背景技术：
1、依赖性细小病毒，例如腺相关依赖性细小病毒，例如腺相关病毒(aav)，作为用于将各种有效载荷递送至细胞(包括在人类受试者中)的载体而受到关注。
技术实现思路
1、本公开部分提供了改进的变体依赖性细小病毒衣壳蛋白(例如aav2)、如vp1，产生依赖性细小病毒的方法，用于其的组合物，以及由其产生的病毒颗粒。在一些实施例中，与衣壳蛋白中没有突变的病毒颗粒相比，所产生的病毒颗粒具有增加的眼部转导。
2、在一些实施例中，本公开部分地涉及包含编码如本文所提供的变体衣壳蛋白的序列的核酸。在一些实施例中，依赖性细小病毒是腺相关依赖性细小病毒(aav)。在一些实施例中，aav是aav2。
3、在一些实施例中，本公开部分地涉及本文所述的衣壳多肽。
4、在一些实施例中，本公开部分地涉及包含本文所述的核酸的依赖性细小病毒颗粒。
5、在一些实施例中，本公开部分地涉及包含本文所述的核酸的载体，例如质粒。
6、在一些实施例中，本公开部分地涉及包含本文所述的核酸(例如，包含编码衣壳多肽，如vp1的序列的核酸)的依赖性细小病毒颗粒，其中编码序列包含如本文所提供的改变或突变。
7、在一些实施例中，本公开部分地涉及包含变体衣壳多肽的依赖性细小病毒颗粒，该变体衣壳多肽包含与以下项的vp1、vp2或vp3序列具有至少85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或100％同一性的多肽：seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq idno:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq idno:30、seq id no:31、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:34、seq id no:35、seq idno:36、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:41、seq idno:42、seq id no:43、seq id no:44、seq id no:45或seq id no:46。
8、在一些实施例中，变体衣壳多肽包含选自与var-1至var-2中任一者相关的突变的突变，以及选自与var-3至var-16中任一者相关的突变的突变；选自与var-1至var-2中任一者相关的突变的突变，以及选自与var-17至var-45中任一者相关的突变的突变；或者选自与var-3至var-16中任一者相关的突变的突变，以及选自与var-17至var-45中任一者相关的突变的突变。
9、在一些实施例中，本公开部分地涉及核酸分子，该核酸分子包含seq id no:47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90或91，其片段，或其与其具有至少85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％序列同一性的变体。
10、在一些实施例中，本公开部分地涉及包含本文所述的核酸(例如包含编码衣壳多肽(例如vp1多肽)的序列的核酸)的载体，其中编码序列包含如本文所提供的改变或突变。
11、在一些实施例中，本公开部分地涉及细胞、无细胞体系或其他翻译体系，其包含本文所述的核酸或载体，该核酸或载体例如包含编码衣壳多肽(如vp1)的序列，其中衣壳多肽编码序列在编码序列中包含如本文所提供的改变或突变。在一些实施例中，细胞、无细胞体系或其他翻译体系包含本文所述的依赖性细小病毒颗粒，例如，其中该颗粒包含核酸，该核酸包含编码衣壳多肽(如vp1多肽)的序列，其中编码序列包含如本文所提供的改变或突变。
12、在一些实施例中，本公开部分地涉及包含本文所述的多肽的细胞、无细胞体系或其他翻译体系，其中多肽编码序列包含如本文所提供的改变或突变。在一些实施例中，细胞、无细胞体系或其他翻译体系包含本文所述的依赖性细小病毒颗粒，例如，其中该颗粒包含核酸，该核酸包含编码vp1多肽的序列，其中vp1编码序列包含如本文所提供的相应的改变或突变。
13、在一些实施例中，本公开部分地涉及一种将有效载荷递送至细胞的方法，该方法包括使细胞与包含本文所述的核酸的依赖性细小病毒颗粒接触。在一些实施例中，本公开部分地涉及一种将有效载荷递送至细胞的方法，该方法包括使细胞与包含本文所述的衣壳多肽的依赖性细小病毒颗粒接触。
14、在一些实施例中，本公开部分地涉及一种制备依赖性细小病毒颗粒的方法，该方法包括：提供细胞、无细胞体系或其他翻译体系，其包含本文所述的核酸(例如，包含编码如本文所提供的aav2衣壳变体的序列的核酸)；以及在适合于产生依赖性细小病毒颗粒的条件下培养细胞、无细胞体系或其他翻译体系，从而制备依赖性细小病毒颗粒。在一些实施例中，本公开部分地涉及一种制备本文所述的依赖性细小病毒颗粒的方法。
15、在一些实施例中，本公开部分地涉及一种制备依赖性细小病毒颗粒的方法，该方法包括：提供细胞、无细胞体系或其他翻译体系，其包含本文所述的多肽；以及在适合于产生依赖性细小病毒颗粒的条件下培养细胞、无细胞体系或其他翻译体系，从而制备依赖性细小病毒颗粒。在一些实施例中，本公开部分地涉及一种制备本文所述的依赖性细小病毒颗粒的方法。
16、在一些实施例中，本公开部分地涉及在细胞、无细胞体系或其他翻译体系中制备的依赖性细小病毒颗粒，其中该细胞、无细胞体系或其他翻译体系包含编码依赖性细小病毒的核酸，该依赖性细小病毒包含如本文所提供的衣壳变体。
17、在一些实施例中，本公开部分地涉及一种治疗受试者的疾病或病症的方法，该方法包括以有效治疗疾病或病症的量向受试者施用本文所述的依赖性细小病毒颗粒。
18、进一步参考以下编号的实施例描述本发明。
1.一种变体衣壳多肽，其包含与以下项的vp1、vp2或vp3序列具有至少85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或100％同一性的多肽：seq id no:37、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seqid no:10、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seqid no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seqid no:21、seq id no:22、seqid no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seqid no:29、seq id no:30、seq id no:31、seqid no:32、seq id no:33、seq id no:34、seqid no:35、seq id no:36、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:41、seqid no:42、seq id no:43、seqid no:44、seq id no:45或seq id no:46。
2.根据权利要求1所述的变体衣壳多肽，其中所述多肽包含：
3.根据权利要求2所述的变体衣壳多肽，其中：
4.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述多肽包含seq id no:1的变体，其中所述变体衣壳多肽包含选自与var-1至var-2中任一者相关的突变以及与var-3至var-16中任一者相关的突变的突变。
5.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述多肽包含seq id no:1的变体，其中所述变体衣壳多肽包含选自与var-1至var-2中任一者相关的突变以及与var-17至var-45中任一者相关的突变的突变。
6.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述多肽包含seq id no:1的变体，其中所述变体衣壳多肽包含选自与var-3至var-16中任一者相关的突变以及与var-17至var-45中任一者相关的突变的突变。
7.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述多肽包含seq id no:1的变体，其中所述变体衣壳多肽包含对应于以下项的突变：根据seq id no:1的位置3、6、11、12、14、15、19、21、23、24、25、29、31、33、446、449、450、451、452、454、455、456、457、458、459、460、461、464、552、554、555、556、557、558、559、561、566、575、578、580、581、585、586、587、588、589、590、591、593、594、597或600处的突变，位置446与447、447与448、448与449、449与450、451与452、453与454、581与582、583与584、584与585、585与586、586与587、587与588、588与589、589与590、590与591、591与592、或592与593之间的插入，任选地其中所述突变包括插入、缺失或取代。
8.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述多肽包含seq id no:1的变体，其中所述变体衣壳多肽包含对应于在根据seq id no:1的位置3、6、11、12、14、15、19、21、23、24、25、29、31、33或其任意组合处的突变的突变，并且其中所述突变包括缺失或取代。
9.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述多肽包含seq id no:1的变体，其中所述变体衣壳多肽包含对应于以下项的突变：根据seq id no:1的位置446、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、464或其任意组合处的突变，位置446与447、447与448、448与449、449与450、451与452、453与454或其任意组合之间的插入，并且其中所述突变包括插入、缺失或取代。
10.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述多肽包含seq id no:1的变体，其中所述变体衣壳多肽包含对应于以下项的突变：根据seq id no:1的位置552、554、555、556、557、558、559、561、566、575、578、580、581、585、586、587、588、589、590、591、593、594、597、600或其任意组合处的突变，位置583与584、584与585、585与586、586与587、587与588、588与589、589与590、590与591、591与592、592与593或其任意组合之间的插入，并且其中所述突变包括插入、缺失或取代。
11.一种变体衣壳多肽，其包含seq id no:1的变体，所述变体包含选自与var-3至var-16中任一者相关的突变的突变，其中所述突变为
12.一种变体衣壳多肽，其包含seq id no:1的变体，所述变体包含选自与var-3至var-16中任一者相关的突变的突变，其中所述突变在与seq id no:1相比的位置552与588之间，并且其中所述突变包括：
13.一种变体衣壳多肽，其包含seq id no:1的变体，所述变体包含选自与var-17至var-45中任一者相关的突变的突变，其中：
14.一种变体衣壳多肽，其包含seq id no:1的变体，所述变体进一步包含选自与var-17至var-45中任一者相关的突变的突变，其中所述突变在与seq id no:1相比的位置575与588之间，并且其中所述突变包括：
15.一种变体衣壳多肽，其包含seq id no:1的变体，所述变体进一步包含选自与var-17至var-45中任一者相关的突变的突变，其中所述突变在与seq id no:1相比的位置552与588之间，并且其中
16.一种变体衣壳多肽，其包含seq id no:1的变体，所述变体包含突变，其中所述突变在与seq id no:1相比的位置584与617之间，并且其中所述突变包括：
17.根据权利要求17所述的变体衣壳多肽，其中所述插入包含7至10个氨基酸并且与lalgettrpa(seq id no:93)具有至少60％、70％、80％、90％或100％同一性或包含lalgettrpa(seq id no:93)的至少4个、至少5个、至少6个或至少7个氨基酸的片段，例如包含lgettrp(seq id no:94)。
18.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中：
19.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述衣壳多肽包含插入，例如1个或多个氨基酸，例如1至10个氨基酸，例如2至8个氨基酸，例如3至7个氨基酸，例如7个氨基酸的插入，所述插入对应于在与seq id no:1相比的位置446与447、447与448、448与449、449与450、451与452、453与454、581与582、583与584、584与585、585与586、586与587、587与588、588与589、589与590、590与591、591与592或592与593之间的插入。
20.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中：
21.一种变体衣壳多肽，其包含：(a)以下中任一者的多肽：seq id no:37、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seqid no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seqid no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seqid no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seqid no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:31、seq id no:32、seqid no:33、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:38、seq id no:39、seqid no:40、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:43、seq id no:44、seq id no:45或seq id no:46；(b)包含以下中任一者的vp2或vp3序列：seq id no:37、seq id no:2、seqid no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq idno:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq idno:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq idno:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq idno:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:31、seq id no:32、seq idno:33、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:38、seq id no:39、seq idno:40、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:43、seq id no:44、seq id no:45或seqid no:46；(c)含有与其具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列的多肽，其中相对于seq id no:1，所述序列包含与seq id no:2至seqid no:46中任一者相关的突变差异中的至少一者(例如一者、两者、三者或更多者，例如全部)；或(d)相对于(a)或(b)的所述多肽，具有至少1个但不超过20个、不超过19个、不超过18个、不超过17个、不超过16个、不超过15个、不超过14个、不超过13个、不超过12个、不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过3个或不超过2个氨基酸突变的多肽，其中相对于seq id no:1，所述多肽包含与seq id no:2至seq id no:46中任一者相关的突变差异中的至少一者(例如，一者、两者、三者或更多者，例如全部)。
22.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述变体衣壳多肽为vp1多肽、vp2多肽或vp3多肽。
23.一种变体衣壳多肽，其包含与在对应于seq id no:1的554的位置处的亮氨酸对应的突变(例如，包含与seq id no:1相比的i554l)。
24.根据权利要求22所述或前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中：
25.根据权利要求22所述或前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其进一步包含：
26.一种变体衣壳多肽，其包含与在对应于seq id no:1的559的位置处的亮氨酸对应的突变(例如，包含与seq id no:1相比的i559l)。
27.根据权利要求26所述或前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中：
28.根据权利要求26所述或前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其进一步包含与在对应于seq id no:1的561的位置处的丝氨酸对应的突变(例如，包含与seq id no:1相比的d561s)，任选地其中衣壳多肽进一步包含在对应于seq id no:1的581的位置处的天冬氨酸(例如，包含与seq id no:1相比的t581d)。
29.一种变体衣壳多肽，其包含与在对应于seq id no:1的556的位置处的天冬酰胺对应的突变(例如，包含与seq id no:1相比的k556n)。
30.根据权利要求29所述或前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中：
31.一种变体衣壳多肽，其包含与在对应于seq id no:1的561的位置处的丝氨酸对应的突变(例如，包含与seq id no:1相比的d561s)。
32.根据权利要求31所述或前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中：
33.根据权利要求31所述或前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其进一步包含与在对应于seq id no:1的581的位置处的天冬氨酸对应的突变(例如，包含与seq idno:1相比的t581d)。
34.一种衣壳多肽，其包含在对应于seq id no:1的587的位置处的突变，任选地其中所述突变为至丙氨酸(例如，其中所述突变为根据seq id no:1的n587a)，任选地其中所述衣壳多肽进一步包含在根据seq id no:1的580与587之间(任选地586与587之间)的两个相邻氨基酸之间的插入(例如，4个或更多个氨基酸的插入，任选地7个或更多个氨基酸的插入，任选地7至10个氨基酸的插入，任选地7、8或9个氨基酸的插入)。
35.一种核酸分子，其包含编码根据权利要求1至34中任一项所述的变体衣壳多肽的序列。
36.根据权利要求35所述的核酸分子，其包含与编码所述变体衣壳多肽的所述序列可操作地连接的一个或多个调控元件。
37.根据权利要求35至36中任一项所述的核酸分子，其包含seq id no:47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91，或其片段，或其与其具有至少85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％序列同一性的变体。
38.一种病毒颗粒(例如，腺相关病毒(“aav”)颗粒)，其包含根据权利要求1至34中任一项所述的变体衣壳多肽或包含由根据权利要求35至37中任一项所述的核酸分子编码的变体衣壳多肽。
39.根据权利要求38所述的病毒颗粒，其包含含有异源转基因和一个或多个调控元件的核酸。
40.根据权利要求38至39中任一项所述的病毒颗粒，其包含根据权利要求1至34中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述病毒颗粒、或包含所述变体衣壳多肽的病毒颗粒、或包含由根据权利要求35至37中任一项所述的核酸分子编码的变体衣壳多肽的病毒颗粒相对于野生型aav2(例如，包含seq id no:1的或由seq id no:92编码的衣壳多肽的病毒颗粒)表现出增加的眼部转导，例如，如在小鼠或在nhp中测量的，例如，如本文所述。
41.根据权利要求35至37中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子是双链或单链的，任选地其中所述核酸分子是线性或环状的，例如其中所述核酸分子为质粒。
42.一种产生包含变体aav2衣壳多肽的病毒颗粒的方法，所述方法包括将根据权利要求35至37或41中任一项所述的核酸分子引入细胞(例如hek293细胞)中，以及从中收获所述病毒颗粒。
43.一种将有效载荷(例如，核酸)递送至细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与依赖性细小病毒颗粒接触，所述依赖性细小病毒颗粒包含根据权利要求1至34中任一项所述的变体衣壳多肽或根据权利要求38至40中任一项所述的病毒颗粒以及有效载荷。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述细胞为眼部细胞，并且其中所述眼部细胞位于视网膜、黄斑或小梁网中。
45.一种将有效载荷(例如，核酸)递送至受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含根据权利要求1至34中任一项所述的变体衣壳多肽以及所述有效载荷的依赖性细小病毒颗粒，或向所述受试者施用根据权利要求38至40中任一项所述的病毒颗粒。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述颗粒将所述有效载荷递送至眼睛，并且其中所述颗粒将所述有效载荷递送至视网膜、黄斑或小梁网。
47.根据权利要求45至46中任一项所述的方法，其中所述颗粒与包含seq id no:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，在所述眼睛的一个或多个区域中以增加的转导将所述有效载荷递送至所述眼睛，并且其中所述眼睛的所述一个或多个区域选自视网膜、黄斑、小梁网或其任意组合。
48.根据权利要求1至34中任一项所述的变体衣壳多肽、根据权利要求38至40中任一项所述的病毒颗粒或根据权利要求42至47中任一项所述的方法，其中所述颗粒(例如，包含所述变体衣壳多肽的颗粒)与包含seq id no:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，在所述眼睛的一个或多个区域中以增加的转导将所述有效载荷递送至所述眼睛，并且其中与包含seqidno:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，转导的增加是至少2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍或150倍。
49.根据权利要求1至34中任一项所述的变体衣壳多肽、根据权利要求38至40中任一项所述的病毒颗粒或根据权利要求42至47中任一项所述的方法，其中所述颗粒(例如，包含所述变体衣壳多肽的颗粒)与包含seq id no:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，在所述眼睛的一个或多个区域中以增加的转导特异性将所述有效载荷递送至所述眼睛，其中转导的增加是：
50.根据权利要求1至34中任一项所述的变体衣壳多肽、根据权利要求38至40中任一项所述的病毒颗粒或根据权利要求42至47中任一项所述的方法，其中所述颗粒(例如，包含所述变体衣壳多肽的颗粒)与包含seq id no:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，在所述眼睛的一个或多个区域中以增加的转导特异性将所述有效载荷递送至所述眼睛，与包含seq id no:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，在所述眼睛的一个或多个区域中没有增加的生物分布。
51.根据权利要求43至50中任一项所述的方法，其中向所述受试者的施用是经由玻璃体内注射或前房内注射进行的。
52.一种治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括以有效治疗所述疾病或病症的量向所述受试者施用依赖性细小病毒颗粒，其中所述依赖性细小病毒颗粒是包含根据权利要求1至34和48至50中任一项所述的或由根据权利要求35至37或41中任一项所述的核酸编码的衣壳多肽的颗粒，或是根据权利要求38至40中任一项所述的病毒颗粒。
53.一种细胞、无细胞体系或其他翻译体系，其包含根据权利要求1至41或48至50中任一项所述的衣壳多肽、核酸分子或病毒颗粒。
54.一种制备依赖性细小病毒(例如，腺相关依赖性细小病毒(aav)颗粒的方法，所述方法包括：
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述细胞、无细胞体系或其他翻译体系包含第二核酸分子，并且所述第二核酸分子被包装在所述依赖性细小病毒颗粒中，并且其中所述第二核酸包含有效载荷，例如，编码治疗产品的异源核酸序列。
56.根据权利要求54至55中任一项所述的方法，其中根据权利要求35至37或41中任一项所述的核酸介导依赖性细小病毒颗粒的产生，所述依赖性细小病毒颗粒不包含根据权利要求35至37或41中任一项所述的核酸。
57.根据权利要求54至56中任一项所述的方法，其中根据权利要求35至37或41中任一项所述的核酸相比seq id no:92的核酸介导的生产水平以至少10％、至少20％、至少50％、至少100％、至少200％或更高的水平介导依赖性细小病毒颗粒的产生。
58.一种组合物，例如药物组合物，其包含根据权利要求38至40中任一项所述的病毒颗粒或通过根据权利要求126或150至154中任一项所述的方法产生的病毒颗粒，以及药学上可接受的载体。
59.根据权利要求1至34和48至50中任一项所述的变体衣壳多肽、根据权利要求35至37或41中任一项所述的核酸分子、或根据权利要求38至40中任一项所述的病毒颗粒，其用于治疗受试者的疾病或病症。
60.根据权利要求1至34和48至50中任一项所述的变体衣壳多肽、根据权利要求35至37或41中任一项所述的核酸分子、或根据权利要求38至40中任一项所述的病毒颗粒，其用于制造用于治疗受试者的疾病或病症的药物。
