简便、环境友好的水生生物水质基准定值方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明提供了一种基于环境核酸的水生生物水质基准定值方法。本发明实现了以环境友好式的实验观测手段，获取高通量测序的野外现场大数据，基于操作分类单元(otu)敏感性分析，利用野外数据制定的基准阈值更适用于现场情况，现实意义更强。
2、本发明通过采样、测试和生信分析，获取能够代表水生生物的环境核酸信息，并且利用物种敏感度分布模型建立水生生物类群与目标胁迫因子的关系，成本低效率高，解决了传统方法耗时费力成本高的缺点。另外，本发明是基于野外现场数据建立生物与胁迫因子的关系，从而研制出的基准更符合现场实际情况，克服了传统方法仅基于室内毒性实验数据研制基准，所得基准对实际的野外情况适用性受限的问题。
3、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
4、本发明以环境dna的计数单位：操作分类单元(otu)，代替传统的生物个体数量，对污染物生态效应进行表征，进而计算基准阈值。
5、一种基于环境核酸的水生生物水质基准定值方法，包括如下步骤：
6、(1)采集目标水域的环境水样；
7、(2)采用硝酸纤维膜对采集的环境水样进行过滤，保存滤膜；
8、(3)采用核酸提取试剂盒(优选天根或凯杰公司生产的水样中dna提取试剂盒)提取滤膜环境核酸，如果提取的是rna，通过反转录合成dna；
9、(4)设计针对不同类群水生生物的宏条形码基因扩增引物，对各类群水生生物宏条形码基因进行扩增；
10、(5)切胶纯化目的条带，使其dna占比≥50％；
11、(6)将扩增子上机测序，获得高通量测序的原始数据；
12、(7)对原始数据进行清洗，获得clean data，并切除接头、引物，继而进行序列拼接；以97％相似度进行聚类，获得otu的种类数以及每种otu对应的数量；
13、(8)根据区域水环境的特征确定可能的胁迫因子种类，通过检测分析，确定对目标生物群落有重要影响的关键生态胁迫因子；
14、(9)对于每种otu，分别以每个点位检测出的otu数量为y，以对应点位的目标胁迫因子浓度为x，分析确定目标胁迫因子对每种otu的半数效应浓度(ec50)值；
15、(10)以每种otu的ec50的对数值(logec50)为x；对不同种类的otu按照ec50值从小到大进行排序，otu的种类数设为n，不同种的otu的序号设为r，r的数值为从1到n，设y＝r/(n+1)，y代表了otu在不同的胁迫因子浓度下受胁迫的比例；基于逻辑斯谛或正态函数对x和y拟合，构建ssd曲线，建立起生态胁迫因子浓度-otu受胁迫比例的关系；
16、(11)计算y＝0.05时的x值，即为生态胁迫因子的hc5值(5％的物种otu受到胁迫时的胁迫因子浓度)，基准值＝hc5/2。
17、进一步的，所述步骤(1)中每个采样点位的环境水样体积≥2l，采样点位≥10个。
18、所取得的有益效果：每个点位采集2l水样所获得的环境核酸的数量足以覆盖常见的水生生物类群(浮游生物，鱼类，底栖无脊椎生物等)，能够满足基准研制所需。10个采样点位可以保证足够的胁迫因子梯度变化，有利于增加制定基准的可靠性。
19、进一步的，所述步骤(2)中硝酸纤维膜的孔径为0.45μm。
20、所取得的有益效果：孔径为0.45μm的滤膜可以将除细菌等原核微生物之外的其他水生生物的环境核酸全部捕获，包括浮游生物，鱼类，底栖无脊椎生物等，有利于建立更加全面的水生生物—胁迫因子之间的响应关系，提高基准的可靠性。
21、进一步的，所述步骤(2)中将滤膜保存于液氮或者-80℃。
22、进一步的，所述步骤(4)中，
23、针对浮游植物，目标条形码基因为线粒体基因18s的v9区，引物如下：
24、正向引物：tccctgcchtttgtacacac，seq id no:1；
25、反向引物：ccttcygcaggttcacctac，seq id no:2；
26、针对浮游动物，目标条形码基因为线粒体基因18s的v4区，引物如下：
27、正向引物：agggcaakyctggtgccagc，seq id no:3；
28、反向引物：grcggtatctratcgyctt，seq id no:4；
29、针对鱼类，目标条形码基因为线粒体基因12s，引物如下：
30、正向引物：gtcggtaaaactcgtgccagc，seq id no:5；
31、反向引物：catagtggggtatctaatcccagtttg，seq id no:6；
32、针对底栖无脊椎动物，目标条形码基因为coi，引物如下：
33、正向引物：ggdacwggwtgaacwgtwtaycchcc，seq id no:7；
34、反向引物：caaacaaatardggtattcgdty，seq id no:8。
35、所取得的有益效果：选取的上述目标条形码基因都是国际公认的识别物种的标志性基因，其基因序列既有足够的保守性，能够保证对不同物种识别的准确性，又有适当的变异性，能够保证对不同物种的区分度。
36、进一步的，所述步骤(8)采用主成分分析(pca)或冗余分析(rda)方法，根据统计结果，确定对目标生物群落影响贡献较大的胁迫因子。
37、进一步的，所述步骤(8)中关键生态胁迫因子包括水体中氮磷营养物质、重金属、有机污染物、盐度、ph值、温度、硬度、有机碳、悬浮物等。
38、进一步的，所述步骤(10)中构建的ssd曲线的相关系数r2>0.8。
39、若r2<0.8，则重新选择代表性点位进行采样监测和数据分析。
40、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：
41、(1)本发明方法环境友好性，不需要开展毒理学实验，保护了动物福利；
42、(2)本发明方法采用野外现场数据计算基准阈值，结果更具有现实意义；
43、(3)本发明方法方便快捷，克服了传统生态毒理学方法成本高、费时费力的缺点。
1.一种基于环境核酸的水生生物水质基准定值方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中每个采样点位的环境水样体积≥2l，采样点位≥10个。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中硝酸纤维膜的孔径为0.45μm。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(8)采用主成分分析和冗余分析方法。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(8)中关键生态胁迫因子包括水体中氮磷营养物质、重金属、有机污染物、盐度、ph值、温度、硬度、有机碳、悬浮物。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(10)中构建的ssd曲线的相关系数r2>0.8。
