本发明涉及递送人vegf受体融合蛋白的基因递送载体，特别是重组腺相关病毒。本发明还涉及所述人vegf受体融合蛋白，编码该融合蛋白的核酸、包含该核酸的载体、以及包含该载体的宿主细胞。本发明还涉及表达所述人vegf受体融合蛋白的表达盒，用于形成所述重组腺相关病毒的重组质粒。本发明还涉及上述基因递送载体、融合蛋白、核酸、载体、宿主细胞、表达盒和重组质粒在治疗vegf导致的疾病，特别是眼科疾病中的用途以及使用它们治疗所述疾病的方法。
背景技术：
1、vegf(血管内皮细胞生长因子)在多种眼病的发病机制中起着主要的作用，发病时，眼内vegf浓度增加，产生不正常的、非常容易出血的新生血管，继而发生大量出血、纤维增殖、牵拉性视网膜脱离、新生血管性青光眼等严重并发症，也可能引起明显的血管渗漏，导致组织持续严重水肿。此类眼科疾病，包括：渗出性(湿性)老年黄斑变性(amd)、糖尿病视网膜病变(dr)合并黄斑水肿(dme)、视网膜静阻塞(rvo)合并黄斑水肿(me)、中心性渗出性脉络膜视网膜病变、息肉状脉络膜血管病变(pcv)、高度近视继发脉络膜新生血管病变、其他疾病继发的黄斑脉络膜新生血管(cnv)等。其中，wamd和dme发病率相对较高，更为常见。
2、基于中和vegf的机理，目前已上市了多款用于眼科的抑制血管新生的抗体药物，如雷珠单抗(ranibizumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、阿柏西普(aflibercept)、康柏西普(conbercept)等。其中，阿柏西普是一种可溶性、全人源化的融合蛋白，由人vegfr1的ig结构域2、人vegfr2的ig结构域3和人igg1的铰链-fc区组成，可以充当诱饵受体，与vegf-a、vegf-b及胎盘生长因子(plgf)结合，阻止其与受体结合及阻断其下游生物学效应。目前该药物已广泛应用于眼科疾病的临床治疗，fda已先后批准了阿柏西普在多个适应症的临床应用，包括wetamd、rvo、dme等。
3、这些药物在治疗与血管新生有关的眼科疾病上取得了成功。但是，现有眼科抗vegf疗法也有不足：在通常情况下，抗vegf的药物治疗是目前适合wamd和dme的一线治疗方案，多个抗vegf药物，如雷珠单抗、康柏西普和阿柏西普普遍获批上市。目前这些一线抗vegf药物均为抗体类大分子药物。这类药物代谢周期和半衰期较短，不能在体内长期发挥药效，因此需要对病人玻璃体腔频繁注射给药。以阿柏西普为例，针对新生血管性amd治疗的推荐给药方案为初始3个月每月玻璃体腔注射给药1次(2mg/次)后每8周玻璃体腔注射给药1次，即3+每8周方案；或者初始3个月每月玻璃体腔注射给药1次(2mg/次)，之后采取治疗-延长给药(treat and extend，t&e)，即3+t&e方案。现有的治疗手段因其较高的给药频率，加重了病人负担，对用药依从性也提出了更严格的要求。
技术实现思路
1、通过基因递送载体(如，腺相关病毒、腺病毒、慢病毒、脂质纳米颗粒等)的方式将编码药物蛋白(如，抗体药物、融合蛋白药物等)分子的基因靶向递送至发病部位，可以直接在体内长期高效表达药物蛋白，可以在病人体内长期稳定发挥疗效，减少给药频率，理论上甚至能做到一次给药长期有效的效果，从而切实减轻病患负担。
2、本发明对阿柏西普蛋白分子中的人igg1-fc片段进行yte
3、(m252y/s254t/t256e)定点突变改造，以获得改造的阿柏西普蛋白药物分子(简称“fc-yte-阿柏西普”或“fc-yte-aflibercept”)，并通过基因递送载体编码该fc-yte-阿柏西普蛋白分子基因的方式，获得基因治疗药物(简称“raav-fc-yte”或“raav-fc-yte-阿柏西普”)。发明人惊人地发现，该基因治疗药物在不改变药物分子在靶组织中的表达水平和表达分布的情况下，可显著提高对目标疾病的治疗效果。
4、因此，在一个方面，本发明提供一种基因递送载体，其包含核酸，所述核酸包含表达人vegf受体融合蛋白的表达盒，其中所述人vegf受体融合蛋白包含人vegfr1的免疫球蛋白样结构域2、人vegfr2的免疫球蛋白样结构域3和人免疫球蛋白的铰链-fc结构域；并且所述人免疫球蛋白的铰链-fc结构域根据eu编号包含m252y、s254t和t256e取代。
5、在一些实施方式中，所述人vegf受体融合蛋白进一步包含人vegfr2的免疫球蛋白样结构域4。
6、在一些实施方式中，所述人免疫球蛋白的铰链-fc结构域为人igg1的铰链-fc结构域。
7、在一些实施方式中，其中人vegfr1的免疫球蛋白样结构域2包含或为：如seq idno.1或6所示的氨基酸序列，或与seq id no.1或6所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
8、在一些实施方式中，其中人vegfr2的免疫球蛋白样结构域3包含或为：如seq idno.2所示的氨基酸序列，或与seq id no.2所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
9、在一些实施方式中，其中人vegfr2的免疫球蛋白样结构域4包含或为：如seq idno.7所示的氨基酸序列，或与seq id no.7所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
10、在一些实施方式中，其中所述人免疫球蛋白的铰链-fc结构域包含或为：如seq idno.3或8所示的氨基酸序列，或与seq id no.3或8所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
11、在一些实施方式中，其中所述人vegf受体融合蛋白包含或为如：seq id no.5或9所示的氨基酸序列，或与seq id no.5或9所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
12、在一些实施方式中，其中所述表达盒包含：如seq id no.10或11所示的核苷酸序列，或它们任一个的简并序列。
13、在一些实施方式中，其中所述表达盒还包含位于编码所述人vegf受体融合蛋白的核苷酸序列的上游且与其可操作地连接的启动子，所述启动子优选选自巨细胞病毒(cmv)启动子、劳氏肉瘤病毒(rsv)启动子、mmt启动子、ef-1α启动子、u6启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、cag启动子、cba启动子、rpe65启动子、vmd2启动子、rpgr启动子、irbp启动子、hgrk1启动子、car启动子、rho启动子、grm6启动子、grk1启动子和gfap启动子。
14、在一些实施方式中，其中所述表达盒还包含位于编码所述人vegf受体融合蛋白的核苷酸序列的下游并与其可操作地连接的聚腺苷酸化信号，所述聚腺苷酸化信号优选选自sv40早期polya、sv40晚期polya、兔球珠蛋白polya、bgh polya和hsv tk polya。
15、在一些实施方式中，其中所述基因递送载体是(a)病毒载体，优选为慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘病毒、乳多空病毒、杆状病毒或乳头状瘤病毒，更优选为腺相关病毒或慢病毒；或(b)非病毒载体，优选为质粒、脂质体、纳米颗粒、聚合物、转座子、外泌体或细菌载体。
16、在一些实施方式中，所述载体是腺相关病毒载体，其包括：(a)重组腺相关病毒衣壳，和(b)包装在所述重组腺相关病毒衣壳内的所述核酸。
17、在一些实施方式中，其中所述重组腺相关病毒衣壳包含选自以下血清型的腺相关病毒的衣壳蛋白：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12和其杂合体，以及以上述衣壳蛋白为骨架改造的衣壳蛋白突变体；优选地，所述重组腺相关病毒衣壳包含选自aav1、aav2、aav5、aav7、aav8和其杂合体的腺相关病毒的衣壳蛋白。
18、在一些实施方式中，其中所述腺相关病毒载体的基因组是单链或双链形式，优选是scaav、ssaav或cceaav。
19、在一些实施方式中，提供一种重组腺相关病毒，包含：(a)raav衣壳；和(b)被包装在raav衣壳内的核酸，所述核酸在5’至3’顺序上包含：
20、(i)5’aav itr；(ii)启动子；(iii)编码本发明提供的人vegf受体融合蛋白的多核苷酸；(iv)polya；和(v)3’aav itr。
21、在一些实施方式中，所述raav衣壳包含aav1、aav2、aav5、aav7或aav8的衣壳蛋白，优选为aav8的衣壳蛋白。
22、在一些实施方式中，所述启动子为巨细胞病毒(cmv)启动子、ef-1α启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、grk1启动子或cag启动子，优选为cmv启动子。
23、在一些实施方式中，所述polya为sv40晚期polya或兔球珠蛋白polya，优选为sv40晚期polya。
24、在一些实施方式中，所述5’aav itr和/或3’aav itr选自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5和aav6的itr。
25、在一些实施方式中，本发明提供一种表达盒，其在5’至3’顺序上包含：(i)启动子；(ii)编码本发明提供的人vegf受体融合蛋白的多核苷酸；(iii)polya。
26、在一些实施方式中，所述启动子为巨细胞病毒(cmv)启动子、ef-1α启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、grk1启动子或cag启动子，优选为cmv启动子。
27、在一些实施方式中，所述polya为sv40晚期polya或兔球珠蛋白polya，优选为sv40晚期polya。
28、在一些实施方式中，在表达盒中，在所述启动子的5’端和所述polya的3’端分别包含5’aav itr和3’aav itr。
29、本发明的另一个方面提供一种人vegf受体融合蛋白，其包含人vegfr1的免疫球蛋白样结构域2、人vegfr2的免疫球蛋白样结构域3和人免疫球蛋白的铰链-fc结构域；并且所述人免疫球蛋白的铰链-fc结构域根据eu编号包含m252y、s254t和t256e取代。
30、在一些实施方式中，其中所述人vegf受体融合蛋白进一步包含人vegfr2的免疫球蛋白样结构域4；优选地，所述人vegfr2的免疫球蛋白样结构域4包含或为：如seq id no.7所示的氨基酸序列，或与seq id no.7所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
31、在一些实施方式中，其中所述人免疫球蛋白的铰链-fc结构域为人igg1的铰链-fc结构域；优选地，所述人igg1的铰链-fc结构域包含或为：如seq id no.3或8所示的氨基酸序列，或与seq id no.3或8所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
32、在一些实施方式中，所述人vegfr1的免疫球蛋白样结构域2包含或为：如seq idno.1或6所示的氨基酸序列，或与seq id no.1或6所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
33、在一些实施方式中，所述人vegfr2的免疫球蛋白样结构域3包含或为：如seq idno.2所示的氨基酸序列，或与seq id no.2所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
34、在一些实施方式中，其中所述人vegf受体融合蛋白包含或为如：seq id no.5或9所示的氨基酸序列，或与seq id no.5或9所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
35、在一些实施方式中，本发明提供编码任一所述人vegf受体融合蛋白的多核苷酸。优选地，所述多核苷酸包含或为：如seq id no.10或11所示的核苷酸序列，或它们任一个的简并序列。
36、在一些实施方式中，本发明提供包含所述多核苷酸的载体，优选是质粒；优选地，所述载体被构建以用于形成ssaav、scaav或cceaav。
37、在一些实施方式中，本发明提供包含所述载体的宿主细胞，优选是hek293细胞或sf9细胞。
38、本发明的其他方面和优势可从以下具体描述和实施例中看出。
1.基因递送载体，其包含核酸，所述核酸包含表达人vegf受体融合蛋白的表达盒，其中所述人vegf受体融合蛋白包含人vegfr1的免疫球蛋白样结构域2、人vegfr2的免疫球蛋白样结构域3和人免疫球蛋白的铰链-fc结构域；并且所述人免疫球蛋白的铰链-fc结构域根据eu编号包含m252y、s254t和t256e取代。
2.根据权利要求1所述的基因递送载体，其中所述人vegf受体融合蛋白进一步包含人vegfr2的免疫球蛋白样结构域4。
3.根据权利要求1或2所述的基因递送载体，其中所述人免疫球蛋白的铰链-fc结构域为人igg1的铰链-fc结构域。
4.根据权利要求1至3任一项所述的基因递送载体，其中人vegfr1的免疫球蛋白样结构域2包含或为：如seq id no.1或6所示的氨基酸序列，或与seq id no.1或6所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至4任一项所述的基因递送载体，其中人vegfr2的免疫球蛋白样结构域3包含或为：如seq id no.2所示的氨基酸序列，或与seq id no.2所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
6.根据权利要求1至5任一项所述的基因递送载体，其中人vegfr2的免疫球蛋白样结构域4包含或为：如seq id no.7所示的氨基酸序列，或与seq id no.7所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
7.根据权利要求1至6任一项所述的基因递送载体，其中所述人免疫球蛋白的铰链-fc结构域包含或为：如seq id no.3或8所示的氨基酸序列，或与seq id no.3或8所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的基因递送载体，其中所述人vegf受体融合蛋白包含或为如：seq id no.5或9所示的氨基酸序列，或与seq id no.5或9所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
9.根据权利要求8所述的基因递送载体，其中所述表达盒包含：如seq id no.10或11所示的核苷酸序列，或它们任一个的简并序列。
10.根据权利要求1至9任一项所述的基因递送载体，其中所述表达盒还包含位于编码所述人vegf受体融合蛋白的核苷酸序列的上游且与其可操作地连接的启动子，所述启动子优选选自巨细胞病毒(cmv)启动子、劳氏肉瘤病毒(rsv)启动子、mmt启动子、ef-1α启动子、u6启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、cag启动子、cba启动子、rpe65启动子、vmd2启动子、rpgr启动子、irbp启动子、hgrk1启动子、car启动子、rho启动子、grm6启动子、grk1启动子和gfap启动子。
11.根据权利要求1至10任一项所述的基因递送载体，其中所述表达盒还包含位于编码所述人vegf受体融合蛋白的核苷酸序列的下游并与其可操作地连接的聚腺苷酸化信号，所述聚腺苷酸化信号优选选自sv40早期polya、sv40晚期polya、兔球珠蛋白polya、bgh polya和hsv tk polya。
12.根据权利要求1至11任一项所述的基因递送载体，其中所述基因递送载体是
13.根据权利要求1至12任一项所述的基因递送载体，所述载体是腺相关病毒载体，其包括：(a)重组腺相关病毒衣壳，和(b)包装在所述重组腺相关病毒衣壳内的所述核酸。
14.根据权利要求13所述的基因递送载体，其中所述重组腺相关病毒衣壳包含选自以下血清型的腺相关病毒的衣壳蛋白：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12和其杂合体，以及以上述衣壳蛋白为骨架改造的衣壳蛋白突变体；优选地，所述重组腺相关病毒衣壳包含选自aav1、aav2、aav5、aav7、aav8和其杂合体的腺相关病毒的衣壳蛋白。
15.根据权利要求13或14所述的基因递送载体，其中所述腺相关病毒载体的基因组是单链或双链形式，优选为scaav、ssaav或cceaav。
16.一种药物组合物，其包含权利要求1至15任一项所述的基因递送载体；以及药学上可接受的辅料；优选地，所述药物组合物是注射剂。
17.权利要求1至15任一项所述的基因递送载体或权利要求16所述的药物组合物在制备用于治疗vegf导致的疾病的药物中的应用，优选地，vegf导致的疾病选自渗出性(湿性)老年黄斑变性(amd)、糖尿病视网膜病变(dr)合并黄斑水肿(dme)、视网膜静阻塞(rvo)合并黄斑水肿(me)、中心性渗出性脉络膜视网膜病变、息肉状脉络膜血管病变(pcv)、高度近视继发脉络膜新生血管病变以及继发的黄斑脉络膜新生血管(cnv)。
18.一种人vegf受体融合蛋白，其包含人vegfr1的免疫球蛋白样结构域2、人vegfr2的免疫球蛋白样结构域3和人免疫球蛋白的铰链-fc结构域；并且所述人免疫球蛋白的铰链-fc结构域根据eu编号包含m252y、s254t和t256e取代。
19.根据权利要求18所述的人vegf受体融合蛋白，其中所述人vegf受体融合蛋白进一步包含人vegfr2的免疫球蛋白样结构域4；优选地，所述人vegfr2的免疫球蛋白样结构域4包含或为：如seq id no.7所示的氨基酸序列，或与seq id no.7所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
20.根据权利要求18或19所述的人vegf受体融合蛋白，其中所述人免疫球蛋白的铰链-fc结构域为人igg1的铰链-fc结构域；优选地，所述人igg1的铰链-fc结构域包含或为：如seq id no.3或8所示的氨基酸序列，或与seq id no.3或8所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
21.根据权利要求18至20任一项所述的人vegf受体融合蛋白，其中：
22.根据权利要求18所述的人vegf受体融合蛋白，其中所述人vegf受体融合蛋白包含或为如：seq id no.5或9所示的氨基酸序列，或与seq id no.5或9所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
23.编码权利要求18至22任一项所述的人vegf受体融合蛋白的多核苷酸；优选地，所述多核苷酸包含或为：如seq id no.10或11所示的核苷酸序列，或它们任一个的简并序列。
24.包含权利要求23所述的多核苷酸的载体，优选是质粒；优选地，所述载体被构建以用于形成ssaav、scaav或cceaav。
25.包含权利要求24所述载体的宿主细胞，优选是hek293细胞或sf9细胞。
26.一种重组腺相关病毒，包含：
27.根据权利要求26所述的重组腺相关病毒，其中：
28.一种表达盒，其在5’至3’顺序上包含：(i)启动子；(ii)权利要求23所述的多核苷酸；(iii)polya。
29.根据权利要求28所述的表达盒，其中：
30.根据权利要求28或29所述的表达盒，其中在所述启动子的5’端和所述polya的3’端分别包含5’aav itr和3’aav itr。
