本技术涉及生物材料，特别涉及一种胶原基质生物膜制备方法、胶原基质生物膜及其应用。
背景技术：
1、针对牙周软组织不足的问题，最常采用的治疗办法为牙周软组织增量手术。但是，软组织增量手术所需软组织往往来源于自体游离龈瓣/结缔组织瓣，具有来源有限，术后患者反应较大，手术范围较窄，对此，关于软组织替代材料的研发热度居高不下。
2、现有技术中，以alloderm和mucoderm为代表的脱细胞真皮基质(acellulardermal matrix，adm)、以mucograft为代表的异种胶原基质(xenogeneic collagenmatrix，xcm)等的软组织替代材料最具代表性。尽管证据显示adm是最接近结缔组织移植物(connective tissue graft,ctg)的移植替代品，但长期随访结果显示，使用adm获得的治疗效果存在牙龈边缘稳定性不佳的缺点，可能与其不具有诱导上皮细胞角化的能力有关。xcm在国内已有上市产品，产品名称为胶原基质生物膜mucograft，其具有双层结构，一层为致密结构，强度高可缝合，并允许在开放愈合环境下保护伤口，第二层结构是由胶原蛋白纤维浆料冻干形成的多孔的胶原蛋白海绵，有利于稳定血凝块。为了避免引入额外交联物质，保证产品的生物相容性，mucograft采用了未交联设计(ep1252903b1)。从生物学角度出发，和自体结缔组织移植物一样，xcm的目的是维持空间，以便于从周围软组织迁移来的成纤维细胞定植，然后基质会被逐渐吸收，并被自体软组织取代。口腔结缔组织中的牙龈细胞在咀嚼、言语、牙齿运动和正畸治疗过程中受到复杂的机械力，特别是在外科手术后的伤口愈合过程中，可能会产生内力和外力，对新形成的组织产生压力。由此，移植替代物的体积稳定性是非常重要的，也意味着材料的交联是必需的。
3、通过对mucograft产品的分析，我们发现其海绵层是通过纯化后的胶原纤维浆料经冷冻干燥制作而成，由于没有交联结构，其生物稳定性和机械性能差，尤其是在吸水后海绵层的纤维间连接强度明显降低，施加压力会有溃散现象。因此在口腔复杂运动过程中，会对血凝块的稳定性造成不利影响。针对mucograft产品的局限性，研究者在原有产品基础上增加交联，进一步开发了第二代材料，其具有厚型的单层海绵结构，采用化学交联的方法使具有非常好的体积稳定性(申请号201580067861.4)。由于采用单层海绵结构，没有致密层的强度支撑，使得缝合强度低，不能满足临床上的缝合要求。另外，化学交联剂的引入(比如戊二醛、edc、edc-nhs)会使得生物相容性降低，对软组织愈合造成不利影响，影响组织整合。
4、正如h.mathes等人在“a bioreactor test system to mimic the biologicaland mechanical environment of oral soft tissues and to evaluate substitutesfor connective tissue gafts”一文中指出，软组织增量产品需尽可能达到机械稳定性(高交联度)与平稳软组织愈合(低交联度)之间的平衡，才能取得最佳的软组织修复效果。
5、而增强胶原材料的最佳方法是引入交联结构，主要分为物理交联和化学交联，物理交联不引入额外化学物质，但是存在交联不均匀，交联度低的问题；化学交联虽然可以改善胶原材料的体积稳定性，同时延长其降解时间，但是残留交联剂往往会引起周围组织炎症反应，并且随着材料降解，也会释放出交联剂持续刺激周围组织，不利于组织愈合。而且，化学交联往往获得过高的交联度，使得材料降解缓慢，有文献研究指出，降解时间的过分延长会对组织愈合产生不利影响。
6、对此，关于如何取得最佳的软组织修复效果的研究一直在持续中，例如以下相关专利：
7、中国发明专利(申请号202210620404.5)公开了一种口腔修复膜及其制备方法，包括复合细胞外基质层和设置于所述复合细胞外基质层上的胶原蛋白海绵层，其中胶原蛋白海绵层由粉碎后的细胞外基质粉或纯化后胶原蛋白粉制得的胶原蛋白凝胶经冷冻干燥制得。其中细胞外基质粉或纯化后胶原蛋白粉经蛋白酶消化及提纯制得，因此破坏了材料的天然交联结构，影响了材料的强度。另外，其未经交联处理，材料吸水后会塌陷，体积稳定性较差。
8、中国发明专利申请号202310655636.9公开了一种猪腹膜脱细胞基质海绵支架及其制备方法，通过对猪腹膜脱脂、脱细胞，经粉碎、酶解、纯化、交联等过程制备得到海绵支架，其使用蛋白酶的对脱细胞后的基质进行消化处理，破坏了胶原纤维的天然交联结构，降低了材料的整体强度，使得降解速率过快；而且又使用了化学交联增强材料强度，降低了材料的生物相容性。
9、中国发明专利(申请号202211143378.8)公开了一种湿态体积稳定的胶原基质瓣及其制备方法，向海藻酸钠溶液中加入高碘酸钠，反应制备氧化海藻酸钠再向胶原溶液中逐滴加入氧化海藻酸钠溶液，引入化学交联，再通过透析冻干得到具有优异的湿态体积稳定性能的胶原基质瓣。其材料制备过程中引入多步化学反应及额外组分，增加了实际应用中的风险。
10、综上，现有技术无法获得兼具体积稳定性和平稳软组织愈合性能的修复材料，大都存在体积稳定性差、降解速率过快或者生物相容性低的缺点。另一方面，由于目前国产胶原蛋白海绵产品无法达到长时间体积稳定要求，临床应用的软组织替代材料大多来源于国外，价格非常昂贵，增加了患者的经济负担。
11、因此，迫切地需要开发一种体积稳定性更佳且兼具生物相容性的的软组织增量生物替代材料，不仅能够缩短手术时间、减少术后并发症，更期望达到与应用自体软组织移植物相当甚至更佳的临床治疗疗效。
技术实现思路
1、有鉴于此，本技术的目的在于提供一种胶原基质生物膜制备方法、胶原基质生物膜及其应用，以解决现有技术中存在的软组织增量生物替代材料体积稳定性差，力学强度差，材料易变性，难以与患者伤处充分匹配的缺点。
2、本发明提供了一种胶原基质生物膜的制备方法，包括：
3、s1：制备具有致密结构的脱细胞基质层；
4、s2：制备胶原悬液；
5、s3：将胶原悬液挤压注入至模具中成型后，对脱细胞基质层进行润湿处理，将润湿的脱细胞基质层平铺于胶原悬液表面，轻压挤出气泡，静置使脱细胞基质层与胶原悬液紧密结合；
6、s4：将紧密结合的脱细胞基质层与胶原悬液冷冻干燥，得到复合冻干层；
7、s5：将复合冻干层进行物理交联，得到胶原基质生物膜。
8、进一步地，所述具有致密结构的脱细胞基质层为多层复合脱细胞基质层，其中，s1进一步包括以下步骤，
9、s11脱细胞：将天然来源的动物组织经前处理、病毒灭活、脱脂、脱细胞、干燥制备得到脱细胞基质；
10、s12复合：将2-6层的脱细胞基质进行真空压制复合，得到多层复合脱细胞基质层。
11、进一步地，所述具有致密结构的脱细胞基质层为重组脱细胞基质层，其中，s1进一步包括以下步骤，
12、s101脱细胞：将天然来源的动物组织经前处理、病毒灭活、脱脂、脱细胞、干燥制备得到脱细胞基质；
13、s102粉碎：通过低温研磨将脱细胞基质粉碎至粒径为0.2mm-2mm的不规则颗粒，并悬浮于纯水中，使脱细胞基质颗粒的质量百分比为0.5％-3.0％，用酸调节ph值至2.5-3.0，使脱细胞基质颗粒充分溶胀，得到脱细胞基质悬浮液；
14、s103脱水：在脱细胞基质悬浮液中加入氯化钠粉末，至氯化钠浓度达到2.0-2.5mol/l，得到白色盐析沉淀物；将白色盐析沉淀物用有机溶剂浸泡脱水0.5-2h后，用pbs缓冲液漂洗，去除有机溶剂，得到胶原纤维；
15、s104分散：将胶原纤维悬浮于pbs缓冲液中，使胶原纤维质量百分比为0.1％-6％，通过机械搅拌获得分散均匀且蓬松的胶原纤维悬浮液；
16、s105成膜：将胶原纤维悬浮液通过真空抽滤装置，使胶原纤维均匀截留在0.8μm孔径的滤膜上，继续抽滤至胶原纤维呈干燥半透明膜状，剥离得到厚度为0.1-0.5mm的重组脱细胞基质层。
17、进一步地，所述胶原悬液由凝胶状胶原液和胶原纤维液制备而成，将5-30份凝胶状胶原液和70-95份胶原纤维液混合，搅拌均匀并真空除泡，得到胶原悬液。
18、进一步地，所述凝胶状胶原液的制备步骤，包括：
19、s201脱细胞：将天然来源的动物组织经前处理、病毒灭活、脱脂、脱细胞、干燥制备得到脱细胞基质；
20、s202粉碎：将脱细胞基质剪碎后悬浮于纯水中，使脱细胞基质的质量百分比为0.5％-3.0％，用酸调节ph至3.0-4.0，用组织捣碎机将脱细胞基质粉碎至凝胶状，得到凝胶状胶原液。
21、进一步地，所述胶原纤维液的制备步骤，包括：
22、s211脱细胞：将天然来源的动物组织经前处理、病毒灭活、脱脂、脱细胞、干燥制备得到脱细胞基质；
23、s212粉碎：通过低温研磨将脱细胞基质粉碎至粒径为0.2mm-2mm的不规则颗粒，并悬浮于纯水中，使脱细胞基质颗粒的质量百分比为0.5％-3.0％，用酸调节ph值至2.5-3.0，使脱细胞基质颗粒充分溶胀，得到脱细胞基质悬浮液；
24、s213脱水：在脱细胞基质悬浮液中加入氯化钠粉末，至氯化钠浓度达到2.0-2.5mol/l，得到白色盐析沉淀物；将白色盐析沉淀物用pbs缓冲液清洗，离心获得浓缩的胶原纤维；
25、s214分散：将胶原纤维置于ph至3.0-4.0的酸中，使胶原纤维质量百分比为1％-6％，通过机械搅拌使胶原纤维呈现轻微溶胀的均匀分散状，得胶原纤维液。
26、进一步地，所述天然来源的组织包括猪或牛小肠粘膜下层、猪或牛腹膜、猪或牛心包膜、猪或牛膀胱、猪或牛真皮。
27、进一步地，所述有机溶剂包括乙醇、丙酮、乙醚、异丙醇。
28、进一步地，在步骤s3中的润湿的脱细胞基质层通过将脱细胞基质层放入ph为3.0-4.0的酸中浸泡10-30min获得。
29、进一步地，所述酸包括盐酸、醋酸、柠檬酸。
30、进一步地，步骤s5中的所述物理交联为梯度热交联，采用将复合冻干层放入真空箱中，抽真空至小于-100kpa，在25℃-30℃保持1h-2h；梯度升温交联，升温到80℃-85℃，保温2-3h；继续升温到100℃-105℃，保温2-3h；升温至120℃-125℃，保温24-48h。
31、本发明还提供了一种胶原基质生物膜，由上述的制备方法制备得到。
32、本发明还提供了一种胶原基质生物膜的应用场景，包括将根据上述的制备方法制得的胶原基质生物膜应用在如下任意一种或多种的场景中：口腔科引导骨组织再生、口腔科软组织增量、防止组织粘连、慢性伤口修复。
33、本发明的有益效果：
34、本发明提供的一种胶原基质生物膜通过选用天然来源动物组织为原料制备脱细胞基质，再通过对脱细胞基质进一步加工，获得具有致密层和疏松海绵层双层结构的胶原基质生物膜。
35、(1)致密层根据动物组织来源不同，对结构进行了匹配设计；当选用猪或牛的小肠、猪或牛膀胱组织时，致密层采用多层复合脱细胞基质层的设计，改善了致密层的力学强度和降解性。当选用猪或牛腹膜、猪或牛心包膜、猪或牛真皮时，致密层采用重组脱细胞基质层的设计，对降解性进行了改善并保持了一定的力学强度。
36、(2)疏松层通过胶原悬液冻干，胶原悬液由凝胶状胶原液和胶原纤维液获得，由脱细胞基质进一步加工获得。其中，凝胶状胶原液是通过对脱细胞基质充分粉碎而制成的一种粘弹性的凝胶态体系，体系均一且存在更多的物理缠结，冻干后可以获得孔结构比较均一的结构，但是由于破坏了大部分纤维间的天然连接，使得其力学强度低，易降解；而胶原纤维液制备中使用的脱细胞基质颗粒较大，保持了更多的天然结构，力学强度高，降解时间较长。但是胶原纤维液是一个不稳定的分散体系，当把胶原纤维液单独制备成冻干海绵后，海绵结构不均匀，且吸水后容易溃散，这是因为胶原纤维间的作用强度低所致。因此，我们将凝胶状胶原液和胶原纤维液按照一定比例混合，其中凝胶状胶原液也起到了一种增稠剂或粘结剂的作用，增强胶原纤维间的相互作用，使最终得到的海绵结构兼具力学性能和均匀孔结构的性能，吸液后不容易发生溃散现象。同时，凝胶状胶原液的加入也会使得致密层和疏松海绵层之间的连接更加紧密。
37、(3)在制备过程中，将润湿的脱细胞基质层平铺于胶原悬液表面，轻压挤出气泡，静置使脱细胞基质层与胶原悬液紧密结合。凝胶状胶原液的加入，使胶原悬液粘性增强，使脱细胞基质层与胶原悬液间产生更多的物理缠结作用力，致密层与疏松海绵层主要通过物理缠结和氢键作用紧密结合在一起。
38、(4)胶原基质生物膜经过了物理交联处理，增加了胶原纤维间的相互作用，使胶原基质生物膜的体积稳定性更佳，又保证了良好的生物相容性。本发明中经过合理设计并加工的胶原基质膜，克服了现有技术中生物稳定性和机械性能差的缺点，经过物理缠结和物理交联处理的胶原基质生物膜吸水后也具有稳定的力学性能，施加压力后没有肉眼可见的溃散现象。本发明中的胶原基质膜是一种体积稳定性更佳且兼具生物相容性的的软组织增量生物替代材料，能更好的与患者伤处匹配，促进愈合。
1.一种胶原基质生物膜制备方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的胶原基质生物膜制备方法，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的胶原基质生物膜制备方法，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的胶原基质生物膜制备方法，其特征在于：
5.根据权利要求4所述的胶原基质生物膜制备方法，其特征在于：
6.根据权利要求4所述的胶原基质生物膜制备方法，其特征在于：
7.根据权利要求3或6中任一所述的胶原基质生物膜制备方法，其特征在于：
8.根据权利要求3所述的胶原基质生物膜制备方法，其特征在于：
9.根据权利要求1所述的胶原基质生物膜制备方法，其特征在于：
10.根据权利要求3或5或6或9中任一项所述的胶原基质生物膜制备方法，其特征在于：
11.根据权利要求1所述的胶原基质生物膜制备方法，其特征在于：
12.一种胶原基质生物膜，其特征在于：
13.一种胶原基质生物膜的应用，其特征在于，包括：
