本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于crispr/cas13a的abo血型基因型鉴定方法及所用组合物。
背景技术：
1、卡尔-兰德斯坦纳(karl landsteiner)在20世纪初提出的abo血型是人类发现的第一个血液遗传标记系统。abo基因包含7个外显子和1062个碱基对序列，位于9号染色体9q34.1—34.2处，编码一种糖基转移酶(组织血型abo系统转移酶)，可催化碳水化合物向h抗原的转移。abo血型抗原有三种等位形式，即a、b和o。a等位基因和b等位基因的不同之处在于核苷酸的替换，而o等位基因与a等位基因的不同之处在于261位的鸟嘌呤缺失。从遗传学上讲，每个孩子都从父母那里获得三个等位基因中的一个，从而产生六种可能的基因型(aa、ao、bb、bo、oo和ab)和四种可能的表型(a、b、o和ab)。abo血型系统不仅在输血中很重要，而且还与肿瘤、心血管疾病等有关。此外，abo是一种遗传标记，在关联分析和个体识别中发挥着重要作用。
2、基于簇状规则间距短回文重复的诊断(crispr-dx)测定法已在核酸、小分子、蛋白质和其他靶标的应用中彻底改变了诊断方法。crispr-dx系统由crispr相关(cas)蛋白和设计用于特异性识别靶标的引导rna(grna)分子组成。cas9、cas12和cas13是广泛应用于crispr-dx的cas蛋白。cas9依靠由反式激活crispr rna(tracrrna)和crispr rna(crrna)组成的复杂grna，而cas12和cas13只使用单一的crrna。此外，cas12和cas13还分别对单链dna(ssdna)和rna(ssrna)表现出附带内切酶活性。因此，cas12和cas13已被用于设计许多检测平台。基于cas12的诊断系统受原位相邻基序的限制，从而限制了它们的潜在应用。因此，基于cas13的诊断系统适用于通过检测a、b和o等位基因中的snps来进行abo血型基因分型。
3、abo血型分型有多种方法。血清学血型鉴定方法在临床实践中主要用作金标准。其中，标准抗a和抗b血清用于鉴定受试者红细胞上的抗原，而标准a和b红细胞则用于鉴定受试者血清中的抗体。血清学分型很简单，但需要可靠的分型抗血清，而且需要抽血，不适合其他来源的样本。随着分子生物学技术的发展，越来越多的技术被用于abo血型分型，包括pcr-限制性片段长度多态性、pcr-单链构象多态性、pcr-扩增产物长度多态性、消耗等位基因特异性引物分析、诱变分离pcr、实时定量pcr、dna芯片和测序。然而，由于电泳、复杂的酶裂解或探针的精密设计等原因，这些检测也可能耗费大量时间，并可能需要专业人员和笨重、精密的仪器。因此，有必要根据a、b和o等位基因之间的单核苷酸多态性(snps)来可靠地确定abo血型基因型。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是如何快速高效的鉴定abo血型基因型。
2、为了解决上述问题，本发明提供了用于血型基因分型检测的组合物。
3、本发明提供的用于血型基因分型检测的组合物，包含特异于待检测核酸的引物组a和引物组b、特异于待检测核酸的crrna组1和crrna组2、cas13a蛋白和荧光报告探针；所述引物组a由引物abo-6-t7-f1、引物abo-6-r1组成；所述引物组b由引物abo-7-t7-f1、引物abo-7-r1组成；所述crrna组1由crrna-6-261-g2、crrna-6-261-d3组成；所述crrna组2由crrna-7-796-c1、crrna-7-796-a3组成；所述荧光报告探针是一端连有荧光基团，另一端连有淬灭基团的单链rna；
4、所述引物abo-6-t7-f1为如下(b1)或(b2)：
5、(b1)序列表的序列2所示的单链dna分子；
6、(b2)将序列2经过核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的dna分子；
7、所述引物abo-6-r1为如下(b3)或(b4)：
8、(b3)序列表的序列7所示的单链dna分子；
9、(b4)将序列7经过核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的dna分子；
10、所述引物abo-7-t7-f1为如下(b5)或(b6)：
11、(b5)序列表的序列19所示的单链dna分子；
12、(b6)将序列19经过核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列19具有相同功能的dna分子；
13、所述引物abo-7-r1为如下(b7)或(b8)：
14、(b7)序列表的序列27所示的单链dna分子；
15、(b8)将序列27经过核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列27具有相同功能的dna分子；
16、所述待检测核酸的crrna-6-261-g2为如下(c1)或(c2)：
17、(c1)序列表的序列13所示的单链dna分子；
18、(c2)将序列13经过核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13具有相同功能的dna分子；
19、所述待检测核酸的crrna-6-261-d3为如下(c3)或(c4)：
20、(c3)序列表的序列17所示的单链dna分子；
21、(c4)将序列17经过核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相同功能的dna分子；
22、所述待检测核酸的crrna-7-796-c1为如下(c5)或(c6)：
23、(c5)序列表的序列35所示的单链dna分子；
24、(c6)将序列35经过核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列35具有相同功能的dna分子；
25、所述待检测核酸的crrna-7-796-a3为如下(c7)或(c8)：
26、(c7)序列表的序列40所示的单链dna分子；
27、(c8)将序列40经过核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列40具有相同功能的dna分子；
28、所述荧光报告探针的单链rna的核苷酸序列为序列表中的序列fam-uuuuu-bhq1。
29、上文中，所述组合物还包括进行核酸扩增的试剂。
30、本发明还提供了用于血型基因分型检测的试剂盒，所述试剂盒包括前文所述的组合物。
31、在一个具体的实施例中，所述试剂盒的成分包含如下：可只由特异于待检测核酸的crrna、cas13蛋白和荧光报告探针组成；也可含有下述至少一种物质：cas13蛋白、t7 rna聚合酶、rna酶抑制剂、rntp、rna报告探针、向导rna、引物组a和引物组b、cas13a缓冲液。
32、(1)具体地，所述cas13蛋白为lwacas13a蛋白，浓度为5-50pmol/μl，优选10pmol/μl。
33、(2)具体地，所述t7 rna聚合酶浓度为10-100u/μl，优选50u/μl。
34、(3)具体地，所述rntp浓度为5-50mm，优选25mm。
35、(4)具体地，所述rna报告探针的荧光基团可为fam、rox、hex、cy3、cy5等，所述淬灭基团为bhq1、bhq2、bhq3等；所述单链rna探针按照本领域常规方法制备，序列可为5’-uuuuu-3’等；使用浓度为10-200μm。
36、本发明中，所述crrna可通过商业途径合成购买得到，也可通过体外转录法制备得到。
37、所述通过体外转录产生的crispr crrna反应中含有5-200μm合成的带有上游t7启动子的ssdna模板、5-200μm t7-3g ivt引物和1×标准taq缓冲液，在90-95℃下变性3-10分钟，然后在pcr热循环仪中以0.8-0.15℃/s的斜率在4-12℃下梯度退火。
38、所述通过体外转录产生的crispr crrna使用rna合成试剂盒在36-38℃下转录产物过夜。
39、所述通过体外转录产生的crispr crrna产物经dnase i处理后，按照生产商的说明使用进行纯化。纯化的crrna进行定量，将生成的crrna储存在-20℃-80℃。
40、本发明还提供了前文所述的组合物在如下任一中的应用：
41、a1)制备用于鉴定或鉴别血型基因分型的产品；
42、a2)鉴定血型基因分型。
43、本发明还提供了前文所述的试剂盒在如下任一中的应用：
44、a1)制备用于鉴定或鉴别血型基因分型的产品；
45、a2)鉴定血型基因分型。
46、本发明还提供了前文所述的crrna组1和crrna组2。
47、本发明还提供了前文所述的引物组a或引物组b。
48、本发明还提供了一种血型基因分型的检测方法，所述方法包括如下步骤：
49、a1)提取待测样本dna；
50、a2)以所述cdna为模板，利用前文所述的引物组a和引物组b进行pcr扩增，得到扩增产物；
51、a3)利用crispr-cas13a检测体系对所述扩增产物进行检测；所述crispr/cas13a检测体系包括前文所述的组合物中的crrna组1和crrna组2。
52、上述方法中，所述引物组a和引物组b的含量配比为2:8。
53、上述方法中，所述crispr-cas13a检测体系还包括cas13a蛋白、cas13a缓冲液和荧光报告探针。
54、a2)所述pcr扩增的反应体系包含master pcr混合液25μl、上游引物1-5μl、下游引物1-5μl、dna样品1-15μl和无核酸酶水，共50μl。
55、所述pcr的反应体系在以下条件下进行：98℃5s-30s,55℃5s-30s，68℃5s-30s(30-40个循环)。
56、所述引物组a扩增获得的所述pcr扩增产物的核苷酸序列为序列表中序列1。
57、所述引物组b扩增获得的所述pcr扩增产物的核苷酸序列为序列表中序列18。序列18中，m表示a或c。
58、a3)所述的crispr-cas13a检测体系包含如下：1-5μl pcr扩增产物、2μl 10×cas13a缓冲液、0.5-1μl rntps(25mm/种)、0.1-0.5μl l ssrna报告探针(100μm)、0.1-0.5μl cas13a核酸酶(10pmol/μl)、0.5-1μl t7 rna聚合酶(50u/μl)、0.2-1μl rnase抑制剂(40u/μl)和0.1-1μl crrna(1μm)。其中4个crrna(6-261-g2、6-261-d3、7-796-c1和7-796-a3)分别加入上述体系中，即每个步骤二获得的pcr扩增产物均进行四次crispr/cas13a反应(每次反应对应不同crrna，其他均相同)。
59、所述cas13a核酸酶，cas13酶缓冲液，t7 rna聚合酶，rntps，rnase抑制剂可由商业途径购买得到，其浓度可为cas13a核酸酶(10pmol/μl)，cas13缓冲液10×，t7 rna聚合酶(50u/μl)，rntps混合液(25mm/种)，rnase抑制剂(40u/μl)。
60、在一个具体的实施方式中，所述crispr-cas13a检测体系具体可为：1μl a2)所述扩增产物、2μl 10×cas13a缓冲液、0.8μl rntps(25mm/种)、0.2μl ssrna报告探针(100μm)、0.2μl cas13a核酸酶(10pmol/μl)、0.8μl t7 rna聚合酶(50u/μl)、0.5μl rnase抑制剂(40u/μl)和0.5μl crrna(1μm)。其中4个crrna(6-261-g2、6-261-d3、7-796-c1和7-796-a3)分别加入上述体系中，即每个步骤二获得的pcr扩增产物均进行四次crispr/cas13a反应(每次反应对应不同crrna，其他均相同)。
61、所述crispr/cas13a检测反应在36-38℃下使用abi 7500检测10min-1h，在循环过程中自动读取每个反应的荧光强度，并使用7500软件v2.340分析光学数据。
62、所述报告探针为ssrna，长度为5-15nt，优选5nt；5’端修饰荧光基团，优选6-fam基团；3’端修饰猝灭基团，优选bhq1。
63、上述检测方法的结果判定标准如下，在含有crrna-6-261-g2、crrna-6-261-d3、crrna-7-796-c1、crrna-7-796-a3的4管crispr/cas13a反应中：
64、1)如果所述crispr/cas13a(crrna-6-261-g2)反应检测到fam荧光信号，crispr/cas13a(crrna-6-261-d3)反应未检测到fam荧光信号，crispr/cas13a(crrna-7-796-c1)反应检测到fam荧光信号，且crispr/cas13a(crrna-7-796-a3)反应未检测到fam荧光信号，则血型基因分型为aa；
65、2)如果所述crispr/cas13a(crrna-6-261-g2)反应检测到fam荧光信号，crispr/cas13a(crrna-6-261-d3)反应检测到fam荧光信号，crispr/cas13a(crrna-7-796-c1)反应检测到fam荧光信号，且crispr/cas13a(crrna-7-796-a3)反应未检测到fam荧光信号，则血型基因分型为ao；
66、3)如果所述crispr/cas13a(crrna-6-261-g2)反应检测到fam荧光信号，crispr/cas13a(crrna-6-261-d3)反应未检测到fam荧光信号，crispr/cas13a(crrna-7-796-c1)反应未检测到fam荧光信号，且crispr/cas13a(crrna-7-796-a3)反应检测到fam荧光信号，则血型基因分型为bb；
67、4)如果所述crispr/cas13a(crrna-6-261-g2)反应检测到fam荧光信号，crispr/cas13a(crrna-6-261-d3)反应检测到fam荧光信号，crispr/cas13a(crrna-7-796-c1)反应检测到fam荧光信号，且crispr/cas13a(crrna-7-796-a3)反应检测到fam荧光信号，则血型基因分型为bo；
68、5)如果所述crispr/cas13a(crrna-6-261-g2)反应检测到fam荧光信号，crispr/cas13a(crrna-6-261-d3)反应未检测到fam荧光信号，crispr/cas13a(crrna-7-796-c1)反应检测到fam荧光信号，且crispr/cas13a(crrna-7-796-a3)反应检测到fam荧光信号，则血型基因分型为ab；
69、6)如果所述crispr/cas13a(crrna-6-261-g2)反应未检测到fam荧光信号，crispr/cas13a(crrna-6-261-d3)反应检测到fam荧光信号，crispr/cas13a(crrna-7-796-c1)反应检测到fam荧光信号，且crispr/cas13a(crrna-7-796-a3)反应未检测到fam荧光信号，则血型基因分型为oo。
70、上述应用或方法为非疾病诊断的应用或方法。上述应用或方法不以获得有生命的人体或动物体的疾病诊断结果或健康状况为直接目的。
71、本发明提出了crispr/cas13a介导的abo血型基因分型技术，通过检测a、b和o等位基因中的snps。选择外显子6-261位点(g代表a/b等位基因，del代表o等位基因)和外显子7-796位点(c代表a/o等位基因，a代表b等位基因)来确定abo血型的六种基因型(aa、ao、bb、bo、oo和ab)。
72、本发明提出的crispr/cas13a系统可在60分钟内特异性区分a、b和o等位基因的外显子6-261的snp位点和外显子7-796的snp位点，以50pg/反应的检测限完成可靠的abo血型基因分型，不需要抽血，无需专业人员和笨重精密的仪器。本发明提出的方法适用于检测六种基因型的口腔拭子样本，进一步验证了其可靠性，结果与血清学方法和测序方法进行了比较，准确率为100％。因此，crispr/cas13a介导的检测方法在可靠鉴定abo血型基因型方面显示出巨大的应用潜力。
1.用于血型基因分型检测的组合物，其特征在于，所述组合物包含特异于待检测核酸的引物组a和引物组b、特异于待检测核酸的crrna组1和crrna组2、cas13a蛋白和荧光报告探针；所述引物组a由引物abo-6-t7-f1、引物abo-6-r1组成；所述引物组b由引物abo-7-t7-f1、引物abo-7-r1组成；所述crrna组1由crrna-6-261-g2、crrna-6-261-d3组成；所述crrna组2由crrna-7-796-c1、crrna-7-796-a3组成；所述荧光报告探针是一端连有荧光基团，另一端连有淬灭基团的单链rna；
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述组合物还包括进行核酸扩增的试剂。
3.用于血型基因分型检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的组合物。
4.权利要求1或2所述的组合物在如下任一中的应用：
5.权利要求3所述的试剂盒在如下任一中的应用：
6.权利要求1或2中所述的crrna组1和crrna组2。
7.权利要求1或2中所述的引物组a或引物组b。
8.一种血型基因分型的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述引物组a和引物组b的含量配比为2:8。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述crispr-cas13a检测体系还包括cas13a蛋白、cas13a缓冲液和荧光报告探针。
