本公开内容一般性地涉及基于il2的治疗及其使用方法，并且更具体地涉及包含il2部分和与人pd-1特异性结合的抗原结合部分的融合蛋白及其使用方法。
背景技术：
1、白介素2(interleukin 2，il-2或il2)是主要由经活化t细胞产生的多能细胞因子(pluripotent cytokine)。其刺激t细胞的增殖和分化，诱导细胞毒性t淋巴细胞(cytotoxic t lymphocyte，ctl)的产生以及外周血淋巴细胞分化为细胞毒性细胞和淋巴因子活化的杀伤(lymphokine-activated killer，lak)细胞，促进通过t细胞的细胞因子和溶细胞性分子(cytolytic molecule)表达，促进b细胞的增殖和分化以及通过b细胞的免疫球蛋白合成，并且刺激自然杀伤(natural killer，nk)细胞的产生、增殖和活化(参见waldmann，2006，nat rev immunol 6：595-601和malek，2008，annu rev immunol 26：453-79)。il2参与外周cd4+cd25+调节t(treg)细胞的维持(参见例如，fontenot et al.，2005，nature immunol 6：1142-51)，其也称为抑制性t细胞。它们通过经由抑制t细胞辅助和活化的细胞间接触或者通过释放免疫抑制细胞因子(例如il-10或tgfβ)来抑制效应t细胞以免破坏其(自身)靶标。显示treg细胞的耗竭增强了il2诱导的抗肿瘤免疫(imai et al.，2007，cancer sci 98：416-23)。
2、然而，il2由于其多效性作用对于抑制肿瘤生长不是最佳的。il2作为抗肿瘤剂的使用已受到伴随着肿瘤响应所需剂量的严重毒性的限制。(由prometheuslaboratories，san diego，calif.销售)是il2的重组形式，其被批准用于治疗转移性黑素瘤和转移性肾癌，但其副作用非常严重以至于其仅被推荐在进入重症监护的医院环境中使用。il2治疗的主要副作用是血管渗漏综合征(vascular leak syndrome，vls)，其导致肺和肝中组织间液的累积，导致肺水肿和肝损伤。除停用il2之外没有用于vls的治疗。已显示出，il2诱导的肺水肿由il2与肺内皮细胞的直接结合导致，所述肺内皮细胞表达低至中等水平的功能性高亲和力il2受体(krieg et al.，2010，proc nat acad sci usa 107：11906-11)。尽管经开发用于癌症治疗的cd122定向il2治疗在该领域被普遍接受，但已出乎意料地发现这样的分子对于癌症治疗具有差的治疗指数，而需要高的毒性剂量以赋予适度的抗癌作用。
3、因此，本领域中迫切需要具有改善的治疗效力和安全性谱的新的il2治疗。
技术实现思路
1、本公开内容解决了上述需求中的一个或更多个。本公开内容的融合蛋白包含与人pd-1特异性结合的抗原结合部分，其靶向肿瘤反应性t细胞。抗原结合部分有助于选择性地重构对肿瘤反应性t细胞的活性。融合蛋白还包含il2部分，其中il2部分包含与il2rα结合的il2。在某些实施方案中，融合蛋白包含未经修饰的il2序列。在某些实施方案中，融合蛋白保留了与内源性il2rα接合的能力。融合蛋白包含反式隔离构象(trans-sequesteredconformation)的il2部分。这维持了与经活化cd8+t细胞的接合；然而，il2部分的结合构型有助于掩蔽il2并减弱其活性，因此导致降低的全身毒性。例如，与野生型il2相比，本公开内容的融合蛋白在小鼠中不诱导急性肺水肿(血管渗漏)。与单独的或跟pd-1抑制剂(例如，抗pd-1抗体或其抗原结合片段)组合的il2相比，本公开内容的融合蛋白提供增强的抗肿瘤效力和改善的治疗指数。
2、在一个方面中，所公开的技术涉及融合蛋白，其包含：(i)与人程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1，pd-1)特异性结合的抗原结合部分、和(ii)白介素2(il2)部分。在一些实施方案中，抗原结合部分包含与人pd-1特异性结合的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，与人pd-1结合的抗体或其抗原结合片段是人单克隆抗体。在一些实施方案中，抗原结合部分包含三个重链互补决定区(heavy chaincomplementarity determining region，hcdr)(hcdr1、hcdr2和hcdr3)和三个轻链cdr(lcdr1、lcdr2和lcdr3)，其中：hcdr1包含seq id no：43、4或24的氨基酸序列；hcdr2包含seq id no：45、6或26的氨基酸序列；hcdr3包含seq id no：47、8或28的氨基酸序列；lcdr1包含seq id no：12或32的氨基酸序列；lcdr2包含seq id no：14的氨基酸序列；并且lcdr3包含seq id no：16或35的氨基酸序列。
3、在一些实施方案中，抗原结合部分包含hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，其包含(i)seq id no：43、45、47、12、14和16；(ii)seq id no：4、6、8、12、14和16；或(iii)seq id no：24、26、28、32、14和35的相应氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原结合部分包含hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，其包含seq id no：43、45、47、12、14和16的相应氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原结合部分包含重链可变区(heavy chainvariable region，hcvr)和轻链可变区(light chain variable region，lcvr)，所述重链可变区包含seq id no：41、2或22的氨基酸序列；所述轻链可变区包含seq id no：10或30的氨基酸序列。在一些实施方案中，hcvr包含seq id no：2的氨基酸序列并且lcvr包含seq idno：10的氨基酸序列。在一些实施方案中，hcvr包含seq id no：22的氨基酸序列并且lcvr包含seq id no：30的氨基酸序列。在一些实施方案中，hcvr包含seq id no：41的氨基酸序列并且lcvr包含seq id no：10的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原结合部分包含seq idno：55的重链恒定区和seq id no：56的轻链恒定区。在一些实施方案中，抗原结合部分包含重链和轻链，其中重链包含seq id no：61、57或59的氨基酸序列并且轻链包含seq id no：62、58或60的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原结合部分包含seq id no：61/62、57/58或59/60的重链/轻链序列对。
4、在一些实施方案中，抗原结合部分包含seq id no：61/62的重链/轻链序列对。在一些实施方案中，il2部分包含(i)il2或其片段；和(ii)il2受体α(il2 receptor alpha，il2rα)或其片段。在一些实施方案中，il2或其片段是人il2(human il2，hil2)或其片段。在一些实施方案中，il2rα或其片段是人il2rα(human il2rα，hil2rα)或其片段。在一些实施方案中，il2或其片段包含seq id no：53的氨基酸序列。在一些实施方案中，il2rα或其片段包含seq id no：51的氨基酸序列。在一些实施方案中，il2或其片段通过接头与il2rα或其片段的c端连接。在一些实施方案中，il2部分通过接头与抗原结合部分的重链恒定区的c端连接。在一些实施方案中，接头包含一个或更多个重复的ggggs(seq id no：67)的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头包含seq id no：50或52的氨基酸序列。在一些实施方案中，il2部分包含seq id no：54的氨基酸序列。
5、在另一个方面中，所公开的技术涉及融合蛋白，所述融合蛋白包含：(i)第一多肽，其包含与人pd-1特异性结合的人抗体的轻链可变区(lcvr)；以及(ii)第二多肽，其包含(a)与人pd-1特异性结合的抗体的重链可变区(hcvr)和(b)il2部分。在一些实施方案中，hcvr包含三个重链互补决定区(hcdr)(hcdr1、hcdr2和hcdr3)并且lcvr包含三个轻链cdr(lcdr1、lcdr2和lcdr3)，其中：hcdr1包含seq id no：43、4或24的氨基酸序列；hcdr2包含seq id no：45、6或26的氨基酸序列；hcdr3包含seq id no：47、8或28的氨基酸序列；lcdr1包含seq id no：12或32的氨基酸序列；lcdr2包含seq id no：14的氨基酸序列；并且lcdr3包含seq id no：16或35的氨基酸序列。在一些实施方案中，hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3包含(i)seq id no：43、45、47、12、14和16；(ii)seq id no：4、6、8、12、14和16；或(iii)seq id no：24、26、28、32、14和35的氨基酸序列。在一些实施方案中，hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3分别包含seq id no：43、45、47、12、14和16的氨基酸序列。
6、在一些实施方案中，hcvr和lcvr包含(i)seq no：41和10；(ii)seq id no：2和10；或(iii)seq id no：22和30的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一多肽包含与lcvr连接的轻链恒定区。在一些实施方案中，轻链恒定区包含seq id no：56的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与hcvr连接的重链恒定区，并且其中il2部分与重链恒定区的c端连接。在一些实施方案中，重链恒定区包含seq id no：55的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一多肽包含seq id no：62、58或60的轻链序列。在一些实施方案中，第二多肽包含seq idno：61、57或59的重链序列。
7、在一些实施方案中，融合蛋白包含seq id no：61/62、57/58或59/60的重链/轻链序列对。在一些实施方案中，融合蛋白包含seq id no：61/62的重链/轻链序列对。在一些实施方案中，il2部分包含(i)il2或其片段；和(ii)il2rα或其片段。在一些实施方案中，il2部分通过接头与重链恒定区的c端连接。在一些实施方案中，il2或其片段通过接头与il2rα或其片段的c端连接。在一些实施方案中，il2或其片段是人il2(hil2)或其片段。在一些实施方案中，il2rα或其片段是人il2rα(hil2rα)或其片段。在一些实施方案中，il2或其片段包含seq id no：53的氨基酸序列。在一些实施方案中，il2rα或其片段包含seq id no：51的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头包含一个或更多个重复的ggggs(seq id no：67)的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头包含seq id no：50或52的氨基酸序列。在一些实施方案中，il2部分包含seq id no：54的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一多肽包含seq idno：62、58或60的氨基酸序列。
8、在一些实施方案中，第二多肽包含seq id no：63、64或65的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一多肽包含seq id no：58的氨基酸序列并且第二多肽包含seq id no：64的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一多肽包含seq id no：60的氨基酸序列并且第二多肽包含seq id no：63的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一多肽包含seq id no：62的氨基酸序列并且第二多肽包含seq id no：65的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合蛋白形成二聚体融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白通过其相应的重链恒定区进行二聚化。
9、在一些实施方案中，融合蛋白不与regn2810、派姆单抗(pembrolizumab)或纳武单抗(nivolumab)交叉竞争与pd-1的结合。在一些实施方案中，与il2相比，融合蛋白表现出在激活人il2rα/β/γ和il2rβ/γ复合物方面降低的活性。在一些实施方案中，与非靶向il2rα-il2相比，融合蛋白表现出在激活人il2rα方面提高的活性。在一些实施方案中，与野生型人il2相比，融合蛋白表现出在刺激t细胞方面提高的活性，其通过ifn-γ释放水平来测量。在一些实施方案中，融合蛋白表现出减弱的与il2rα、il2rβ和il2rγ的结合。
10、在另一个方面中，所公开的技术涉及核酸或多种核酸，其包含编码本文中公开的融合蛋白的多核苷酸序列。在另一个方面中，所公开的技术涉及载体，其包含本文中公开的核酸或多种核酸。在另一个方面中，所公开的技术涉及宿主细胞，其包含本文中公开的核酸或多种核酸或者载体。在一些实施方案中，宿主细胞表达第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码本文中公开的融合蛋白的第一多肽的多核苷酸序列，所述第二载体包含编码本文中公开的融合蛋白的第二多肽的多核苷酸序列。
11、在另一个方面中，所公开的技术涉及产生本文中公开的融合蛋白的方法，其包括在允许产生融合蛋白或片段的条件下培养本文中公开的宿主细胞，并回收如此产生的融合蛋白或其片段。
12、在另一个方面中，所公开的技术涉及药物组合物，其包含本文中公开的融合蛋白。在一些实施方案中，药物组合物还包含抗pd-1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗pd-1抗体或其抗原结合片段不与融合蛋白交叉竞争与pd-1的结合。
13、在另一个方面中，所公开的技术涉及治疗癌症的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的本文中公开的融合蛋白或药物组合物。在一些实施方案中，所述方法包括以0.005mg/kg至10mg/kg对象体重的量向对象施用融合蛋白。在一些实施方案中，所述方法还包括向对象施用第二治疗剂或治疗。
1.融合蛋白，其包含：(i)与人程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)特异性结合的抗原结合部分、和(ii)白介素2(il2)部分。
2.权利要求1所述的融合蛋白，其中所述抗原结合部分包含与人pd-1特异性结合的抗体或其抗原结合片段。
3.权利要求2所述的融合蛋白，其中所述与人pd-1结合的抗体或其抗原结合片段是人单克隆抗体。
4.权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗原结合部分包含三个重链互补决定区(hcdr)(hcdr1、hcdr2和hcdr3)和三个轻链cdr(lcdr1、lcdr2和lcdr3)，其中：
5.权利要求4所述的融合蛋白，其中所述抗原结合部分包含hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，其包含(i)seq id no：43、45、47、12、14和16；(ii)seq id no：4、6、8、12、14和16；或(iii)seq id no：24、26、28、32、14和35的相应氨基酸序列。
6.权利要求4或5所述的融合蛋白，其中所述抗原结合部分包含hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，其包含seq id no：43、45、47、12、14和16的相应氨基酸序列。
7.权利要求1至6中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗原结合部分包含重链可变区(hcvr)和轻链可变区(lcvr)，所述重链可变区(hcvr)包含seq id no：41、2或22的氨基酸序列，所述轻链可变区(lcvr)包含seq id no：10或30的氨基酸序列。
8.权利要求7所述的融合蛋白，其中所述hcvr包含seq id no：2的氨基酸序列并且所述lcvr包含seq id no：10的氨基酸序列。
9.权利要求7所述的融合蛋白，其中所述hcvr包含seq id no：22的氨基酸序列并且所述lcvr包含seq id no：30的氨基酸序列。
10.权利要求7所述的融合蛋白，其中所述hcvr包含seq id no：41的氨基酸序列并且所述lcvr包含seq id no：10的氨基酸序列。
11.权利要求1至10中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗原结合部分包含seq id no：55的重链恒定区和seq id no：56的轻链恒定区。
12.权利要求1至11中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗原结合部分包含重链和轻链，其中所述重链包含seq id no：61、57或59的氨基酸序列并且所述轻链包含seq id no：62、58或60的氨基酸序列。
13.权利要求1至12中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗原结合部分包含seq id no：61/62、57/58或59/60的重链/轻链序列对。
14.权利要求1至13中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗原结合部分包含seq id no：61/62的重链/轻链序列对。
15.权利要求1至14中任一项所述的融合蛋白，其中所述il2部分包含(i)il2或其片段；和(ii)il2受体α(il2rα)或其片段。
16.权利要求15所述的融合蛋白，其中所述il2或其片段是人il2(hil2)或其片段。
17.权利要求16所述的融合蛋白，其中所述il2rα或其片段是人il2rα(hil2rα)或其片段。
18.权利要求15至17中任一项所述的融合蛋白，其中所述il2或其片段包含seq id no：53的氨基酸序列。
19.权利要求15至17中任一项所述的融合蛋白，其中所述il2rα或其片段包含seq idno：51的氨基酸序列。
20.权利要求15至19中任一项所述的融合蛋白，其中所述il2或其片段通过接头与所述il2rα或其片段的c端连接。
21.权利要求1至20中任一项所述的融合蛋白，其中所述il2部分通过接头与所述抗原结合部分的重链恒定区的c端连接。
22.权利要求20或21所述的融合蛋白，其中所述接头包含一个或更多个重复的ggggs(seq id no：67)的氨基酸序列。
23.权利要求20至22中任一项所述的融合蛋白，其中所述接头包含seq id no：50或52的氨基酸序列。
24.权利要求1至23中任一项所述的融合蛋白，其中所述il2部分包含seq id no：54的氨基酸序列。
25.融合蛋白，所述融合蛋白包含：(i)第一多肽，其包含与人pd-1特异性结合的人抗体的轻链可变区(lcvr)；以及(ii)第二多肽，其包含(a)与人pd-1特异性结合的抗体的重链可变区(hcvr)和(b)il2部分。
26.权利要求25所述的融合蛋白，其中所述hcvr包含三个重链互补决定区(hcdr)(hcdr1、hcdr2和hcdr3)并且所述lcvr包含三个轻链cdr(lcdr1、lcdr2和lcdr3)，其中：
27.权利要求26所述的融合蛋白，其中所述hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3包含(i)seq id no：43、45、47、12、14和16；(ii)seq id no：4、6、8、12、14和16；或(iii)seqid no：24、26、28、32、14和35的氨基酸序列。
28.权利要求26或27所述的融合蛋白，其中所述hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3分别包含seq id no：43、45、47、12、14和16的氨基酸序列。
29.权利要求25至28中任一项所述的融合蛋白，其中所述hcvr和所述lcvr包含(i)seqno：41和10；(ii)seq id no：2和10；或(iii)seq id no：22和30的氨基酸序列。
30.权利要求25至29中任一项所述的融合蛋白，其中所述第一多肽包含与所述lcvr连接的轻链恒定区。
31.权利要求30所述的融合蛋白，其中所述轻链恒定区包含seq id no：56的氨基酸序列。
32.权利要求25至31中任一项所述的融合蛋白，其中所述第二多肽包含与所述hcvr连接的重链恒定区，并且其中所述il2部分与所述重链恒定区的c端连接。
33.权利要求32所述的融合蛋白，其中所述重链恒定区包含seq id no：55的氨基酸序列。
34.权利要求25至33中任一项所述的融合蛋白，其中所述第一多肽包含seq id no：62、58或60的轻链序列。
35.权利要求25至34中任一项所述的融合蛋白，其中所述第二多肽包含seq id no：61、57或59的重链序列。
36.权利要求25至35中任一项所述的融合蛋白，其包含seq id no：61/62、57/58或59/60的重链/轻链序列对。
37.权利要求25至36中任一项所述的融合蛋白，其包含seq id no：61/62的重链/轻链序列对。
38.权利要求25至37中任一项所述的融合蛋白，其中所述il2部分包含(i)il2或其片段；和(ii)il2rα或其片段。
39.权利要求25至38中任一项所述的融合蛋白，其中所述il2部分通过接头与所述重链恒定区的c端连接。
40.权利要求38或39所述的融合蛋白，其中所述il2或其片段通过接头与il2rα或其片段的c端连接。
41.权利要求38至40中任一项所述的融合蛋白，其中所述il2或其片段是人il2(hil2)或其片段。
42.权利要求38至41中任一项所述的融合蛋白，其中所述il2rα或其片段是人il2rα(hil2rα)或其片段。
43.权利要求38至42中任一项所述的融合蛋白，其中所述il2或其片段包含seq id no：53的氨基酸序列。
44.权利要求38至43中任一项所述的融合蛋白，其中所述il2rα或其片段包含seq idno：51的氨基酸序列。
45.权利要求40至44中任一项所述的融合蛋白，其中所述接头包含一个或更多个重复的ggggs(seq id no：67)的氨基酸序列。
46.权利要求45所述的融合蛋白，其中所述接头包含seq id no：50或52的氨基酸序列。
47.权利要求25至46中任一项所述的融合蛋白，其中所述il2部分包含seq id no：54的氨基酸序列。
48.权利要求25至47中任一项所述的融合蛋白，其中所述第一多肽包含seq id no：62、58或60的氨基酸序列。
49.权利要求25至48中任一项所述的融合蛋白，其中所述第二多肽包含seq id no：63、64或65的氨基酸序列。
50.权利要求25至49中任一项所述的融合蛋白，其中所述第一多肽包含seq id no：58的氨基酸序列并且所述第二多肽包含seq id no：64的氨基酸序列。
51.权利要求25至49中任一项所述的融合蛋白，其中所述第一多肽包含seq id no：60的氨基酸序列并且所述第二多肽包含seq id no：63的氨基酸序列。
52.权利要求25至49中任一项所述的融合蛋白，其中所述第一多肽包含seq id no：62的氨基酸序列并且所述第二多肽包含seq id no：65的氨基酸序列。
53.权利要求1至52中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白形成二聚体融合蛋白。
54.权利要求1至53中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白通过其相应的重链恒定区进行二聚化。
55.权利要求1至54中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白不与regn2810、派姆单抗或纳武单抗交叉竞争与pd-1的结合。
56.权利要求1至55中任一项所述的融合蛋白，其中与il2相比，所述融合蛋白表现出在激活人il2rα/β/γ和il2rβ/γ复合物方面降低的活性。
57.权利要求1至56中任一项所述的融合蛋白，其中与非靶向il2rα-il2相比，所述融合蛋白表现出在激活人il2rα方面提高的活性。
58.权利要求1至57中任一项所述的融合蛋白，其中与野生型人il2相比，所述融合蛋白表现出在刺激t细胞方面提高的活性，其通过ifn-γ释放水平来测量。
59.权利要求1至58中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白表现出减弱的与il2rα、il2rβ和il2rγ的结合。
60.核酸或多种核酸，其包含编码权利要求1至59中任一项所述的融合蛋白的多核苷酸序列。
61.载体，其包含权利要求60所述的核酸或多种核酸。
62.宿主细胞，其包含权利要求60所述的核酸或多种核酸或者权利要求61所述的载体。
63.权利要求62所述的宿主细胞，其表达第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码权利要求25至59中任一项中所示的融合蛋白的第一多肽的多核苷酸序列，所述第二载体包含编码权利要求25至59中任一项中所示的融合蛋白的第二多肽的多核酸序列。
64.产生权利要求1至59中任一项所述的融合蛋白的方法，其包括在允许产生所述融合蛋白或片段的条件下培养权利要求62或63所述的宿主细胞，并回收如此产生的所述融合蛋白或其片段。
65.药物组合物，其包含权利要求1至59中任一项所述的融合蛋白。
66.权利要求65所述的药物组合物，其还包含抗pd-1抗体或其抗原结合片段。
67.权利要求66所述的药物组合物，其中所述抗pd-1抗体或其抗原结合片段不与所述融合蛋白交叉竞争与pd-1的结合。
68.治疗癌症的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的权利要求1至59中任一项所述的融合蛋白或权利要求65至67中任一项所述的药物组合物。
69.权利要求68所述的方法，其包括以0.005mg/kg至10mg/kg对象体重的量向所述对象施用所述融合蛋白。
70.权利要求68或69所述的方法，其还包括向所述对象施用第二治疗剂或治疗。
