本发明涉及质粒提取及内毒素去除，更具体地说是涉及一种除内毒素质粒提取试剂盒及应用。
背景技术：
1、质粒是一种环状双链小分子dna，能够独立复制并稳定遗传，也是最常用的基因工程载体，质粒dna的提取和纯化是进行基因工程的重要前提，因此，高效快速地纯化质粒具有重要意义。目前实验室广泛使用的质粒分离的方法主要有硅基质膜吸附分离法和磁珠吸附法。硅基质膜吸附分离法提取的质粒纯度高，但需要经过多次离心，提取的质粒量少。磁珠法是以磁性纳米材料为基础发展的分离纯化新技术，它可以高效吸附dna，操作简单快速，适合大规模提取dna样本，配套自动化核酸提取仪能够实现核酸提取的自动化和高通量。
2、内毒素也称为脂多糖，是革兰氏阴性菌胞膜上的一种成分，其分子量、电荷性和疏水性都与质粒dna相似，当革兰氏阴性菌细胞裂解后，细胞壁表面的内毒素就会释放出来，进入溶液中，在提取质粒时就会与质粒混在一起被提取。内毒素会降低原代细胞和敏感培养细胞的转染效率，干扰免疫细胞的体外转染。
3、内毒素具有极强的热稳定性和化学稳定性，彻底灭活内毒素，需要250℃高温干烤1h或强酸、强碱浸泡4h以上。在医用领域中，通常是采用蒸馏+高温灭活法。但是，上述的技术手段，都会导致质粒变性失活。已报道的内毒素去除方法还有超速离心、乙醇分级沉淀、色谱层析、活性炭吸附、树脂吸附、tritonx-114萃取等。目前通常采用的去除质粒中内毒素的方法有tritonx-114雾点法和层析法，tritonx-114雾点法耗时长，所获质粒浓度低且会残留有毒性的tritonx-114；层析法去除内毒素的级别能达到临床级别，但成本较高，质粒浓度也较低。因此，有必要对现有技术进行改进和提高。
4、因此，如何在提取质粒时，有效去除内毒素是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明提供了一种双磁珠法除内毒素质粒提取试剂盒及应用。
2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
3、一种磁珠法除内毒素质粒提取试剂盒，包括：溶液i、溶液ii、溶液iii、磁珠液i、磁珠液ii、清洗液和洗脱液；
4、其中，溶液i包括：1～2％蔗糖、40～75mmol/l edta、25～50mmol/l tr is-hcl、0.5～1.0mol/l nacl，ph8.0；
5、溶液ii包括：0.1mol/l～0.3mol/l koh、体积百分比为0.08％～0.15％的s ds、0.02～0.1mol/l edta；
6、溶液iii包括：1～2mol/l乙酸钾、1～2mol/l乙酸纳、0.2～0.6mol/l海藻糖、ph5～5.6；
7、磁珠液i包括：0.5-1.0mol/l nacl、0.05-0.lmol/l柠檬酸钠、30～50mg/m l磁珠i，ph5.0～5.5；
8、磁珠液ii包括：1.2～1.8mol/l盐酸胍、0.01～0.05mol/l尿素、体积分数为20～30％无水乙醇体、体积分数为30～40％异丙醇、20～30mg/ml磁珠ii，ph值为5.5～6.5。
9、在上述技术方案中，所述磁珠i为以镍磁珠为载体，聚组氨酸为配基的磁性微球，粒径为0.5μm～1μm。
10、在上述技术方案中，所述磁珠液ii为单分散、超顺磁性羟基磁珠，粒径为200～500nm。
11、在上述技术方案中，清洗液为体积分数为60-75％的乙醇溶液；洗脱液为10-15mmol/l的tris-hcl，ph7.0～8.0。
12、作为与本发明相同的发明构思，本发明还请求保护所述的试剂盒在提取质粒并清除内毒素中的应用。
13、作为与本发明相同的发明构思，本发明还请求保护一种磁珠法除内毒素提取质粒的方法，包括以下步骤：
14、(1)将1％含质粒的大肠杆菌细胞于lb培养基，37℃振荡培养过夜；
15、(2)取1ml菌体于加入离心管中，以12000r/min离心30s，弃上清液；
16、(3)将上述离心回收的菌体重悬于0.lml溶液i中，剧烈振荡使其充分混合；
17、(4)加入0.2ml溶液ii，立刻轻轻翻转5～8次，直到溶液变得透明，室温静置2-3min；
18、(5)加入0.15ml溶液iii，立刻轻轻翻转混匀5～10次，直到白色絮状沉淀不再生成，室温静置1min；
19、(6)12000r/min离心5min，取上清液，将上清转移至新的离心管中；
20、(7)向装有上清的离心管中加入30μl磁珠液i，吹打混匀，室温放置2～3min，然后将离心管在磁力架上放置1～2min，磁分离至完全澄清，取上清液，将上清转移至新的离心管中；
21、(9)向离心管中加入100μl磁珠液ii，吹打混匀，室温放置2～3min，然后将离心管放到磁力架上，待磁珠完全吸到管壁后，用移液枪吸弃上清，从磁力架上取下离心管；
22、(10)向离心管加入1ml 70％乙醇，吹打混匀，将离心管放到磁力架上1min，使磁珠完全吸到管壁后，吸弃上清，从磁力架上取下离心管，室温干燥5～8min，直至离心管内没有液体残留；
23、(11)向离心管中加入50-100μl的te buffer用移液枪轻轻混匀，室温洗脱5min，然后置于磁力架上1～2min，待磁珠完全吸至离心管壁上后，小心吸取上清至新的离心管中，即获得质粒dna产物。
24、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明达到的技术效果是：
25、1)本发明采用的磁珠i以镍磁珠为载体，聚组氨酸为配基，磁珠i上的聚组氨酸结构单元中存在咪唑基团，其在低于等电点(ph6.5)下均带正电，内毒素pka值约为1.3，在磁珠液i提供的缓冲体系中，聚组氨酸磁珠能以静电作用与内毒素分子形成稳定的复合物，其吸附内毒素分子的过程似于絮凝过程，不吸附质粒dna，具有很好的特异性。同时，磁珠i生物相容性好，对细胞及人体无毒副作用，具有价格低廉、安全性好的优点。本发明系统考察了盐浓度、ph值、磁珠用量等因素对去除内毒素效果的影响，优化了除内毒素的条件，从而达到良好的内毒素去除效果，可直接从质粒粗体液中有效去除内毒素。
26、2)本发明溶液iii是乙酸钾、乙酸纳与海藻糖的合理复配体系，可快速中和裂解液，使质粒dna快速有效复性，同时，对样本中的蛋白质、细胞碎片、基因组dna的沉降解离具有优异的效果；溶液iii中加入了海藻糖，海藻酸不仅能有效保护离心获得的上清液(粗提液)中的质粒，还可阻止磁珠液i吸附内毒素的同时吸附质粒，避免质粒的损失，从而提高质粒得率，实现在温和的条件下对质粒中内毒素的去除处理，既不会损失太多质粒，又不会影响质粒的生物活性。
27、3)本发明采用双磁珠法分别实现内毒素的分离和质粒的提取。所述磁珠i能够特异吸附内毒素，从而将其去除；所述磁珠液ii中含有磁珠ii，用于结合质粒，配合本发明独有的缓冲液体系，制备的基于双磁珠法的无内毒素质粒dna提取试剂盒，具有便捷、低成本、安全性好的优势。本发明提供的试剂盒可在质粒抽提过程中去除内毒素，也可用于直接去除质粒中的内毒素，得到的质粒能满足酶切，测序，转染和病毒包装等分子生物学实验和细胞实验需求。同时，可实现无内毒素质粒提取的全自动化。
1.一种磁珠法除内毒素质粒提取试剂盒，其特征在于，包括：溶液i、溶液ii、溶液iii、磁珠液i、磁珠液ii、清洗液和洗脱液；
2.根据权利要求1所述的一种磁珠法除内毒素质粒提取试剂盒，其特征在于，所述磁珠i为以镍磁珠为载体，聚组氨酸为配基的磁性微球，粒径为0.5μm～1μm。
3.根据权利要求1所述的一种磁珠法除内毒素质粒提取试剂盒，其特征在于，所述磁珠液ii为单分散、超顺磁性羟基磁珠，粒径为200～500nm。
4.根据权利要求1所述的一种磁珠法除内毒素质粒提取试剂盒，其特征在于，清洗液为体积分数为60-75％的乙醇溶液；洗脱液为10-15mmol/l的tris-hcl，ph为7.0～8.0。
5.权利要求1-4任一所述的试剂盒在提取质粒并清除内毒素中的应用。
6.一种磁珠法除内毒素提取质粒的方法，其特征在于，包括以下步骤
